CN114885833A - 一种杨树2n花粉的诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种杨树2n花粉的诱导方法，属于杨树多倍体育种领域。本发明采用赤霉素为诱导剂诱导杨树2n花粉并对诱导时期以及诱导次数等显著影响诱导效果的有关参数进行了优化筛选，2n花粉比率达到21％。相较于现有技术的高温和秋水仙碱诱导方法，本发明采用赤霉素为诱导剂相对安全无毒害、价格低廉；采用赤霉素诱导的杨树能够获得正常散出的花粉且花粉活力高，适用于培育多倍体的杂交授粉。本发明对于丰富林木多倍体诱导理论，构建高效的杨树多倍体育种技术体系具有理论和实践意义。

Description

一种杨树2n花粉的诱导方法
技术领域
本发明涉及一种2n花粉的诱导方法，尤其涉及杨树(Populus species)2n花粉的诱导方法，属于杨树多倍体育种领域。
背景技术
在植物界中存在着天然2n配子，但天然2n配子的发生频率一般较低，难以满足植物多倍体育种的要求。为了获得高频率的2n配子，可以利用诱变剂进行人工诱导而获得，人工诱导2n配子的方法包括物理方法和化学方法。
高温处理作为一种常见的物理诱导方法，目前已成功应用于诱导杨树(Populusspp.)(耿喜宁，任勇谕，韩志强，杜康，康向阳.高温诱导大孢子染色体加倍选育毛白杨杂种三倍体.北京林业大学学报，2018，40(11)：12-18；康宁，白凤莹，张平冬，康向阳.高温诱导胚囊染色体加倍获得毛白杨杂种三倍体.北京林业大学学报，2015，37(02)：79-86)、杜仲(Eucommia ulmoides)(Li Y.et al.Induction of unreduced megaspores in Eucommiaulmoides by high temperature treatment during megasporogenesis.Euphytica,2016,212(3):515-524)、桉树(Eucalyptus)(杨珺.桉树生殖生物学基础与染色体加倍技术研究.北京：北京林业大学，2015)等树种的大孢子、胚囊以及合子染色体加倍选育多倍体的育种实践，获得了大量的毛白杨(Populus tomentosa)(耿喜宁，任勇谕，韩志强，杜康，康向阳.高温诱导大孢子染色体加倍选育毛白杨杂种三倍体.北京林业大学学报，2018，40(11)：12-18；康宁，白凤莹，张平冬，康向阳.高温诱导胚囊染色体加倍获得毛白杨杂种三倍体.北京林业大学学报，2015，37(02)：79-86)、‘折引3号’杨(Populus pseudo-simonⅡ×P.nigra‘Zheyin3#’)(王君.青杨派树种多倍体诱导技术研究.北京：北京林业大学，2009)、毛新杨(Populus tomentosa×P.bolleana)以及银腺杨(Populus alba×P.glandulosa)(李云，朱之悌，田砚亭，张志毅，康向阳.极端温度处理白杨雌花芽培育三倍体植株的研究.北京林业大学学报，2000(05)：7-12)等杂种三倍体。高温也曾用于诱导毛新杨(康向阳，朱之悌，张志毅.高温诱导白杨2n花粉有效处理时期的研究.北京林业大学学报，2000，22(3)：1-4)、响叶杨(Populus adenopoda)(鲁敏.响叶杨三倍体和四倍体诱导技术研究.北京：北京林业大学,2013)、银白杨(Populus alba)(张磊，王君，索玉静等.高温诱导银白杨花粉染色体加倍研究.核农学报，2010，24(6)：1158-1165)及银灰杨(Populus canescens)(田梦迪,李燕杰,张平冬等.高温诱导银灰杨花粉染色体加倍创制杂种三倍体.林业科学，2018，54(03)：39-47)的花粉染色体加倍研究，获得了60.0％-80.0％的高频率2n花粉。但研究表明，高温诱导获得的2n配子均为SDR型，其遗传亲本的杂合性仅为FDR型2n配子的一半，因此严重限制了高温诱导2n花粉在杨树多倍体育种中的应用。
秋水仙碱作为一种重要的化学诱变剂，已成功应用于诱导林木大孢子、胚囊、合子以及体细胞染色体加倍选育多倍体的育种实践，获得了数以百计的杨树(李云，朱之悌，田砚亭等.秋水仙碱处理白杨雌花芽培育三倍体植株的研究.林业科学，2001，37(5)：68-74；康向阳，张平冬，高鹏等.秋水仙碱诱导白杨三倍体新途径的发现.北京林业大学学报，2004，26(1)：1-4)、刺槐(Robinia pseudoacacia)(Ewald D,Ulrich K,Naujoks G,etal.Induction of tetraploid poplar and black locust plants using colchicine:chloroplast number as an early marker for selecting polyploids in vitro.PlantCell Tissue and Organ Culture,2009,99(3):353-357)、杜仲(张焕玲，李俊红，李周歧.秋水仙素处理杜仲种子诱导多倍体的研究.西北林学院学报，2008，23(1)：78-81)、尾叶桉(Eucalyptus urophylla)(Yang J,Wang J,Liu Z,et al.Megaspore chromosomedoubling in Eucalyptus urophylla S.T.Blake induced by colchicine treatmenttoproduce triploids.Forests,2018,9(11):728.https://doi.org/10.3390/f9110728)等林木三倍体与四倍体新种质。秋水仙碱也曾用于诱导杨树(Zhao C G,Tian M D,Li Y,etal.Slow-growing pollen-tube of colchicine-induced 2n pollen responsible forlow triploid production rate in Populus.Euphytica,2017,213(4):94.https://doi.org/10.1007/s10681-017-1881-9；Tian M D,Zhang Y,Liu Y,et al.Hightemperature exposure did not affect induced 2n pollen viability inPopulus.Plant Cell&Environment,2018,41(6):1383-1393)，杜仲(高鹏.杜仲配子与合子染色体加倍技术研究.北京：北京林业大学，2006)以及桉树(Yang J,Yao P Q,Li Y,etal.Induction of 2n pollen with colchicine during microsporogenesis inEucalyptus.Euphytica,2016,210(1):69-78)等树种的花粉染色体加倍研究，获得了20.0％-88.0％的2n花粉。但是，秋水仙碱具有剧毒性和价格昂贵的缺陷，容易导致加倍处理操作人员中毒。
赤霉素(gibberellins，GA3)是一类重要的内源植物激素，具有调控细胞分化、种子萌发、叶片扩展、毛状体发育、花粉成熟以及开花转换等方面的功能(Claeys H,De BodtS,InzéD.Gibberellins and DELLAs:central nodes in growth regulatorynetworks.Trends in Plant Science,2014,19:231-239；Davière J M,Achard P.Apivotal role of DELLAs in regulating multiple hormone signals.MolecularPlant,2016,9:10-20；Debeaujon I,Koornneef M.Gibberellin requirement forArabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics andembryonic abscisic acid.Plant Physiology,2000,122:415-424；Xia X C,Hu Q Q,LiW,et al.Cotton(Gossypium hirsutum)JAZ3 and SLR1function in jasmonate andgibberellin mediated epidermal cell differentiation and elongation.PlantCell,Tissue and Organ Culture,2018,133:249-262)。赤霉素还是一种非生物逆境应激信号分子，水稻冷胁迫时，通过降低内源赤霉素水平以抑制根系生长并阻滞花粉发育(Sakata T,Oda S,Tsunaga Y,et al.Reduction of gibberellin by low temperaturedisrupts pollen development in rice.Plant Physiology,2014,164:2011-2019)。此外，赤霉素能够调节拟南芥(Arabidopsis thaliana)小孢子发生和花粉发育(PlackettAR,Ferguson AC,Powers S J,et al.DELLA activity is required for successfulpollen development in the Columbia ecotype of Arabidopsis.New Phytologist,2014,201:825-836)。与其它诱导剂相比，赤霉素相对安全无毒害、价格低廉。然而，赤霉素作为诱导剂能否影响杨树小孢子的发生发育，尚未见任何文献报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种想对安全且成本低的杨树2n花粉的诱导方法，该方法可获得高频率的2n花粉，采用所诱导的2n花粉杂交能够获得多倍体杨树植株。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：
一种杨树2n花粉的诱导方法，包括：以赤霉素为诱导剂诱导处理杨树雄花芽。
本发明一种优选的具体实施方案，为了实现更好的诱导效果，采用浓度为1-100μmol/L赤霉素为诱导剂诱导处理杨树雄花芽，更优选的，采用10μmol/L的赤霉素为诱导剂进行诱导处理能够获得较高频率的杨树2n花粉。
本发明中所述的赤霉素优选为GA3(sigma Gibberellic acid)。
本发明一种优选的具体实施方案，所述的诱导处理方式可以采用包括注射处理的方式将赤霉素注射到杨树的雄花芽中以诱导2n花粉的产生；所述注射处理的次数至少为1次以上，优选为3-10次，最优选为7次；其中，针对每次注射的时间间隔，本领域技术人员可根据杨树花粉母细胞减数分裂时期的进程进行适当的调整，只要每个处理组合的注射次数在相应减数分裂时期内完成即可，本领域技术人员可以根据实际情况确定或调整每次注射的时间间隔，均不影响本发明的实现。
作为一种参考的具体实施方式，在进行注射处理时可以采用医用注射器将赤霉素溶液注射到杨树的雄花芽中，譬如可以选用1mL医用一次性注射器将赤霉素溶液注射到杨树的雄花芽中。
作为本发明一种优选的具体实施方案，当杨树雄花芽中花粉母细胞的发育阶段处于终变期至后期Ⅱ这一时期内以赤霉素为诱导剂诱导处理杨树雄花芽能够获得较高频率的2n花粉；所述的花粉母细胞的发育阶段处于终变期至后期Ⅱ这一时期依次包括终变期、中期Ⅰ、后期Ⅰ、前期Ⅱ、中期Ⅱ和后期Ⅱ；其中，当大部分花粉母细胞发育处于前期Ⅱ这一时期利用赤霉素对雄花芽进行注射处理能够获得高频率的2n花粉。
作为本发明一种优选的具体实施方案，本发明中所述的杨树雄花芽可以是将冬季采集的杨树雄花枝在温室中进行水培的杨树雄花枝上的雄花芽；譬如，可以在当年的12月至次年的1月采集杨树的雄花枝，其中，所采集的杨树的雄花枝的长度优选为70-90cm，将所采集的雄花枝在室温(10-25℃)的条件下进行水培，杨树的雄花枝浸入水中的高度优选为30-40cm；水培期间，每两天换一次水，保持花枝下部培养用水清洁；以赤霉素为诱导剂诱导处理杨树雄花芽后继续水培花枝，直至花粉散出，收集不同处理组合的花粉。
本发明中所述的杨树包括但不限于新疆杨(Populus bolleana)、银灰杨(Populuscanescens)、毛新杨(Populus tomentosa×Populus bolleana)、银腺杨(Populustomentosa×Populus bolleana)、响叶杨(Populus adenopoda)、银白杨(Populus alba)或毛白杨(Populus tomentosa)中的任何一种，优选为新疆杨(Populus albavar.pyramidalis Bge)。
本发明将当年冬季采集的新疆杨雄花枝水培于10-20℃的温室，当花粉母细胞进入终变期、中期Ⅰ、后期Ⅰ、前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ时期时，各自利用浓度为10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L的赤霉素对雄花芽分别进行3次、5次、7次注射处理。处理结束后，新疆杨雄花枝继续水培于温室至花药完全开裂并散粉，分不同处理组合收集花粉，计算2n花粉诱导率，采用SPSS统计软件对数据进行显著性分析和多重比较，筛选出赤霉素处理适宜的浓度、减数分裂时期、处理次数；不同处理组合2n花粉诱导率的方差分析结果表明，减数分裂时期、处理次数对新疆杨2n花粉诱导率具有极显著影响，赤霉素浓度对2n花粉诱导率的影响不显著。处理时期和处理次数的多重比较结果表明，前期Ⅱ的2n花粉诱导率显著高于其他时期；赤霉素注射7次的2n花粉诱导率显著高于3次和5次；其中以10μmol/L的赤霉素于前期Ⅱ注射处理7次的效果最好，平均2n花粉诱导率达到(21.37±1.89)％；以10μmol/L的赤霉素于终变期注射处理3次的效果最差，平均2n花粉诱导率仅为(1.89±0.20)％。因此，当杨树的花粉母细胞发育至前期Ⅱ时，以10μmol/L的赤霉素进行7次注射处理是诱导杨树花粉染色体加倍的最佳处理组合。
本发明采用赤霉素为诱导剂诱导杨树2n花粉，极大地提高了新疆杨2n花粉的比率，2n花粉率达到21％。相较于现有技术的高温和秋水仙碱诱导方法，采用赤霉素为诱导剂相对安全无毒害、价格低廉且诱导效果好；赤霉素诱导的杨树能够获得正常散出的花粉且花粉活力高，适用于培育多倍体的杂交授粉。本发明对于丰富林木多倍体诱导理论，构建高效的林木多倍体育种技术体系等具有重要的理论和实践意义。
附图说明
图1新疆杨花粉经2％的醋酸洋红染色后在光学显微镜下进行花粉粒镜检结果；(a)对照组中的天然2n花粉(箭头)；(b)赤霉素诱导2n型花粉(箭头)；比例尺＝20.0μm。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1赤霉素诱导新疆杨产生2n花粉
1.材料与方法
1.1材料
冬季落叶后，从内蒙古自治区呼和浩特市采集花芽饱满的新疆杨(Populusbolleana)雄花枝，塑料布包裹后运输至温室待用。
1.2赤霉素诱导新疆杨花粉染色体加倍的技术条件优化
将新疆杨雄花枝水培于10-20℃的温室，每隔2h，随机采集2-3个花芽，经卡诺固定液固定后，利用醋酸洋红压片法观察花芽减数分裂进程。当观察到大部分花粉母细胞进入终变期、中期Ⅰ、后期Ⅰ、前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ时期，利用浓度为0μmol/L、10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L的赤霉素对雄花芽分别进行3次、5次、7次注射处理。每次用针管注射赤霉素溶液至有水珠溢出花芽表面，并对各处理组合进行编号记录。
1.3花粉收集
将处理后的雄花枝继续水培于温室，2-3d换一次水。待花药成熟开裂后，分别收集不同处理的花粉，储存于10mL的离心管内，放入适量硅胶，并做好标记，用保鲜膜密封，置于-20℃冰箱内保存待用。
1.4 2n花粉发生频率的统计
用镊子夹取少量不同处理组合的花粉，均匀地洒在滴有醋酸洋红的载玻片上制作临时涂片，在Olympus BX-51光学显微镜下随机选取5个视野观察并进行拍照，进一步利用Image J软件测量花粉粒直径。以对照组花粉粒平均直径的1.28倍作为判别2n花粉的标准(Zhang P D,and Kang X Y.Occurrence and cytological mechanism of numericallyunreduced pollen in diploid Populus euphratica.Silvae Genet.2013,62(6):285-291)，统计每个视野中总花粉粒数与2n花粉粒的数量，以2n花粉占花粉粒总数的百分比作为2n花粉发生频率，计算出不同处理组合的2n花粉发生频率。试验重复3次，每次重复测量200-300个花粉粒。
1.5数据分析
2n花粉诱导率等百分比数据先经反正弦变换后，利用SPSS统计软件进行差异显著性分析和多重比较。
2.实验结果
2.1新疆杨2n花粉的赤霉素诱导
新疆杨雄花芽经不同浓度的赤霉素注射处理后水培于温室，直至花药成熟开裂，收集到一定量的花粉。通过花粉粒形态比较可以发现，新疆杨对照组中存在少量的天然2n花粉(图1a)，其发生频率为0.18％-0.66％(表1)。不同赤霉素处理组合中，可观察到不同比例的2n花粉(图1b)。
从表1可以看出，不同处理组合的2n花粉诱导率存在明显的差异，其中以10μmol/L的赤霉素于前期Ⅱ注射处理7次的效果最好，平均2n花粉诱导率达到(21.37±1.89)％；以10μmol/L的赤霉素于终变期注射处理3次的效果最差，平均2n花粉诱导率仅为(1.89±0.20)％。不同处理组合2n花粉诱导率的方差分析结果表明(表2)，减数分裂时期(F＝41.882，P<0.001)、处理次数(F＝172.466，P<0.001)对新疆杨2n花粉诱导率具有极显著影响；赤霉素浓度(F＝1.391，P＝0.253)对2n花粉诱导率的影响不显著。处理时期和处理次数的多重比较结果表明(表3)，前期Ⅱ的2n花粉诱导率显著高于其他时期；赤霉素注射7次的2n花粉诱导率显著高于3次和5次。因此，当花粉母细胞发育至前期Ⅱ时，以10μmol/L的赤霉素进行7次注射处理是诱导新疆杨花粉染色体加倍的最佳处理组合。
表1赤霉素注射处理诱导新疆杨2n花粉
Figure BDA0003622019680000111
Figure BDA0003622019680000121
表2新疆杨2n花粉诱导率的方差分析
Figure BDA0003622019680000122
注：**代表差异极显著(P<0.01)。
表3不同减数分裂时期和不同注射次数新疆杨2n花粉诱导率的多重比较
Figure BDA0003622019680000131
注：不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

Claims (10)

1.一种杨树(Populus species)2n花粉的诱导方法，其特征在于，包括：以赤霉素为诱导剂诱导处理杨树雄花芽。
2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，采用浓度为1-100μmol/L赤霉素为诱导剂诱导处理杨树雄花芽；优选的，采用浓度为10μmol/L的赤霉素为诱导剂诱导处理杨树雄花芽。
3.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的赤霉素为GA3。
4.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的诱导处理方式采用包括注射处理的方式将赤霉素注射到杨树的雄花芽中诱导2n花粉的产生。
5.根据权利要求4所述的诱导方法，其特征在于，所述注射处理的次数为1次以上，优选为3-10次，最优选为7次。
6.根据权利要求4所述的诱导方法，其特征在于，所述的注射处理是采用注射器将赤霉素溶液注射到杨树的雄花芽中。
7.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，当杨树雄花芽中花粉母细胞的发育阶段处于终变期至后期Ⅱ这一时期内，以赤霉素为诱导剂诱导处理杨树雄花芽；其中，所述的花粉母细胞的发育阶段处于终变期至后期Ⅱ这一时期依次包括终变期、中期Ⅰ、后期Ⅰ、前期Ⅱ、中期Ⅱ和后期Ⅱ；优选的，当大部分花粉母细胞发育处于前期Ⅱ时，将赤霉素溶液注射进入雄花芽中。
8.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的杨树雄花芽是将冬季采集的杨树雄花枝在温室中室温的条件下进行水培的杨树雄花枝上的雄花芽；以赤霉素为诱导剂诱导处理杨树雄花芽后继续水培花枝，直至花粉散出，收集不同处理组合的花粉。
9.根据权利要求8所述的诱导方法，其特征在于，在当年的12月至次年的1月采集长度为70-90cm的杨树的雄花枝，将所采集的雄花枝在10-25℃的室温条件下进行水培，其中，杨树的雄花枝浸入水中的高度为30-40cm；水培期间，每两天换一次水，保持花枝下部培养用水清洁。
10.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的杨树包括但不限于新疆杨(Populus bolleana)、银灰杨(Populus canescens)、毛新杨(Populus tomentosa×Populus bolleana)、银腺杨(Populus tomentosa×Populus bolleana)、响叶杨(Populusadenopoda)、银白杨(Populus alba)或毛白杨(Populus tomentosa)。
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