CN111616047B - 一种玉米单倍体加倍的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种玉米单倍体加倍的方法，通过在单倍体幼胚加倍过程中外施氯化钙，可有效缓解秋水仙素处理药害，降低幼胚玻璃化率，大大提高幼胚成苗率，同时不降低最终加倍效果，从而提高DH系种子生产效率，为降低单倍体组培鉴别与加倍过程中秋水仙素药害造成的死苗、畸形苗和玻璃化苗的程度提供了一个可行的方案，可大大提升单倍体育种技术的效率。

Description

一种玉米单倍体加倍的方法及其应用

技术领域

本发明属于育种领域，具体涉及一种玉米单倍体加倍的方法及其应用。

背景技术

单倍体技术可2代获得纯系，而常规育种则需7代以上，因此被广泛应用于玉米商业化育种中。单倍体加倍直接决定纯系的获得效率，是单倍体育种效率重要影响因素之一。目前常用单倍体加倍方法主要包括自然加倍、组培加倍、浸种法、浸芽法、茎尖生长点注射法、浸根法和滴心法。加倍方法直接影响加倍效果，目前以组培法加倍效果最佳，已逐步应用到育种实践当中。而不同的加倍试剂由于作用原理存在一定的差异，最终的加倍效果相差也较大。目前所用的单倍体加倍试剂，均属有丝分裂抑制剂，常用的有秋水仙素(colchicine)、APM(amiprophos methyl)、拿草特(pronamide)、氟乐灵(trifluralin)等。在玉米单倍体育种中，秋水仙素以其高效的加倍效率应用最为广泛。秋水仙素可导致微管功能异常而解聚，从而使姐妹染色单体无法分离，完成染色体加倍。但在使用秋水仙素进行单倍体加倍时，需严格控制处理时间，其容易产生药害，而造成死苗、畸形苗、玻璃化等情况产生。特别是在进行单倍体幼胚加倍时，幼胚发育程度较低，对秋水仙素较为敏感，容易造成大量的死苗和畸形苗。

发明内容

针对秋水仙素进行单倍体幼胚加倍时存在大量的死苗和畸形苗的问题，本发明的目的是提供一种提高玉米单倍体加倍效率的方法。

本发明所提供的一种玉米单倍体加倍的方法，所述方法包括用玉米单倍体加倍剂对玉米单倍体幼胚加倍，得到染色体加倍的玉米(二倍体，即DH系)；所述玉米单倍体加倍剂的活性成分为秋水仙素、二甲基亚砜和钙离子。

上述方法中，所述玉米单倍体加倍剂中，所述秋水仙素、二甲基亚砜和钙离子的配比可为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:100-2000mg钙离子，具体可为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:500-1000mg钙离子，更具体可为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:500mg钙离子或0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:1000mg钙离子。

上述方法中，所述用玉米单倍体加倍剂对玉米单倍体幼胚加倍包括以下步骤：将玉米单倍体幼胚接种于含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基中进行加倍处理。

上述方法中，所述钙离子在含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基的浓度可为100mg/L-2000mg/L，具体可为500mg/L-1000mg/L，更具体可为500mg/L或1000mg/L。

所述钙离子可来源于CaCl₂、CaSO₄、CaCO₃等钙盐。

上述方法中，所述秋水仙素在含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基的浓度可为0.05-0.4g/L，所述二甲基亚砜在含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基的体积百分含量可为2％。

上述方法中，所述玉米单倍体加倍剂的培养基采用常见植物组培的基础培养基作为基础培养基，例如MS固体培养基、N6固体培养基中的一种。

上述方法中，所述加倍处理的时间可为12小时-72小时，具体可为24小时。

上述方法中，所述玉米单倍体幼胚为以单倍体诱导系为父本和被诱导材料杂交后，授粉后第12-20天剥取的玉米单倍体幼胚，具体可为授粉后第16天剥取的玉米单倍体幼胚。

本发明所提供的一种玉米单倍体加倍的方法，具体可包括以下步骤：

1)将玉米被诱导材料作为母本，以具有R1-nj标记的单倍体诱导系作为父本进行人工授粉杂交；

2)授粉后第12-20天取杂交果穗剥离幼胚，接种于所述含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基中进行加倍处理；

3)在加倍处理后的幼胚中挑选盾片颜色为无色的单倍体幼胚，进行成苗培养，

4)将成苗培养所得的正常胚苗定植后，自交获得单倍体加倍得到染色体加倍的玉米种子。

所述正常胚苗的标准可为根部未玻璃化，不呈透明状，且根长度≥0.5cm的胚苗。

上述方法中，所述具有R1-nj标记的单倍体诱导系可选自CAUHOI、CAU2、CAU3、CAU4、CAU5、CHOI4-1等诱导系中的任一种。

上述方法中，所述被诱导材料可为各种遗传背景的玉米杂交种(例如郑单958、中农大678、京科968等)或玉米自交系(例如郑58等)。

上述方法中，所述人工授粉杂交，为确保父母本花期相遇，可将母本种植一期，父本可围绕母本播期播种多期(例如2-3期)。所述人工授粉杂交，母本花期去雄(剪去花丝)，雌穗严格套袋，取父本花粉人工过量授粉，记录授粉时间。

上述方法中，所述加倍处理的培养条件为全光照、温度26℃左右，湿度60％左右。

上述方法中，所述成苗培养采用常见植物组培的基础培养基，例如MS固体培养基、1/2MS固体培养基中的任一种。

上述方法中，所述成苗培养的时间可为2天-7天，具体可为4天。

上述方法中，所述成苗培养的培养条件为16小时光期/8小时暗期交替、温度26℃左右，湿度60％左右。

上述方法中，所述将成苗培养所得的正常胚苗定植，为定植到大田中，定植前可先进行缓苗炼苗，具体为：正常胚苗长至2-3叶一心后移栽至装有草炭土的营养钵中缓苗炼苗，长至5叶一心后定植到大田中。

上述方法中所述的玉米单倍体加倍剂也属于本发明的保护范围。

本发明还提供P1-P4中任一项应用：

P1、所述玉米单倍体加倍的方法在提高玉米单倍体幼胚加倍成苗率中的应用；

P2、所述玉米单倍体加倍的方法在玉米单倍体育种中的应用；

P3、所述的玉米单倍体加倍剂在提高玉米单倍体幼胚加倍成苗率中的应用；

P4、所述的玉米单倍体加倍剂在玉米单倍体育种中的应用。

本发明所提供的玉米单倍体加倍的方法通过在幼胚加倍过程中外施氯化钙，可有效缓解秋水仙素处理药害，降低幼胚玻璃化率，大大提高幼胚成苗率，同时不降低最终加倍效果，从而提高DH系种子生产效率，为降低单倍体组培鉴别与加倍过程中秋水仙素药害造成的死苗、畸形苗和玻璃化苗的程度提供了一个可行的方案，可大大提升单倍体育种技术的效率。

附图说明

图1为实施例1中玻璃化胚苗、弱胚苗、正常胚苗具体性状表现的照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中所涉的玉米品种郑单958的审定编号为国审玉20000009。记载该品种的非专利文献有“Wu PH,Li HC,Ren J,et al.Mapping of maternal QTLs for in vivohaploid induction rate in maize(Zea mays L.).Euphytica,2014,196(3):413-421”等，公众可从北京德农种业有限公司获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

以下实施例中所涉的玉米品种郑58是国审玉20000009郑单958的亲本。记载该品种的非专利文献有“任姣姣，吴鹏昊，田小龙，陈琛，陈绍江.玉米单倍体雌穗育性自然恢复研究.中国农业大学学报，2018，23(8)：01-07”等，公众可从中国农业大学获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

以下实施例中所涉的玉米品种中农大678是中国农业大学选育品种，审定编号为国审玉20190188，并已在《中华人民共和国农业农村部公告第224号》(农业农村部，2019年10月31日)中公告，公众可从中国农业大学获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

以下实施例中所涉的材料京科968为北京市农林科学院选育品种，记载该品种的非专利文献有“王元东，赵久然，冯培煜，段民孝，张华生，王荣焕，陈传永.京科968等系列玉米品种“易制种”性状选育与高产高效制种关键技术研究.玉米科学，2016，24(2)：11-14”等，公众可从北京市农林科学院处获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的玉米单倍体诱导系CAU5和CHOI4-1具有R1-nj标记，在文献“刘晨旭.玉米单倍体诱导关键基因定位与克隆及新型高油诱导系选育研究[D].中国农业大学,2017.”中公开过，公众可从中国农业大学获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。其中CHOI4-1为该文献中第58页的图5-8中的

下述实施例中的氯化钙、蔗糖和琼脂糖均为北京吉普腾生物技术有限公司产品。

下述实施案例中的秋水仙素为北京博友航生物科技有限公司产品。

下述实施案例中，加倍鉴别培养基的构成为MS固体培养基+玉米单倍体加倍剂，其中MS固体培养基，具体是含有MS盐的浓度为3.0g/L、蔗糖的浓度为30g/L、琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.8的培养基(即配方为MS盐3.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH＝5.8)；玉米单倍体加倍剂由活性成分(溶质)和水组成，所述活性成分为秋水仙素、二甲基亚砜和钙离子，所述秋水仙素、二甲基亚砜和钙离子的配比为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:100-2000mg钙离子，所述秋水仙素在以下实施例中的加倍鉴别培养基的浓度具体为0.1g/L，所述二甲基亚砜在加倍鉴别培养基的体积百分含量为2％，所述钙离子来源于CaCl₂，CaCl₂根据实验需求设置不同的浓度，例如：

CaCl₂浓度为0mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的浓度为3.0g/L、蔗糖的浓度为30g/L、琼脂的浓度为7.5g/L，秋水仙素的浓度为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，CaCl₂的浓度为0mg/L，pH值为5.8的培养基。

CaCl₂浓度为500mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的浓度为3.0g/L、蔗糖的浓度为30g/L、琼脂的浓度为7.5g/L，秋水仙素的浓度为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，CaCl₂的浓度为500mg/L，pH值为5.8的培养基。

CaCl₂浓度为1000mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的浓度为3.0g/L、蔗糖的浓度为30g/L、琼脂的浓度为7.5g/L，秋水仙素的浓度为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，CaCl₂的浓度为1000mg/L，pH值为5.8的培养基。

下述实施案例中，成苗培养基为1/2MS固体培养基，具体是含有MS盐的浓度为1.5g/L、蔗糖的浓度为30g/L、琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.8的培养基(即配方为MS盐1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH＝5.8)。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1、外施Ca²⁺对单倍体幼胚成苗及加倍效果的影响

1.玉米单倍体幼胚的获得

2019年在北京，以郑单958作为母本(被诱导材料)，以诱导系CAU5作为父本诱导单倍体。母本郑单958分两期种植，第一期于5月1日播种，第二期于5月7日播种；父本播期与第二期母本相同，以便花期相遇。母本统一剪花丝，严格去雄，用父本诱导系进行过量授粉，同时记录统一授粉时间为7月10日。

2019年在海南，以郑单958作为母本(被诱导材料)，以诱导系CHOI4-1作为父本诱导单倍体。母本郑单958分两期种植，第一期于11月2日播种，第二期于11月5日播种；父本播期与第二期母本相同，以便花期相遇。母本统一剪花丝，严格去雄，用父本诱导系进行过量授粉，同时记录统一授粉时间为1月5日。

授粉后12-20天可取杂交果穗剥离幼胚。由于北京夏季较海南冬季温度要高，在北京剥取授粉后15天(记为北京DAP15天)的幼胚，在海南剥取授粉后19天(记为海南DAP19天)的幼胚，两种幼胚大小基本相似，本实施例选用北京DAP15天的幼胚和海南DAP19天的幼胚作为材料。

2.玉米单倍体幼胚鉴别及加倍

将步骤1所得的北京DAP15天的幼胚和海南DAP19天的幼胚分别进行如下3组处理：

C0：以CaCl₂浓度为0mg/L的加倍鉴别培养基培养的处理组。

C1：以CaCl₂浓度为500mg/L的加倍鉴别培养基培养的处理组。

C2：以CaCl₂浓度为1000mg/L的加倍鉴别培养基培养的处理组。

各处理组培养时间均为24小时。培养条件为全光照、温度26℃左右，湿度60％左右。

CAU5和CHOI4-1均具有R1-nj标记，幼胚培养24小时后，杂合二倍体幼胚的盾片由于携带有R1-nj标记而呈现紫红色，单倍体幼胚仅含有母本材料的一套染色体，不含R1-nj标记，因此单倍体幼胚的盾片呈现无色。根据盾片颜色挑选出单倍体幼胚，并接种到成苗培养基上进行成苗培养。培养条件为16小时光期/8小时暗期交替、温度26℃左右，湿度60％左右。置于培养室中，进行成苗培养4天。

3.外施不同浓度Ca²⁺对单倍体幼胚成苗的影响

玻璃化胚苗、弱胚苗、正常胚苗的具体性状照片参见图1，划分标准如下：

根部玻璃化呈透明状的胚苗视为玻璃化胚苗；

根部正常(未玻璃化，不呈透明状)且根长度短于0.5cm(＜0.5cm)的胚苗视为弱胚苗；

根部正常(未玻璃化，不呈透明状)且根长度不短于0.5cm(≥0.5cm)的胚苗视为正常胚苗。

成苗培养四天后，统计玻璃化胚苗、弱胚苗、正常胚苗数量，计算玻璃化率、弱胚率、正常苗率：

玻璃化率＝玻璃化胚苗数/总单倍体苗数×100％

弱胚率＝弱胚苗数/总单倍体苗数×100％

正常苗率＝正常胚苗数/总单倍体苗数×100％。

统计和计算结果见表1。

表1不同浓度Ca²⁺对单倍体幼胚成苗的影响

通过表1中两个地点的数据可以发现，CaCl₂处理组(C1和C2)单倍体幼胚的正常苗率均高于无CaCl₂(C0)对照，且玻璃化胚苗率均有所降低。其中，北京DAP15天的幼胚随着CaCl₂浓度升高，玻璃化率一直降低，且相对于对照C0而言，C1、C2玻璃化率分别减少5.71％和8.59％；弱胚率先升后降率，相对于对照C0而言，C1增加0.02％，C2减少3.01％；正常苗率在C2处理时达到最高，为92.06％，比对照增加11.60％。海南DAP19天的幼胚随着CaCl₂浓度升高，玻璃化率和弱胚率均是先降后升，C1玻璃化率和弱胚率分别较对照C0减少16.23％和2.29％；C2玻璃化率较对照C0减少12.59％，而弱胚率较对照C0增加1.37％；正常苗率在C1达到最大，为81.60％，比对照C0高18.52％。在两地实验结果中，处理C1和C2玻璃化率均比对照C1降低，且玻璃化率变化量较大，弱胚率变化幅度较小。由此可见，CaCl₂主要通过降低玻璃化率的减少使正常苗率提高。综合来看，C1和C2均可提高单倍体幼胚的成苗率，但从稳定性方面来看，两季C1处理组均有效提高单倍体幼胚正常苗率，同时降低玻璃化率和弱胚率。因此，可以C1即500mg/L CaCl₂作为最佳施用浓度。

4.外施Ca²⁺对单倍体幼胚加倍效果的影响

将步骤3的成苗培养4天后得到的北京三个CaCl₂浓度处理(C0、C1、C2)的正常胚苗作为单倍体苗，分别移至培养瓶或培养盒内进行培养，培养一周左右长至2-3叶一心后移栽至装有草炭土的营养钵中缓苗炼苗，15天左右长至5叶一心，定植至大田。

单倍体苗在大田中生长40天左右后，调查单倍体雄穗露药、散粉、自交状况，计算露药率、散粉率、自交率：

露药率＝露药株数/单倍体总株数；

散粉率＝散粉株数/单倍体总株数；

自交率＝自交株数/单倍体总株数。

统计和计算结果见表2。

表2不同浓度Ca²⁺组培对单倍体苗田间加倍的影响

在3个CaCl₂浓度条件下，北京单倍体苗的田间散粉状况中，露药率C1高于对照C0，而C2低于C0；散粉率和自交率C1、C2均高于对照C0，说明处理组(C1、C2)较对照(C0)加倍效率提升。并且在C1时散粉率和自交率均最高，分别为64.00％和60.00％，表明加倍效果最好。C0时露药率为63.16％，但散粉率只有47.37％，说明C0处理下，部分露药株花药干瘪，尽管露药却不能散粉。而C1、C2处理下，露药率和散粉率均相同。而单倍体加倍是需要散粉自交的，说明CaCl₂对提高加倍效率有一定作用。由此说明外施Ca²⁺可在保证最终加倍效率不降低的情况下提高单倍体幼胚成苗率。自交得到的即为单倍体加倍得到的DH系种子。

实施例2胚龄对外施Ca²⁺的单倍体幼胚的成苗影响

为了研究不同胚龄幼胚在Ca²⁺浓度为500mg/L的培养基下的幼胚成苗状况，本实施例探讨不同胚龄与成苗之间的关系，具体实验如下：

2019年在海南，以郑单958作为母本(被诱导材料)，以诱导系CHOI4-1作为父本诱导单倍体。母本郑单958于11月2日播种，父本于11月10日播种。母本统一剪花丝，严格去雄，用父本诱导系进行过量授粉，同时记录授粉时间为1月5日。

分别剥取授粉后16天，18天和20天幼胚(以下分别简称为DAP16、DAP18和DAP20)使用CaCl₂浓度为500mg/L的加倍鉴别培养基进行组培加倍处理24小时。

CHOI4-1具有R1-nj标记，幼胚培养24小时后，杂合二倍体幼胚的盾片由于携带有R1-nj标记而呈现紫红色，单倍体幼胚仅含有母本材料的一套染色体，不含R1-nj标记，因此单倍体幼胚的盾片呈现无色。根据盾片颜色挑选出单倍体幼胚，并接种到成苗培养基上进行成苗培养。培养条件为16小时光期/8小时暗期交替、温度26℃左右，湿度60％左右。置于培养室中，进行成苗培养4天。

成苗培养4天后，调查成苗性状，玻璃化胚苗、弱胚苗、正常胚苗的具体划分标准以及玻璃化率、弱胚率、正常苗率的计算方法参见实施例1，统计和计算结果见表3。

表3外施Ca²⁺后不同胚龄单倍体幼胚成苗比较

由表3可知，随着胚龄增加，正常苗率不断降低，幼胚在DAP16时，正常苗率最高，为87.96％。玻璃化率随着胚龄的增加先增加后减少，在DAP18玻璃化率最高，为16.04％。弱胚率随着胚龄增加先减少后增加，在DAP20弱胚率最高，为23.23％，是DAP16的5倍与DAP18的8倍。以上结果说明，随着胚龄增加，幼胚受药害作用而使正常苗率不断降低；玻璃化率在幼胚时随着胚龄增加而增加，当幼胚趋于成熟时，玻璃化率减少，而弱胚率明显增加。

实施例3外施Ca²⁺对不同遗传背景品种的单倍体幼胚的成苗影响

为进一步说明不同浓度Ca²⁺对不同材料的加倍成苗状况的影响，分别对中农大678、京科968和郑58这3种不同遗传背景的材料作为母本的单倍体幼胚进行实验验证，具体实验如下：

2019年在海南，以京科968，中农大678和郑58分别作为母本(被诱导材料)，以诱导系CHOI4-1作为父本诱导单倍体。母本京科968，中农大678和郑58均于11月2日播种。父本错两期，于11月10日播种。母本统一剪花丝，严格去雄，用父本诱导系进行过量授粉，同时记录授粉时间为1月5日。杂交种中农大678、京科968分别诱导(杂交)10穗左右，自交系郑58诱导(杂交)15穗左右。授粉后19天剥取幼胚。

以京科968，中农大678和郑58诱导得到的幼胚分别进行如下2组处理：

C0：以CaCl₂浓度为0mg/L的加倍鉴别培养基培养的处理组。

C1：以CaCl₂浓度为500mg/L的加倍鉴别培养基培养的处理组。

各处理组培养时间均为24小时。培养条件为全光照、温度26℃左右，湿度60％左右。

CHOI4-1具有R1-nj标记，幼胚培养24小时后，杂合二倍体幼胚的盾片由于携带有R1-nj标记而呈现紫红色，单倍体幼胚仅含有母本材料的一套染色体，不含R1-nj标记，因此单倍体幼胚的盾片呈现无色。

根据盾片颜色挑选出单倍体幼胚，并接种到成苗培养基上进行成苗培养。培养条件为16小时光期/8小时暗期交替、温度26℃左右，湿度60％左右。置于培养室中，进行成苗培养4天。

成苗培养4天后，调查成苗性状，玻璃化胚苗、弱胚苗、正常胚苗的具体划分标准以及玻璃化率、弱胚率、正常苗率的计算方法参见实施例1，统计和计算结果见表4。

表4不同材料单倍体幼胚成苗比较

通过不同材料在C0和C1下加倍成苗情况可知，京科968、中农大678和郑58玻璃化苗率在C1处理下比对照C0低，正常苗率在C1处理下比对照C0高，说明外施Ca²⁺能提高这三个材料的成苗率。其中，在相同处理下，京科968的正常苗率最高，在C0处理下为71.25％，在C1处理下为80.77％。综上所述，C1处理下基本下能改善大部分玉米单倍体材料的成苗状况。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (7)

1.一种玉米单倍体加倍的方法，所述方法包括用玉米单倍体加倍剂对玉米单倍体幼胚加倍，得到染色体加倍的玉米；其特征在于：将玉米单倍体幼胚接种于含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基中进行加倍处理；所述玉米单倍体加倍剂的活性成分为秋水仙素、二甲基亚砜和钙离子；所述玉米单倍体加倍剂中，所述秋水仙素、二甲基亚砜和钙离子的配比为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:500 -1000mg钙离子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述玉米单倍体加倍剂中，所述秋水仙素、二甲基亚砜和钙离子的配比为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:500mg钙离子，或为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:1000mg钙离子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述加倍处理的时间为12小时-72小时。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述玉米单倍体幼胚为以单倍体诱导系为父本和被诱导材料杂交授粉后第12-20天后剥取的玉米单倍体幼胚。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述玉米单倍体幼胚为以单倍体诱导系为父本和被诱导材料杂交授粉后第16天后剥取的玉米单倍体幼胚。

6.权利要求1-5中任一项所述方法中的所述玉米单倍体加倍剂。

7.下述任一种应用：

P1、权利要求1-5中任一项所述的方法在提高玉米单倍体幼胚加倍成苗率中的应用；

P2、权利要求1-5中任一项所述的方法在玉米单倍体育种中的应用；

P3、权利要求6所述的玉米单倍体加倍剂在提高玉米单倍体幼胚加倍成苗率中的应用；

P4、权利要求6所述的玉米单倍体加倍剂在玉米单倍体育种中的应用。

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