CN105112517A - 一种鉴别玉米单倍体幼胚的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别玉米单倍体幼胚的方法及其应用。本发明的方法包括如下步骤：用玉米单倍体诱导系作为父本给母本授粉，授粉后取幼穗进行剥胚，得到玉米幼胚；将所述玉米幼胚在培养基中培养，从所述玉米幼胚中选取没有显色的玉米单倍体幼胚，得到玉米单倍体幼胚，所述玉米单倍体诱导系含有A1A2C1C2R1-nj标记。通过实验证明：本发明的方法可在玉米幼胚时期实现单倍体的鉴别，并且准确率高，挑选速度快，比常规籽粒成熟时期单倍体挑选提前30-35天，解决了单倍体鉴别耗时长的问题，丰富了单倍体鉴别的方法，缩短育种时间，使单倍体育种技术的大规模应用途径更加多样化，加速单倍体育种工程化进程。

Description

一种鉴别玉米单倍体幼胚的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别玉米单倍体幼胚的方法及其应用。

背景技术

玉米是一种利用杂种优势的模式作物，玉米育种过程中最为关键的环节是纯系选育。常规玉米自交系的选育需要经过多代的自交选择，因此选育一个品种往往需要数年的时间；而且理论上讲，即使自交n(n∝∞)代，基因型也不能达到100％的完全纯合状态。利用孤雌生殖诱导系诱导产生单倍体并进行人工加倍，只需两代就可以得到100％纯合的自交系，与常规方法相比不仅大大缩短育种进程，而且节约大量的人力、物力和财力。

单倍体育种的首要步骤是单倍体的鉴别，因此单倍体鉴别技术在玉米单倍体育种中具有很重要的地位。目前，国内外对玉米单倍体的鉴别进行了大量的研究，主要从单倍体植株形态学水平以及成熟籽粒性状对单倍体进行鉴别，另外也有通过观察籽粒染色体数目、DNA含量、分子标记等细胞生物学及分子生物学水平进行单倍体鉴别。对玉米单倍体的形态学进行鉴别研究，主要基于R1-nj基因的遗传标记法，基于R1-nj基因的遗传标记法是目前应用最为广泛的鉴定方法。该方法主要利用了A1A2C1C2BP1R1-nj显性遗传标记系统。在A1、A2或C2基因的存在下，R1-nj基因导致胚乳糊粉层和胚中盾片附着紫色。Nanda和Chase(1966)首次利用了该颜色标记系统去鉴别单倍体，用含有R1-nj基因的玉米单倍体诱导系授粉，在诱导系授粉杂交的果穗中，杂合二倍体由于R1-nj基因在胚和胚乳中同时表达而表现为胚和胚乳糊粉层均为紫色，单倍体由于孤雌生殖表现为胚乳糊粉层为紫色，胚为无色。通过观察玉米成熟籽粒胚和胚乳颜色情况，即可将单倍体挑选出来。根据单倍体植株形态学鉴别单倍体目前广泛采用的方法是利用B1和Pl1基因可以在植株茎秆表达的特点，将A1A2C1C2R1-nj标记系统下挑选的拟单倍体种植于田间，在幼苗期植株表现为紫色的确定为杂株，植株表现为绿色的确定为单倍体，但是B1和Pl1这些基因也会受到环境因素诸如光照和温度的影响而影响鉴定的准确性(Chaikam和Prasanna,2012)。目前选育的单倍体诱导系均含有A1A2C1C2R1-nj遗传标记，有些诱导系还含有B1和Pl1基因。

通过R1-nj基因在成熟籽粒的表达情况或者田间植株形态等单倍体鉴别方式周期长，工作量大，浪费大量人力、物力、财力。从分子水平鉴别单倍体，过程繁杂，价格昂贵，不适合高通量鉴别，因而不能广泛应用到生产实践当中去。因此探索一种高效的玉米单倍体鉴别方法对玉米育种同样具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是单倍体育种过程中单倍体鉴别工作量大、准确率低和鉴别时期晚的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种玉米单倍体幼胚的鉴别方法。

本发明提供的玉米单倍体幼胚的鉴别方法包括如下步骤：用玉米单倍体诱导系作为父本给母本授粉，授粉后取幼穗进行剥胚，得到玉米幼胚；将所述玉米幼胚在培养基中培养，从所述玉米幼胚中选取没有显色的玉米幼胚，得到玉米单倍体幼胚；

所述玉米单倍体诱导系含有A1A2C1C2R1-nj标记。

上述方法中，所述培养的条件为光照培养48h；所述光照的强度为25000lx；所述光照的周期为24h/天。

上述方法中，所述剥胚为取长为2.0-4.0mm的玉米幼胚的幼穗进行剥胚。

上述方法中，所述培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质在所述培养基中的浓度：MS盐3.0-4.5g/L、蔗糖30-60g/L、琼脂7.5g/L。

上述方法中，所述培养基的pH为7-9。

上述方法中，所述溶质在所述培养基中的浓度：MS盐3.0g/L、蔗糖40g/L、琼脂7.5g/L。

上述方法中，所述培养基的pH为7。

上述方法中，所述培养的温度为26-30℃；所述培养的湿度为60％。

上述方法中，从所述玉米幼胚中选取没有显色的玉米幼胚为选取玉米幼胚盾片部位无色的幼胚，得到玉米单倍体幼胚。

上述方法中，所述玉米单倍体诱导系为农大高诱1号、农大高诱2号、农大高诱3号、农大高诱4号、农大高诱5号或农大高油高诱3号。

上述方法中，所述母本为郑单958、先玉335、郑58或Mo17。

上述方法在培育玉米单倍体植株中的应用也属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育玉米单倍体植株的方法。

本发明提供的培育玉米单倍体植株的方法包括如下步骤，将上述方法得到的单倍体幼胚再生培养，得到植株，根据株型和/或茎秆颜色选取玉米单倍体植株。

上述方法中，所述根据株型和/或茎秆颜色选取玉米单倍体植株的方法为：当玉米单倍体诱导系植株颜色为紫色时，根据植株茎秆颜色选取玉米单倍体植株：紫色为杂合二倍体植株，而无色为单倍体植株；当玉米单倍体诱导系植株颜色为无色时，根据植株株型选取玉米单倍体植株：植株高大或叶片披散为杂合二倍体植株，而植株矮小或叶片上冲为单倍体植株。

上述方法中，所述诱导系植株颜色为紫色的诱导系为CAUHOI、CAU2、CAU3或CAU4；

所述诱导系植株颜色为无色的诱导系为CAU5或CHOI3。

上述方法中，所述再生培养的培养基的制备方法：每升再生培养基中含有MS盐1.5g，蔗糖30g，待溶解后定容至1L，调节pH值至7，倒入三角瓶中，加7.5g琼脂。

通过实验证明：本发明的鉴别单倍体幼胚的方法可在玉米幼胚时期实现单倍体的鉴别，并且准确率高，挑选速度快，比常规籽粒成熟时期单倍体挑选提前30-35天，解决了单倍体鉴别耗时长的问题，丰富了单倍体鉴别的方法，缩短育种时间，使单倍体育种技术的大规模应用途径更加多样化，加速单倍体育种工程化进程。

附图说明

图1为连续培养48h幼胚显色情况。

图2为培养时间过长，幼胚生根发芽。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

玉米(ZeamaysL.)杂交种郑单958和先玉335为下述实施例中的母本，是北京德农种业有限公司的产品。

郑58和Mo17均为优良自交系，均在文献“董昕(2014)；玉米单倍体诱导基因qhir1精细定位与新型诱导系选育研究，博士论文”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

玉米单倍体诱导系农大高诱1号(CAUHOI)、玉米单倍体诱导系农大高诱2号(CAU2)、玉米单倍体诱导系农大高诱3号(CAU3)、玉米单倍体诱导系农大高诱4号(CAU4)和玉米单倍体诱导系农大高诱5号(CAU5)均为下述实施例中的父本，均含有A1A2C1C2R1-nj标记，均在文献“Dong,X.,etal.(2014)."Marker-assistedselectionandevaluationofhighoilinvivohaploidinducersinmaize."MolecularBreeding34(3):1147-1158.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

玉米单倍体诱导系农大高油高诱3号(CHOI3)为下述实施例中的父本，含有A1A2C1C2R1-nj标记，在文献“董昕，2014，玉米单倍体诱导基因qhir1精细定位与新型诱导系选育研究”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

基本MS培养基的制备方法：每升基本MS培养基中含有MS盐3.0g，蔗糖30g，待溶解后定容至1L，调节pH值至5.8，倒入三角瓶中，加7.5g琼脂。

MS培养基的制备方法：将基本MS培养基中的蔗糖变为40g，使蔗糖在所述MS培养基中的浓度为40g/L，且调节pH值至7，且其他物质和浓度保持不变的基本MS培养基。

再生培养基的制备方法：每升再生培养基中含有MS盐1.5g，蔗糖30g，待溶解后定容至1L，调节pH值至7，倒入三角瓶中，加7.5g琼脂。

MS盐是上海宇涵生物科技有限公司的产品，产品目录号为140225。

实施例1、玉米单倍体幼胚的鉴别方法

一、杂交子代幼胚的获得

1、杂交

(1)杂交亲本

以郑单958为母本，诱导系CAU3为父本，杂交，得到杂交子代；

以郑58为母本，诱导系CAU3为父本，杂交，得到杂交子代。

(2)杂交具体方法

田间种植玉米单倍体诱导系CAU3(父本)、郑58(母本)及郑单958(母本)，待母本花丝吐出之前，对其进行去雄、雌穗套袋处理；花丝吐出后，同一时间剪花丝，第二天统一授粉，授粉后12天，得到胚长为2.0-4.0mm的杂交子代。

2、玉米幼胚的获得

取胚长为2.0-4.0mm的杂交子代的幼穗，第二天剥胚(幼穗取回后可暂放于4℃，但不宜太久)，得到玉米幼胚。剥胚的具体步骤如下：将干净无虫害的幼穗去除苞叶，摘去花丝，75％酒精短暂消毒后放入超净工作台。置于事先准备好的次氯酸钠溶液(利用灭菌去离子水配制2％次氯酸钠溶液，滴加两滴吐温80)中进行表面消毒20min。期间将玉米搅动2-3次，消毒更彻底。消毒完成后拿出，放置片刻，控水后即可开始剥胚。所剥取的玉米幼胚，具有一片较大的子叶，即盾片，呈弧形隆起；近轴侧，面平，有较小的胚体，由胚芽、胚轴和胚根组成。

二、玉米幼胚的培养及拟单倍体幼胚的鉴别

将步骤一剥离的玉米幼胚在MS培养基的培养皿中培养，将培养皿封口，放置光照培养箱中，每天24小时光照，连续培养48h。

培养24h后，一部分幼胚胚面显现紫色，随着培养时间的不断增加，显色幼胚数目不断增多，并且胚面颜色加深，持续培养48h后，显色幼胚数目趋于稳定，由于杂交子代中有杂合形式也有单倍体形式，此时即可根据幼胚胚面颜色表达差异鉴别出拟单倍体。

鉴别的方法如下：由于杂合二倍体含有来自父本的A1A2C1C2R1-nj基因，故在胚部盾片可清晰看到紫色色素表达，而拟单倍体幼胚不含父本的显性基因，故胚部盾片无色，在转入再生培养基再生前，通过胚部盾片有无色即可淘汰绝大部分杂合二倍体，剩余极少数杂合体，可在后期田间管理时，根据植株表型形态或茎秆颜色再进行鉴别。

三、单倍体植株的鉴别

将挑选出的胚面无色的拟单倍体幼胚转移至再生培养基再生，持续培养过程中，培养约10-14天后，幼苗两叶一心时，及时移至培养瓶中，培养瓶中为MS基本培养基。培养约7-10天后，幼苗根系发达，四叶一心时，需及时移苗至温室等适宜的环境进行炼苗。炼苗约一周后，待幼苗开始恢复生长，5-6叶期，选择阴雨天气或者傍晚，移栽至大田或温室花盆中，移栽至田间或者温室花盆后，根据幼苗或者植株长势及生长速度去除二倍体杂株。

鉴别方法如下：由于CAU3诱导系本身植株颜色为紫色，可根据植株茎秆颜色选取玉米单倍体植株：紫色为杂合二倍体植株，而无色为单倍体植株。根据茎秆的颜色可去除杂合二倍体植株，选取单倍体植株。

四、根据组织培养颜色鉴别单倍体幼胚的效率

以CAU3为父本，分别以郑58、郑单958为母本，选取长为2.0-4.0mm的幼胚，在光照培养箱中正常培养，连续培养一定时间后，以幼胚显色率为标准，来表示显色速度，从而体现组织培养颜色鉴别单倍体幼胚的效率。显色率＝一定时间显色幼胚数/最终显色幼胚数(最终显色幼胚数为持续培养一定时间后，培养皿内显色幼胚数目基本稳定后的显色幼胚数，此处选择连续培养72h后进行移苗时的显色幼胚数，作为最终显色幼胚数)。

计算结果表明：连续培养时间24h时，显色率均在20％以上，部分显色率最高到达82.65％；连续培养48h时，显色率均在70％以上；连续培养72h时，显色率均在95％以上，因此组培鉴别单倍体幼胚最好在连续培养48h以上进行(如图1所示)。部分漏筛的杂合幼胚可在后期进行连续挑选。培养时间过长过短都不利于鉴别：培养时间过长，幼胚生根发芽不利于颜色鉴别(如图2所示)；培养时间过短，有些杂合幼胚尚未开始显色，而被归为无色幼胚，虽然后期可进行连续鉴别，但无疑增加了工作量，增大了单倍体鉴别的误选率。所以连续培养48h以上进行单倍体幼胚的鉴别，幼胚显色更加充分，可以提高单倍体鉴别的准确率，降低误选率。

将上述方法筛选出的CAU3诱导郑单958产生的无色幼胚成苗17株、CAU3诱导郑58产生无色幼胚成苗41株和CAU3诱导郑单958产生有色幼胚成苗28株进行田间表型鉴定。具体步骤如下：于2015.02海南种植由本方法挑选的单倍体幼胚发育的幼苗，待幼苗发育为成苗植株时，根据植株颜色判断待检测植株为杂合二倍体植株还是单倍体植株，判断标准为：植株呈紫色代表为杂合二倍体，植株呈无色代表为单倍体植株。

结果表明：筛选出的CAU3诱导郑单958产生的无色幼胚成苗17株中共有2个杂合二倍体植株，CAU3诱导郑58产生无色幼胚成苗41株中没有杂合二倍体植株，本发明的方法筛选单倍体幼胚的准确率分别为88.2％、100％。筛选出的CAU3诱导郑单958产生有色幼胚成苗28株中所有植株均为紫杆，即准确率为100％。

实施例2、鉴别玉米单倍体幼胚方法的应用

一、杂交子代幼胚的获得

1、杂交

(1)杂交亲本

以郑单958为母本，诱导系CAU5为父本，杂交，得到杂交子代；

以郑单958为母本，诱导系CHOI3为父本，杂交，得到杂交子代。

(2)杂交具体方法

田间种植玉米单倍体诱导系CAU5(父本)、CHOI3(父本)及郑单958(母本)，待母本花丝吐出之前，对其进行去雄、雌穗套袋处理；花丝吐出后，同一时间剪花丝，第二天统一授粉，授粉后12天，得到胚长为2.0-4.0mm的杂交子代。

2、玉米幼胚的获得

取胚长为2.0-4.0mm的杂交子代的幼穗，第二天剥胚(幼穗取回后可暂放于4℃，但不宜太久)，得到玉米幼胚。剥胚的具体步骤如下：将干净无虫害的幼穗去除苞叶，摘去花丝，75％酒精短暂消毒后放入超净工作台。置于事先准备好的次氯酸钠溶液(利用灭菌去离子水配制2％次氯酸钠溶液，滴加两滴吐温80)中进行表面消毒20min。期间将玉米搅动2-3次，消毒更彻底。消毒完成后拿出，放置片刻，控水后即可开始剥胚。所剥取的玉米幼胚，具有一片较大的子叶，即盾片，呈弧形隆起；近轴侧，面平，有较小的胚体，由胚芽、胚轴、胚根组成。

二、玉米幼胚的培养及拟单倍体幼胚的鉴别

将步骤一剥离的玉米幼胚在含有MS培养基的培养皿中培养，将培养皿封口，放置光照培养箱中，温度26-30℃，湿度60％，光照时间24小时，连续培养48h以上。

培养24h后，一部分幼胚胚面显现紫色，随着培养时间的不断增加，显色幼胚数目不断增多，并且胚面颜色加深，持续培养48h后，显色幼胚数目趋于稳定，由于杂交子代中有杂合形式也有单倍体形式，此时即可根据幼胚胚面颜色表达差异鉴别出拟单倍体。

鉴别的方法如下：由于杂合二倍体含有来自父本的A1A2C1C2R1-nj基因，故在胚部盾片可清晰看到紫色色素表达，而拟单倍体幼胚不含父本的显性基因，故胚部盾片无色，在转入再生培养基时，通过胚部盾片有无紫色即可淘汰绝大部分杂合二倍体，剩余极少数杂合体，可在后期田间管理时，根据植株表型形态再进行鉴别。

三、育苗移栽及单倍体植株的鉴别

将挑选出的胚面无色的拟单倍体幼胚转移至MS基本培养基再生，持续培养过程中，若有幼胚胚面变紫，可直接将其淘汰。培养约10-14天后，幼苗两叶一心时，及时移至培养瓶中，培养瓶中为MS基本培养基。培养约7-10天后，幼苗根系发达，四叶一心时，需及时移苗至温室等适宜的环境进行炼苗。炼苗约一周后，待幼苗开始恢复生长，5-6叶期，选择阴雨天气或者傍晚，移栽至大田或温室花盆中，移栽至田间或者温室花盆后，根据幼苗或者植株长势及生长速度去除二倍体杂株。

鉴别方法如下：由于CAU5、CHOI3诱导系本身植株颜色为无色，所以无法用颜色来区分单倍体植株和杂合二倍体植株，此时可根据植株株型选取玉米单倍体植株：植株高大或叶片披散为杂合二倍体植株，而植株矮小或叶片上冲为单倍体植株。

四、根据组织培养颜色鉴别单倍体幼胚的效率

分别以CAU5、CHOI3为父本，郑单958为母本，选取长为2.0-4.0mm的幼胚，在光照培养箱中正常培养，连续培养一定时间后，以幼胚显色率为标准，来表示显色速度，从而体现组织培养颜色鉴别单倍体幼胚的效率。显色率＝一定时间显色幼胚数/最终显色幼胚数(最终显色幼胚数为持续培养一定时间后，培养皿内显色幼胚数目基本稳定后的显色幼胚数，此处选择连续培养72h后进行移苗时的显色幼胚数，作为最终显色幼胚数)。

计算结果表明：连续培养48h时，大部分幼胚显色率达到90％以上。

以郑单958为母本，CAU5为父本诱导所得有色幼胚成苗17株，经田间表型均为杂合二倍体，无色幼胚成苗19株，经田间表型鉴定，均为单倍体；以郑单958为母本，CHOI3为父本诱导所得有色幼胚成苗71株，经田间表型鉴定其中有1株单倍体，无色幼胚成苗11株，经田间表型鉴定均为单倍体。

因此以郑单958为母本，CAU5为父本时，单倍体鉴别漏选率为0，单倍体鉴别准确率为100％；以CHOI3为父本时，单倍体漏选率为1/71＝1.4％，单倍体鉴别准确率为100％。

实施例3、培养基成分及外部条件对幼胚显色率的影响

分别以CAUHOI、CAU4、CAU5为父本，郑单958、先玉335为母本，用实施例1中的玉米单倍体幼胚的鉴别方法筛选单倍体幼胚，将筛选出的单倍体幼胚在光照培养箱中正常培养，连续培养一定时间后，以幼胚显色率为标准研究培养基成分及外部条件对幼胚显色率的影响。显色率＝一定时间显色幼胚数/最终显色幼胚数(最终显色幼胚数为持续培养一定时间后，培养皿内显色幼胚数目基本稳定后的显色幼胚数，此处选择连续培养72h后进行移苗时的显色幼胚数，作为最终显色幼胚数)。

一、培养基PH值对显色率的影响

1、杂交亲本

以郑单958为母本，诱导系CAU5为父本，杂交，得到杂交子代。

2、根据培养基的PH不同，设置如下处理组：

CK：基本MS培养基(pH值5.8)；

1：将MS培养基的pH值调节至7，其他步骤不变的MS培养基；

2：将MS培养基的pH值调节至8，其他步骤不变的MS培养基；

3：将MS培养基的pH值调节至9，其他步骤不变的MS培养基。

将步骤1中的杂交子代在上述各组中的培养基中进行培养。并按照实施例1的步骤四中的方法统计各处理组的显色率。

结果如表1所示：适当提高培养基PH值，有利于杂合二倍体幼胚的显色，而PH值过高不利于后期幼胚成苗，所以PH值为7是较为适宜的。

表1、不同PH处理的显色率

二、蔗糖浓度对显色率的影响

1、杂交亲本

以郑单958为母本，诱导系CAU5为父本，杂交，得到杂交子代。

2、根据培养基的蔗糖浓度不同设置如下处理组：

CK：将基本MS培养基的调节pH值至7，其他步骤不变的基本MS培养基；

1：将MS培养基的制备方法中的蔗糖浓度变为40g/L，并且调节pH值至7，其他步骤不变的MS培养基；

2：将MS培养基的制备方法中的蔗糖浓度变为50g/L，并且调节pH值至7，其他步骤不变的MS培养基；

3：将MS培养基的制备方法中的蔗糖浓度变为60g/L，并且调节pH值至7，其他步骤不变的MS培养基。

将步骤1中的杂交子代在上述各组中的培养基中进行培养。并按照实施例1的步骤四中的方法统计各处理组的显色率。

结果如表2所示：随着蔗糖浓度的提高显色速率也会相应的加快，但蔗糖浓度过高会造成幼胚细胞失水，而不利于幼胚的生长，在一定范围内提高蔗糖浓度的方法加快杂合二倍体幼胚显色是可行的，因此将MS培养基中的蔗糖浓度变为40g/L是较为适宜的。

表2、不同蔗糖浓度处理的显色率

三、光照对显色率的影响

1、杂交亲本

以Mo17为母本，诱导系CAU2为父本，杂交，得到杂交子代。

2、根据培养条件不同设置如下处理组：

实验组：光照(光照强度为25000lx)条件下(温度26-30℃，湿度60％)，连续培养48h；

CK组：黑暗条件下(温度26-30℃，湿度60％)，连续培养48h；

将步骤1中的杂交子代在MS培养基中分别按照上述各组的培养条件进行培养，并按照实施例1的步骤四中的方法统计各处理组的显色率。

结果表明：实验组的显色率为54/88＝61.4％，而对照组显色率为6/92＝6.5％；由此可以看出有无光照对杂合二倍体幼胚显色的影响。将挑选出的单倍体幼胚在光照连续培养48h可以提高杂合二倍体幼胚显色率，实现单倍体幼胚的快速鉴别。

Claims (10)

1.一种玉米单倍体幼胚的鉴别方法，包括如下步骤：用玉米单倍体诱导系作为父本给母本授粉，授粉后取幼穗进行剥胚，得到玉米幼胚；将所述玉米幼胚在培养基中培养，从所述玉米幼胚中选取没有显色的玉米幼胚，得到玉米单倍体幼胚；

所述玉米单倍体诱导系含有A1A2C1C2R1-nj标记。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养的条件为光照培养48h，所述光照的强度为25000lx；所述光照的周期为24h/天。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述剥胚为取长为2.0-3.0mm的玉米幼胚的幼穗进行剥胚。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质在所述培养基中的浓度：MS盐3.0-4.5g/L、蔗糖30-60g/L，琼脂7.5g/L；所述培养基的pH为7-9。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述溶质在所述培养基中的浓度：MS盐3.0g/L、蔗糖40g/L，琼脂7.5g/L；所述培养基的pH为7。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为26-30℃；所述培养的湿度为60％。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：从所述玉米幼胚中选取没有显色的玉米幼胚为选取玉米幼胚盾片部位无色的幼胚。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述玉米单倍体诱导系为农大高诱1号、农大高诱2号、农大高诱3号、农大高诱4号、农大高诱5号或农大高油高诱3号；所述母本为郑单958、先玉335、郑58或Mo17。

9.权利要求1-8中任一所述的方法在培育玉米单倍体植株中的应用。

10.一种培育玉米单倍体植株的方法，包括如下步骤，将权利要求1-8中任一所述方法得到的单倍体幼胚再生培养，得到植株，根据株型和/或茎秆颜色选取玉米单倍体植株。