CN102177846A - 一种玉米单倍体加倍管理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玉米单倍体加倍管理方法。本发明所提供的玉米单倍体加倍方法，包括以下步骤：(1)切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽；(2)用秋水仙素、二甲基亚砜和水的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽，得到染色体加倍的玉米幼芽。本发明所提供的玉米单倍体加倍管理方法能显著地提高玉米单倍体的加倍效率，雄穗散粉率一般为30％以上，远远高于作为对照的雄穗散粉率(一般5％以下)。此方法解决了单倍体育种过程中加倍效率低的这一关键技术难题，从而大大提高了单倍体育种效率，使大规模应用单倍体育种技术成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种玉米单倍体加倍管理方法。
背景技术
优良纯系的培育是玉米育种的核心环节。利用传统的育种方法，一般需经过4-6代的自交才能使品系达到纯合(Kuo C.S.，Guo Z.C.，Li Z.，Gui Y.，1994.Anther culture andhaploid breeding of maize in China.In：Bajaj(Ed.)，Biotechnology in Agriculture and ForestryVol.25，Maize，Springer Verlag，Berlin，149-161)；而且理论上讲，即使自交n(n∝∞)代，基因型也不能达到100％的完全纯合状态。因此，选育一个品种通常需要数十年的时间，消耗大量的人力、物力和财力。因此如何缩短育种进程、提高育种效率是育种家们一直追求的目标，而单倍体育种技术只需两个世代即可获得理论上基因型100％纯合的纯系，并用于杂交种组配，大大加快了育种的进程。但是，目前单倍体的成功加倍成为单倍体育种技术大规模应用的限制因素，尤其是雄穗的成功加倍(刘志增，宋同明，2000.玉米单倍体雌雄育性的自然恢复以及染色体的化学加倍，作物学报，26(6)：947-952；魏俊杰，陈梅香，2006.玉米单倍体育性自然恢复的初步研究，玉米科学，14(2)：24-26)。单倍体加倍常用的方法有自然加倍法和药物加倍法。自然加倍的频率往往比较低，许多材料的单倍体自然加倍率低于5％，而且不同的材料自然加倍的频率差异很大，有些材料不发生自然加倍(Zabirova E.R.，Shatskaya O.A.，Shcherbak V.S.，1993.Line 613/2as asource of a high frequency of spontaneous diploidization in corn.Maize Genet.Coop.NewsLett.67：67；Shatskaya O.A.，Zabirova E.R.，Shcherbak V.S.and Chumak M.V.，1994.Massinduction of maternal haploids in corn.Maize Genet.Coop.News Lett.68：51.)，因此仅依自然加倍远远不能满足单倍体规模化育种的需求。KatoA.(2002)利用N2O气体也可以使单倍体的染色体加倍(Kato A.，2002.Chromosome doubling of haploid maizeseedlings using nitrous oxide gasat the flower primordial stage.Plant Breeding.121：370-377)，但是由于加倍设备比较复杂，离生产实践利用还有一定的距离；而药物加倍是目前普遍利用的单倍体加倍方法，主要利用的药物有秋水仙素和除草剂。从整体来看，除草剂的加倍效果远不如秋水仙素。秋水仙素是目前进行单倍体加倍主要利用药物。目前报道利用秋水仙素加倍方法主要有注射法、浸根法和浸种法。但利用注射法如果处理时期和注射的部位把握不准，将大大影响此方法的效果；利用浸根法对植株伤害较严重，存活率较低(文科，黎亮，刘玉强，陈绍江，2006.高效生物诱导玉米单倍体及其加倍方法研究初报，中国农业大学学报，11(5)：17-20)；Gayen等采取秋水仙素浸泡单倍体种子，结果仅有18％的种子加倍成功(Gayen P.，Maden J.K.，Kumar R.and Sarkar K.R.，1994.Chromosome doubling in haploids through colchicines.MaizeGenet Coop NewsLett.68：64-65)，整体来看浸种法加倍效率并不理想。目前，从整体来看，除草剂的加倍效果远不如秋水仙素，因此秋水仙素是进行单倍体加倍最常用的高效加倍试剂，但秋水仙素的毒性很大，对幼苗易造成较重伤害，如没有很好的管理方法将影响单倍体的加倍效率。因此，单倍体加倍及其管理对玉米育种具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米单倍体加倍管理方法。
本发明所提供的玉米单倍体加倍方法，包括以下步骤：
(1)切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽；
(2)用秋水仙素、二甲基亚砜和水的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽，得到染色体加倍的玉米幼芽。
所述玉米单倍体幼芽具有生长点、一片真叶、胚轴、胚根和胚芽鞘，胚芽鞘的基部位于胚轴上，且胚芽鞘将生长点和一片真叶包裹在内。
所述玉米单倍体幼芽从芽的基部到芽尖端的长度为1.5cm-2.5cm或1.5cm或2.0cm或2.5cm。
所述方法还包括如下步骤：将步骤(2)得到的染色体加倍的玉米幼芽移栽至育苗盘中培养，再移栽至大田中培养，得到与所述玉米单倍体幼芽相比，染色体加倍的玉米植株。
所述混合液中秋水仙素的质量百分比浓度为0.06％-0.12％或0.06％-0.08％或0.06％或0.08％或0.12％。
所述混合液中二甲基亚砜的质量百分比浓度为1％-3％或1％或2％或3％。
所述浸泡在如下条件下进行：温度为23℃-25℃、避光和时间为8小时-10小时，所述温度具体为23℃、24℃或25℃，所述时间具体为8小时、9小时或10小时。
所述方法在所述步骤(2)后，还包括将所述步骤(2)得到的染色体加倍的玉米幼芽用清水浸洗的步骤。
所述将步骤(2)得到的染色体加倍的玉米幼芽移栽至育苗盘中培养的方法包括以下步骤：先将所述染色体加倍的玉米幼芽置于遮阴条件下培养，待第一片真叶展开后再将所述染色体加倍的玉米幼芽置于自然条件下培养。
所述再移栽至大田中培养的移栽时机是在所述移栽至育苗盘中培养至长出4-6片或4片或5片或6片叶时。
所述再移栽至大田中培养包括如下步骤：将所述移栽至大田的幼苗用遮阳网遮阳5天-7天或5天或6天或7天。
所述玉米单倍体幼芽是由玉米单倍体种子萌发得到的，所述萌发过程中避光。
所述玉米单倍体种子为以农大108或郑单958为母本，以农大高诱1号诱导系为父本诱导得到的。
本发明所提供的玉米单倍体加倍管理方法能显著地提高玉米单倍体的加倍效率，雄穗散粉率一般为30％以上，远远高于作为对照的雄穗散粉率(一般为5％以下)。此方法解决了单倍体育种过程中加倍效率低的这一关键技术难题，从而大大提高了单倍体的育种效率，使大规模应用单倍体育种技术成为可能。
附图说明
图1为玉米幼芽及切芽部位。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用不同浓度的秋水仙素混合液进行玉米单倍体加倍
一、玉米单倍体种子的筛选
以优良杂交种郑单958(北京德农种业有限公司)和稳产优质杂交种农大108(北京金色农华种业科技有限公司)为母本，用孤雌生殖单倍体诱导系农大高诱1号(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是：刘志增，宋同明，2000，玉米高频率孤雌生殖单倍体诱导系的选育与鉴定，作物学报，26(5)：570-574)为父本进行诱导。挑选糊粉层有紫色标记、胚部无紫色标记的种子为单倍体种子，共挑选了671个郑单958单倍体种子，466个农大108单倍体种子。
二、用不同浓度的秋水仙素混合液进行玉米单倍体加倍
方法I
1、玉米单倍体种子的催芽
将步骤一所筛选的单倍体种子用水洗净，放在已铺有消毒好的毛巾的托盘内，种子之间留有一定空隙。然后放入培养箱中，避光培养，得到玉米单倍体幼芽。
玉米单倍体幼芽具有生长点、一片真叶、胚轴、胚根和胚芽鞘，胚芽鞘的基部位于胚轴上，且胚芽鞘将生长点和一片真叶包裹在内(图1，图1中1为切除胚芽鞘尖端的部位；2为胚芽鞘；3为胚根)。
2、不同浓度秋水仙素混合液的配制
分别配制以下3种不同质量浓度的秋水仙素混合液：
(1)T1：0.06％秋水仙素+2％二甲基亚砜，其余为水。
(2)T2：0.08％秋水仙素+2％二甲基亚砜，其余为水。
(3)T2：0.12％秋水仙素+2％二甲基亚砜，其余为水。
根据以上浓度计算好各个药剂和蒸馏水的用量，先把秋水仙素(Sigma公司生产)加入烧杯中，加入蒸馏水待秋水仙素完全溶解后，再加入助渗剂二甲基亚砜(美国Amresco公司生产)，摇匀后保存于密闭的棕色瓶中。
3、玉米单倍体幼芽的处理
(1)切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端
上述步骤1中的玉米单倍体种子经催芽后，待芽长(从芽的基部到芽尖端的长度)为2.0cm时，取出单倍体幼芽，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽，可明显看到幼芽顶部呈现一小孔。
(2)用不同浓度秋水仙素混合液处理幼芽
将上述切去胚芽鞘尖端的单倍体幼芽分别放入4个容器内，将步骤2配置好的3种不同浓度秋水仙素混合液(T1、T2和T3)及作为对照处理的清水(T4)分别倒入上述4个容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在23℃避光条件下处理8小时，得到染色体加倍的玉米幼芽。
4、染色体加倍的幼苗的培育
将步骤3得到染色体加倍的玉米幼芽在流动的清水中浸洗半小时，然后将其移入育苗盘中，置于遮阴条件下培养，待第一片真叶长出后置于自然条件下培养。一个染色体加倍的玉米幼芽长成一个染色体加倍的玉米幼苗。
5、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理
待步骤4培育的染色体加倍的玉米幼苗长到4片叶时移栽到中国农业大学昌平试验站，同时用遮阳网遮阳5天，田间进行精细管理，确保幼苗正常生长。散粉时自交并收获其果穗。
6、统计分析处理后玉米单倍体的加倍效果
以雄穗散粉率(散粉率＝散粉株数×100％/处理后移栽单倍体幼芽数)表示加倍率，实验设3次重复，结果取平均数。统计的各个处理的加倍效果见表1。
表1杂交种郑单958和农大108后代单倍体的综合加倍效果
注：C为秋水仙素(Colchicine)；D为二甲基亚砜(DMSO)
结果表明处理T1雄穗平均散粉率为27.31％，变异系数为20.93％，变异范围为23.37-31.25％；处理T2单倍体雄穗平均散粉率为35.00％，变异系数为25.69％，变异范围为28.65-41.36％；处理T3单倍体雄穗平均散粉率为31.64％，变异系数为72.67％，变异范围为15.38-47.89％；处理T4为清水对照，单倍体雄穗平均散粉率为3.90％，变异系数为11.97％，变异范围为3.57-4.23％。综上可知处理T1、T2和T3加倍效果均显著高于对照T4，分别高出对照(T4)23.41，31.10和27.74个百分点。此结果说明，经过处理后的单倍体散粉株率明显高于未处理的单倍体的散粉株率，因此，秋水仙素和二甲基亚砜的混合液起到了显著的加倍效果，其中秋水仙素的最佳质量浓度为0.06％-0.12％，优选为0.08％。
方法II
1、玉米单倍体种子的催芽
与方法I的步骤1相同。
2、不同浓度秋水仙素混合液的配制
(1)T1：0.06％秋水仙素+1％二甲基亚砜，其余为水。
(2)T2：0.08％秋水仙素+1％二甲基亚砜，其余为水。
(3)T2：0.12％秋水仙素+1％二甲基亚砜，其余为水。
配制方法与方法I的步骤2相同。
3、玉米单倍体幼芽的处理
(1)切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端
上述步骤1中的玉米单倍体种子经催芽后，待芽长(从芽的基部到芽尖端的长度)为1.5cm左右时，取出单倍体幼芽，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽，可明显看到幼芽顶部呈现一小孔。(2)用不同浓度秋水仙素混合液处理幼芽
将上述切去胚芽鞘的单倍体幼芽分别放入4个容器内，将步骤2配置好的3种不同浓度秋水仙素混合液(T1、T2、T3)及作为对照处理的清水(T4)分别倒入上述4个容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在24℃避光条件下处理9小时，得到染色体加倍的玉米幼芽。
4、染色体加倍的幼苗的培育
将步骤3处理后的玉米单倍体幼芽在流动的清水中浸洗1小时，然后将其移入育苗盘中，置于遮阴条件下培养，待第一片真叶长出后置于自然条件下培养。一个染色体加倍的玉米幼芽长成一个染色体加倍的玉米幼苗。
5、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理
待步骤4培育的染色体加倍的玉米幼苗长到5片叶时移栽到中国农业大学昌平试验站，同时用遮阳网遮阳6天，田间进行精细管理，确保幼苗正常生长。散粉时自交并收获其果穗。
6、统计分析处理后玉米单倍体的加倍效果
结果与方法I的结果无显著差异。
方法III
1、玉米单倍体种子的催芽
与方法I的步骤1相同
2、不同浓度秋水仙素混合液的配制
(1)T1：0.06％秋水仙素+3％二甲基亚砜
(2)T2：0.08％秋水仙素+3％二甲基亚砜
(3)T2：0.12％秋水仙素+3％二甲基亚砜
配制方法与方法I的步骤2相同。
3、玉米单倍体幼芽的处理
(1)切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端
上述步骤1中的玉米单倍体种子经催芽后，待芽长(从芽的基部到芽尖端的长度)为2.5cm时，取出单倍体幼芽，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽，可明显看到幼芽顶部呈现一小孔。
(2)用不同浓度秋水仙素混合液处理幼芽
将上述切去胚芽鞘的单倍体幼芽分别放入4个容器内，将步骤2配置好的3种不同浓度秋水仙素混合液(TI、T2、T3)及作为对照处理的清水(T4)分别倒入上述4个容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在25℃避光条件下处理10小时，得到染色体加倍的玉米幼芽。
4、染色体加倍的幼苗的培育
将步骤3处理后的玉米单倍体幼芽在流动的清水中浸洗2小时，然后将其移入育苗盘中，置于遮阴条件下培养，待第一片真叶长出后置于自然条件下培养。一个染色体加倍的玉米幼芽长成一个染色体加倍的玉米幼苗。
5、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理
待步骤4培育的染色体加倍的玉米幼苗长到6片叶时移栽到中国农业大学昌平试验站，同时用遮阳网遮阳7天，田间进行精细管理，确保幼苗正常生长。散粉时自交并收获其果穗。
6、统计分析处理后玉米单倍体的加倍效果
结果与方法I的结果无显著差异。
实施例2、用秋水仙素混合液对不同基础材料的玉米单倍体进行加倍
一、玉米单倍体种子的筛选
分别以玉米杂交种农大108(北京金色农华种业科技有限公司)和郑单958(北京德农种业有限公司)为母本，用孤雌生殖单倍体诱导系农大高诱1号做父本进行诱导。挑选糊粉层有紫色标记、胚部无紫色标记的种子为单倍体种子。
二、用秋水仙素混合液对不同基础材料的玉米单倍体进行加倍
方法I
1、玉米单倍体种子的催芽
将步骤一所筛选的单倍体种子用水洗净，放在已铺有消毒好的毛巾的托盘内，种子之间留有一定空隙。然后放入培养箱中，避光培养，得到玉米单倍体幼芽。
2、秋水仙素混合液的配制
配制的秋水仙素混合液的质量浓度为：0.08％秋水仙素+2％二甲基亚砜，其余为水。
根据以上浓度计算好各个药剂和蒸馏水的用量，先把秋水仙素加入烧杯中，加入蒸馏水待秋水仙素完全溶解后，再加入助渗剂二甲基亚砜，摇匀后保存于密闭的棕色瓶中。
3、玉米单倍体幼芽的处理
(1)切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端
上述步骤1中的玉米单倍体种子经催芽后，待芽长(从芽的基部到芽尖端的长度)为2.0cm时，取出单倍体幼芽，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽，可明显看到幼芽顶部呈现一小孔。
(2)用秋水仙素混合液处理幼芽
将上述切去胚芽尖的单倍体幼芽放入容器内，将步骤2配置好的秋水仙素混合液倒入容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在23℃避光条件下处理8小时，得到染色体加倍的玉米幼芽；用同样的方法进行清水处理作对照，观察加倍效果，即自然加倍。
4、处理后玉米单倍体幼苗的培育
将步骤3得到染色体加倍的玉米幼芽在流动的清水中浸洗半小时，然后将其移入育苗盘中，置于遮阴条件下培养，待第一片真叶长出后置于自然条件下培养。一个染色体加倍的玉米幼芽长成一个染色体加倍的玉米幼苗。
5、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理
待步骤4培育的染色体加倍的玉米幼苗长到4片叶时移栽到中国农业大学昌平试验站，同时用遮阳网遮阳5天，田间进行精细管理，确保幼苗正常生长。散粉时自交并收获其果穗。
6、统计分析处理后玉米单倍体的加倍效果
以雄穗散粉率(散粉率＝散粉株数×100％/处理后移栽单倍体幼芽数)表示加倍率。实验设3次重复，结果取平均数。统计结果如表2所示。
表2不同基础材料单倍体处理与对照的散粉情况比较
结果表明该处理后农大108处理后单倍体的雄穗散粉率为39.39％，高于对照38.44个百分点；郑单958处理后单倍体的雄穗散粉率为37.08％，高于对照33.27个百分点；；整体来看处理后平均雄穗散粉率达38.24％，是对照的16.70倍，经t测验(t＝13.87＞t0.05＝12.71)显著高于对照。
方法II
1、玉米单倍体种子的催芽
与方法I的步骤1相同。
2、秋水仙素混合液的配制
配制的秋水仙素混合液的质量浓度为：0.06％秋水仙素+1％二甲基亚砜。
配制方法与方法I的步骤2相同。
3、玉米单倍体幼芽的处理
(1)切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端
上述步骤1中的玉米单倍体种子经催芽后，待芽长(从芽的基部到芽尖端的长度)为1.5cm左右时，取出单倍体幼芽，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽，可明显看到幼芽顶部呈现一小孔。
(2)用秋水仙素混合液处理幼芽
将上述切去胚芽鞘的单倍体幼芽分别放入4个容器内，将步骤2配置好的3种不同浓度秋水仙素混合液(TI、T2、T3)及作为对照处理的清水(T4)分别倒入上述4个容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在24℃避光条件下处理9小时，得到染色体加倍的玉米幼芽。
4、处理后玉米单倍体幼苗的培育
将步骤3得到染色体加倍的玉米幼芽在流动的清水中浸洗1小时，然后将其移入育苗盘中，置于遮阴条件下培养，待第一片真叶长出后置于自然条件下培养。一个染色体加倍的玉米幼芽长成一个染色体加倍的玉米幼苗。
5、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理
待步骤4培育的染色体加倍的玉米幼苗长到5片叶时移栽到中国农业大学昌平试验站，同时用遮阳网遮阳6天，田间进行精细管理，确保幼苗正常生长。散粉时自交并收获其果穗。
6、统计分析处理后玉米单倍体的加倍效果
结果与方法I的结果无显著差异。
方法III
1、玉米单倍体种子的催芽
与方法I的步骤1相同。
2、秋水仙素混合液的配制
配制的秋水仙素混合液的质量浓度为：0.12％秋水仙素+3％二甲基亚砜。
配制方法与方法I的步骤2相同。
3、玉米单倍体幼芽的处理
(1)切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端
上述步骤1中的玉米单倍体种子经催芽后，待芽长(从芽的基部到芽尖端的长度)为2.5cm左右时，取出单倍体幼芽，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽，可明显看到幼芽顶部呈现一小孔。
(2)秋水仙素混合液处理幼芽
将上述切去胚芽鞘的单倍体幼芽分别放入4个容器内，将步骤2配置好的3种不同浓度秋水仙素混合液(TI、T2、T3)及作为对照处理的清水(T4)分别倒入上述4个容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在25℃避光条件下处理10小时，得到染色体加倍的玉米幼芽。
4、染色体加倍的幼苗的培育
与方法I的步骤4相同
5、玉米单倍体成苗移栽及管理
待步骤4培育的染色体加倍的玉米幼苗长到6片叶时移栽到中国农业大学昌平试验站，同时用遮阳网遮阳7天，田间进行精细管理，确保单倍体体正常生长。散粉时自交并收获其果穗。
6、统计分析处理后玉米单倍体的加倍效果
结果与方法I的结果无显著差异。
Claims (7)
1.一种玉米单倍体加倍方法，包括以下步骤：
(1)切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽；
(2)用秋水仙素、二甲基亚砜和水的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽，得到染色体加倍的玉米幼芽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将步骤(2)得到的染色体加倍的玉米幼芽移栽至育苗盘中培养，再移栽至大田中培养，得到与所述玉米单倍体幼芽相比，染色体加倍的玉米植株。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述混合液中秋水仙素的质量百分比浓度为0.06％-0.12％或0.06％-0.08％或0.06％或0.08％或0.12％。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述混合液中二甲基亚砜的质量百分比浓度为1％-3％或1％或2％或3％。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述浸泡在如下条件下进行：温度为23℃-25℃、避光和时间为8小时-10小时，所述温度具体为23℃、24℃或25℃，所述时间具体为8小时、9小时或10小时。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法在所述步骤(2)后，还包括将所述步骤(2)得到的染色体加倍的玉米幼芽用清水浸洗的步骤。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述玉米单倍体幼芽是由玉米单倍体种子萌发得到的，所述萌发过程中避光。
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