CN102657080A - 一种玉米单倍体加倍方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种玉米单倍体加倍方法，包括以下步骤：1)切除玉米单倍体幼芽胚芽鞘尖端；2)用秋水仙素配以二甲基亚砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽的胚芽部分，得到染色体加倍的玉米幼芽。本发明所提供的玉米单倍体加倍技术能显著地提高玉米单倍体的成活率和结实率，成活率高达70％以上，远远高于作为对照的成活率(一般50％以下)，结实率10％以上，远远高于对照的结实率(一般5％左右)，而且减少秋水仙素的使用量5～6倍。该方法应用于单倍体育种体系中，将有效地推进玉米育种技术的变革，实现单倍体育种的规模化和工程化。

Description

一种玉米单倍体加倍方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及农业育种领域，更具体地，涉及一种高效低耗、能够使加倍率显著提高的玉米单倍体加倍技术。

背景技术

玉米中采用双单倍体育种(Doubled haploid，DH)可以缩短自交系选育时间，加快育种进程，已经成为玉米育种的主要方法。获得足够单倍体和加倍获得DH系是DH育种的基本环节。然而，玉米单倍体自然加倍比较困难，目前，单倍体的成功加倍是单倍体育种技术大规模应用的限制因素，尤其是雄穗的成功加倍。单倍体加倍分为自然加倍和药物加倍，许多材料的自然加倍率低于5％，有些材料甚至不发生自然加倍，因此采取人工处理提高加倍率来满足育种与相关研究的需要显得尤为重要。

人工处理加倍的方法和试剂较为多样，其中秋水仙素是常用的加倍试剂，且多采用浸芽法进行处理。因为浸芽法简单易行，而且具有较高的加倍效率。但秋水仙素的毒性很大，对幼苗易造成严重伤害，很容易影响单倍体的加倍效率。另外，整体来看，浸种法加倍效率并不理想。主要是浸种法对植株伤害较为严重，存活率较低；并且，前人所用的浸芽法都是将整个幼苗都浸泡在秋水仙素溶液中，不仅幼芽吸收秋水仙素，而且幼苗根部也吸收了大量的秋水仙素溶液，从而影响了根系的生长，造成大量幼苗死亡。

因此，探索一种既能减少幼苗死亡又能提高玉米单倍体加倍率的加倍方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于一种既能减少幼苗死亡又能提高玉米单倍体加倍率的加倍方法。

发明人通过大量实验研究，发现了一种高效低耗的植物单倍体加倍技术，包括以下步骤：1)切除植物单倍体幼芽胚芽鞘尖端；2)用秋水仙素配以二甲基亚砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的植物单倍体幼芽的上部，得到染色体加倍的植物幼芽。上述植物单倍体加倍技术，命名为幼芽上部浸泡法。

由于在该方法中，植物单倍体幼苗仅上部(即胚芽部分)和秋水仙素溶液接触，因而受伤害相对较小，存活率得以提高，同时加倍效果也非常好，具有良好的应用价值。

本发明提供的植物单倍体加倍方法，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

优选地，所述单子叶植物为玉米。

在本发明中，所述的秋水仙素混合液的浓度为：0.4-0.8mg/mL，并配以1％-5％二甲基亚砜；秋水仙素混合液的使用量为：300-1000μl。

在本发明中，所述的秋水仙素混合液的浓度为：0.6mg/mL，并配以2％二甲基亚砜；秋水仙素混合液的使用量为：500μl。

进一步地，在本发明的方法所述浸泡步骤中，仅留胚芽部分浸泡在混合液中，根部露在外部。

进一步，本发明提供了一种高效低耗的玉米单倍体加倍方法，包括以下步骤：

1)切除玉米单倍体幼芽胚芽鞘顶端；

2)用秋水仙素配以二甲基亚砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽的上部，通过该部分浸泡措施，得到染色体加倍的玉米幼芽。

该方法中用秋水仙素混合液浸泡过程中，首先在每个离心管中加入300-1000μL 0.4-0.8mg/mL的秋水仙素溶液，所述秋水仙素溶液中还配有1％-5％二甲基亚砜，紧接着将已经切除胚芽鞘顶端的幼芽根部朝上倒着放进离心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面，整个操作过程要求在18-25℃之间进行，浸泡6-10h。

优选地，所述的秋水仙素混合液的浓度为：0.6mg/mL，并配以2％二甲基亚砜；秋水仙素混合液的使用量为：500μl；整个操作过程要求在23℃进行，浸泡8h。

在用秋水仙素混合液浸泡过程中，为了防止幼芽根部脱水，可用湿纸巾或湿毛巾覆盖幼苗根部，可达到更好的效果，实现更好的存活率。

进一步，本发明所提供的玉米单倍体加倍方法由如下步骤组成：

1.种子发芽：将单倍体种子清洗干净，均匀地摆放在铺有湿毛巾的发芽盘中，放置在20-28℃的适宜环境中暗光培养3-5天，并及时补充水分。

2.胚芽鞘顶端切除：待玉米单倍体幼芽长至1-3cm时，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽。

3.幼芽浸泡：取离心管，在每个离心管中加入300-1000μL0.4-0.8mg/mL的秋水仙素溶液(配以1％-5％二甲基亚砜)，将已经切除胚芽鞘顶端的幼芽倒着放进离心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面，为了防止幼芽根部脱水，用湿纸巾或湿毛巾覆盖幼苗根部。整个操作过程要求在18-25℃之间进行，浸泡6-10h。

优选地，幼芽浸泡时所用的秋水仙素混合溶液中，含终浓度为0.6mg/mL的秋水仙素和2％的二甲基亚砜。整个操作过程温度为22-25℃，浸泡时间为8-10h。

4.清水冲洗：将幼芽从离心管中取出，放进合适的发芽盒中，并立即用清水冲洗，随后将废弃的秋水仙素溶液倒进固定的废液桶中并处理。清水冲洗时间1小时以上。

5.缓苗：将幼芽移栽在育苗钵中，并放置在阴凉通风处进行缓苗。缓苗期间注意适时适量浇水。缓苗期间温度20-28℃。

6.移栽：待幼苗长至2-3叶期的时候，及时将其移栽在试验田中。移栽前，向育苗钵中浇足量的水分，使营养土能够凝成一团，不至于从幼苗上脱落。然后将其移栽在条穴中，移栽后，及时大量浇水，确保成活。待苗情稳定之后，参照大田模式进行田间管理。

所述的玉米单倍体幼芽从芽的基部到芽尖端的长度为1.5cm-2.5cm，或1.5cm，或2.0cm，或2.5cm。

本发明的方法中，使得幼芽从胚芽起浸泡约0.5-2.0cm的高度，从而避免使除了胚芽之外的其他部位(尤其是根部)受到伤害。

本发明所提供的玉米单倍体加倍技术能显著地提高玉米单倍体的成活率和结实率，成活率高达70％以上，远远高于作为对照的成活率(一般50％以下)，结实率10％以上，远远高于对照的结实率(一般5％左右)，而且减少秋水仙素的使用量5倍以上。此方法解决了单倍体加倍过程中成活率低和结实率低这一关键技术难题，从而大大提高了单倍体加倍效率，实现单倍体育种技术的规模化和工程化。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂、种子均为常规市售，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1玉米单倍体加倍方法与对照试验(1)

本实施例所提供的玉米单倍体加倍方法由如下步骤组成：

1.种子发芽：将单倍体种子清洗干净，均匀地摆放在铺有湿毛巾的发芽盘中，放置在25℃的培养箱中暗光培养4天，并及时补充水分。

2、胚芽鞘顶端切除：待玉米单倍体幼芽长至2cm时，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽。

3、幼芽浸泡：取离心管，在每个离心管中加入500μL 0.6mg/mL的秋水仙素溶液(配以终浓度为2.0％二甲基亚砜)，紧接着将已经切除胚芽鞘顶端的幼芽倒着放进离心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面。为了防止幼芽根部脱水，用湿纸巾或湿毛巾覆盖幼苗根部。整个操作过程在23℃进行，浸泡8h。

4、清水冲洗：将幼芽从离心管中取出，放进合适的发芽盒中，并立即用清水冲洗，随后将废弃的秋水仙素溶液倒进固定的废液桶中并处理。清水冲洗时间13h。

5、缓苗：将幼芽移栽在育苗钵中，并放置在阴凉通风处进行缓苗。缓苗期间注意适时适量浇水。缓苗期间温度25℃。

6、移栽：待幼苗长至2-3叶期的时候，及时将其移栽在试验田中。移栽前，向育苗钵中浇足量的水分，使营养土能够凝成一团，不至于从幼苗上脱落。然后将其移栽在条穴中，移栽后，及时大量浇水，确保成活。待苗情稳定之后，田间管理与大田基本相同。

7、对照组1：取0.6mg/mL浓度的秋水仙素(配以2.0％二甲基亚砜)，处理100粒单倍体幼芽，将幼芽整个部分包括幼芽根部浸泡在秋水仙素混合液中，需要秋水仙素混合液300mL。

而本发明方法用0.6mg/mL浓度的秋水仙素(配以终浓度为2.0％二甲基亚砜)，处理100粒单倍体幼芽，需要秋水仙素混合液50mL，即每1粒单倍体幼芽需要秋水仙素混合液500μL。结果表明：本发明实施例1所提供的玉米单倍体成活率为75％，而对照组1的成活率为45％，本发明实施例1玉米单倍体的结实率15％，对照组1的结实率为5％。可见使用本发明方法较幼芽全部浸泡法能够减少秋水仙素使用量5倍，且玉米单倍体加倍过程中成活率和结实率均显著高于对照组，取得了优异的效果。

实施例2玉米单倍体加倍方法与对照试验(2)

本实施例所提供的玉米单倍体加倍方法由如下步骤组成：

1、种子发芽：将单倍体种子清洗干净，均匀地摆放在铺有湿毛巾的发芽盘中，放置在20℃的培养箱中暗光培养5天，并及时补充水分。

2、胚芽鞘顶端切除：待玉米单倍体幼芽长至3cm时，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽。

3、幼芽浸泡：取离心管，在每个离心管中加入300μL0.8mg/mL的秋水仙素溶液(配以终浓度为1％二甲基亚砜)，紧接着将已经切除胚芽鞘顶端的幼芽倒着放进离心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面。为了防止幼芽根部脱水，用湿纸巾或湿毛巾覆盖幼苗根部。整个操作过程在18℃进行。浸泡10h。

4、清水冲洗：将幼芽从离心管中取出，放进合适的发芽盒中，并立即用清水冲洗，随后将废弃的秋水仙素溶液倒进固定的废液桶中并处理。清水冲洗时间2h。

5、缓苗：将幼芽移栽在育苗钵中，并放置在阴凉通风处进行缓苗。缓苗期间注意适时适量浇水。缓苗期间温度20℃。

6、移栽：待幼苗长至2-3叶期的时候，及时将其移栽在试验田中。移栽前，向育苗钵中浇足量的水分，使营养土能够凝成一团，不至于从幼苗上脱落。然后将其移栽在条穴中，移栽后，及时大量浇水，确保成活。待苗情稳定之后，田间管理与大田基本相同。

7、对照组2：用0.8mg/mL浓度的秋水仙素(配以终浓度为1.0％二甲基亚砜)处理幼芽，将幼芽整个部分浸泡在秋水仙素混合液中，其他步骤和参数处理同本实施例处理玉米单倍体幼芽样品，作为对照，对其各指标进行检测，并与本实施例效果进行对比。

结果表明：本发明实施例2所提供的玉米单倍体成活率为80％，而对照组2的成活率为49％，本发明实施例2玉米单倍体的结实率20％，对照组2的结实率为6％。可见本发明的幼芽上部浸泡法能够比幼芽全部浸泡法在玉米单倍体加倍过程中成活率和结实率方面获得显著提高。

实施例3玉米单倍体加倍方法与对照试验(3)

本实施例所提供的玉米单倍体加倍方法由如下步骤组成：

1、种子发芽：将单倍体种子清洗干净，均匀地摆放在铺有湿毛巾的发芽盘中，放置在28℃的培养箱中暗光培养3天，并及时补充水分。

2、胚芽鞘顶端切除：待玉米单倍体幼芽长至3cm时，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽。

3、幼芽浸泡：取离心管，在每个离心管中加入500μL0.4mg/mL的秋水仙素溶液(配以终浓度为5％二甲基亚砜)，紧接着将已经切除胚芽鞘顶端的幼芽倒着放进离心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面。为了防止幼芽根部脱水，用湿纸巾或湿毛巾覆盖幼苗根部。整个操作过程要求在25℃进行，浸泡6h。

4、清水冲洗：将幼芽从离心管中取出，放进合适的发芽盒中，并立即用清水冲洗，随后将废弃的秋水仙素溶液倒进固定的废液桶中并处理。清水冲洗时间10h。

5、缓苗：将幼芽移栽在育苗钵中，并放置在阴凉通风处进行缓苗。缓苗期间注意适时适量浇水。缓苗期间温度28℃。

6、移栽：待幼苗长至2-3叶期的时候，及时将其移栽在试验田中。移栽前，向育苗钵中浇足量的水分，使营养土能够凝成一团，不至于从幼苗上脱落。然后将其移栽在条穴中，移栽后，及时大量浇水，确保成活。待苗情稳定之后，田间管理与大田基本相同。

7、对照组3：用500μL、1.5mg/mL浓度的秋水仙素(配以终浓度为2.0％二甲基亚砜)处理幼芽，以同样步骤和同样的参数处理对照玉米单倍体幼芽样品，作为对照，对其各指标进行检测，并与本发明进行对比。

结果表明：本发明实施例3所提供的玉米单倍体成活率为73％，而对照组3的成活率为45％，本发明实施例3玉米单倍体的结实率13％，对照组3的结实率为5％。可见本发明选择的秋水仙素浓度较其他浓度的秋水仙素混合液能够显著提高玉米单倍体加倍过程中的成活率和结实率。

上述实施例及其结果表明：本发明所提供的玉米单倍体加倍技术能显著地提高玉米单倍体的成活率和结实率，成活率高达70％以上，远远高于作为对照的成活率(一般50％以下)，结实率10％以上，远远高于对照的结实率(一般5％左右)，而且减少秋水仙素的使用量5倍以上。本发明的方法解决了单倍体加倍过程中成活率低和结实率低这一关键技术难题，从而大大提高了单倍体加倍效率，实现单倍体育种技术的规模化和工程化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种植物单倍体加倍方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)切除植物单倍体幼芽胚芽鞘尖端；

2)用秋水仙素和二甲基亚砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的植物单倍体幼芽的胚芽部分，通过该部分浸泡措施，得到染色体加倍的幼芽。

2.如权利要求1所述的单倍体加倍方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

3.如权利要求1或2任意一项所述的单倍体加倍方法，其特征在于，所述秋水仙素和二甲基亚砜混合液中，秋水仙素的终浓度为：0.4-0.8mg/mL，二甲基亚砜终浓度为1％-5％；秋水仙素混合液的使用量为：300-1000μl。

4.如权利要求1或2任意一项所述的单倍体加倍方法，其特征在于，所述浸泡步骤中，仅留单倍体幼芽的胚芽部分浸泡在混合液中，幼芽根部露在混合液外。

5.一种玉米单倍体加倍方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)切除玉米单倍体幼芽胚芽鞘尖端；

2)将已经切除了胚芽鞘尖端的幼芽倒着放入离心管中，用秋水仙素配以二甲基亚砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽的胚芽部份，通过该部分浸泡措施，得到染色体加倍的玉米幼芽。

6.如权利要求5所述的玉米单倍体加倍方法，其特征在于，所述用秋水仙素混合液浸泡过程中，每个离心管中加入300-1000μL0.4-0.8mg/mL的秋水仙素溶液，所述秋水仙素溶液中还配有终浓度为1％-5％的二甲基亚砜；将已经切除胚芽鞘尖端的幼芽根部朝上倒着放进离心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面，整个操作过程要求在18-25℃之间进行，浸泡6-10h。

7.如权利要求5或6任意一项所述的玉米单倍体加倍方法，其特征在于用秋水仙素混合液浸泡过程中，为了防止幼芽根部脱水，用湿纸巾或湿毛巾覆盖幼苗根部。

8.一种玉米单倍体加倍方法，由下述步骤组成：

1)种子发芽：将单倍体种子清洗干净，均匀地摆放在铺有湿毛巾的发芽盘中，放置在20-28℃的适宜环境中暗光培养3-5天，并及时补充水分；

2)胚芽鞘顶端切除：待玉米单倍体幼芽长至1-3cm时，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽；

3)幼芽浸泡：取离心管，在每个离心管中加入300-1000μL秋水仙素混合溶液，其中含终浓度为0.4-0.8mg/mL的秋水仙素和1％-5％的二甲基亚砜，将已经切除胚芽鞘顶端的幼芽倒着放进离心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面，为了防止幼芽根部脱水，用湿纸巾或湿毛巾覆盖幼苗根部，整个操作过程要求在18-25℃之间进行，浸泡6-10h；

4)清水冲洗：将幼芽从离心管中取出，放进发芽盒中，并立即用清水冲洗，随后将废弃的秋水仙素溶液倒进固定的废液桶中并处理，清水冲洗时间1小时以上；

5)缓苗：将幼芽移栽在育苗钵中，并放置在阴凉通风处进行缓苗，缓苗期间注意适时适量浇水，缓苗期间温度20-28℃；

6)移栽：待幼苗长至2-3叶期的时候，及时将其移栽在试验田中；移栽前，向育苗钵中浇足量的水分，使营养土能够凝成一团，不至于从幼苗上脱落；然后将其移栽在条穴中，移栽后，及时大量浇水，确保成活；待苗情稳定之后，参照大田模式进行田间管理。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3)所述秋水仙素混合溶液中，含终浓度为0.6mg/mL的秋水仙素和2％的二甲基亚砜。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3)所述整个操作过程温度为22-25℃，浸泡时间为8-10h。