CN115067208A - 一种利用赤霉素提高玉米单倍体加倍效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用赤霉素提高玉米单倍体加倍效率的方法，属于育种领域。本发明所提供的玉米单倍体加倍的方法通过在幼胚加倍过程中外施赤霉素，可有效提高秋水仙素处理加倍率，大大提高单倍体加倍散粉率和结实率，从而提高DH生产效率。为提高秋水仙素作用的单倍体幼胚加倍效率提供了一个可行的方案，可大大提升单倍体育种技术的效率。

Description

一种利用赤霉素提高玉米单倍体加倍效率的方法
技术领域
本发明属于育种领域，具体涉及一种利用赤霉素提高玉米单倍体加倍效率的方法。
背景技术
玉米作为我国第一大作物被广泛种植，也是目前杂种优势利用最为彻底的物种之一。杂种优势的利用关键在于纯合亲本的选育，常规的育种手段，多采取自交或回交的方式对材料进行纯化，一般需要7代以上。而基于孤雌生殖的玉米单倍体育种，可在2代获得纯系，从而被广泛应用于商业化育种中。单倍体育种技术包括单倍体诱导、鉴别、加倍和DH(doubled haploid)管理四个部分。其中单倍体的诱导和鉴别由单倍体诱导系和相应的单倍体鉴别标记决定。随着单倍体诱导基因的克隆和R1-nj标记的使用，单倍体的大量获得已不再是单倍体育种的限速步骤。单倍体的加倍效率是单倍体育种的关键环节，即DH的生产效率是影响单倍体育种效率的重要因素之一。目前应用最为广泛的单倍体加倍方法为浸芽法和单倍体幼胚组培加倍法。相比于浸芽法，单倍体幼胚加倍效率较高，是工厂化生产DH的最佳方式之一。高效的加倍方法还需与高效的加倍试剂相结合。目前常用的单倍体加倍试剂包括秋水仙素和除草剂两类。其中秋水仙素加倍效果明显优于除草剂，被广泛应用。单倍体的加倍包括单倍体的雄穗加倍和雌穗加倍两个方面，雄穗加倍直接决定单倍体加倍处理后的散粉率，雌穗加倍决定结实率，单倍体需雌雄同时加倍才可正常结实获得DH。因此保证单倍体高频的散粉率和结实率，是提高玉米单倍体加倍效率的关键。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何解决秋水仙素进行单倍体幼胚加倍时存在DH生产效率低的问题。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供提高玉米单倍体加倍效率的方法，所述方法包括用玉米单倍体加倍剂对玉米单倍体幼胚加倍，得到染色体加倍的玉米；其特征在于：所述玉米单倍体加倍剂的活性成分为秋水仙素、二甲基亚砜和赤霉素。
进一步地，上述的方法中，所述玉米单倍体加倍剂中，所述秋水仙素、二甲基亚砜和赤霉素的配比为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:0.1-50mg赤霉素。
进一步地，上述的方法中，所述玉米单倍体加倍剂中，所述秋水仙素、二甲基亚砜和赤霉素的配比为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:0.5-50mg赤霉素。
进一步地，上述的方法中，所述玉米单倍体加倍剂中，所述秋水仙素、二甲基亚砜和赤霉素的配比为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:0.5mg赤霉素或5.0mg赤霉素或50mg赤霉素。
进一步地，上述的方法中，所述用玉米单倍体加倍剂对玉米单倍体幼胚加倍包括以下步骤：将玉米单倍体幼胚接种于含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基中进行加倍处理。
进一步地，上述的方法中，所述赤霉素在含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基的含量为0.1mg/L-50mg/L，具体为0.5mg/L-50mg/L，更具体为0.5mg/L或5.0mg/L或50mg/L。
为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供上述方法中的所述玉米单倍体加倍剂。
为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供下述应用
P1)上述的玉米单倍体加倍剂在提高玉米单倍体幼胚加倍率中的应用或在玉米单倍体育种中的应用；
P2)秋水仙素、二甲基亚砜和赤霉素在制备玉米单倍体加倍剂中的应用或在玉米单倍体育种中的应用或在提高玉米单倍体加倍效率中的应用。
P3)赤霉素在制备玉米单倍体加倍剂中的应用或在玉米育种中的应用或在提高玉米单倍体加倍效率中的应用。
所述提高玉米单倍体加倍效率可为提高秋水仙素的玉米单倍体中染色体加倍的效率。
本发明中，所述玉米单倍体幼胚为以单倍体诱导系为父本和被诱导材料杂交后，授粉后第12-20天剥取的玉米单倍体幼胚，具体可为授粉后第15天剥取的玉米单倍体幼胚。
本发明所提供的利用赤霉素提高玉米单倍体加倍效率的方法具体包括以下步骤：
首先获得具备高频化学加倍的种质，即利用化学药剂，例如秋水仙素，处理后易加倍的自交系。以该材料为被诱导材料，以携带R1-nj颜色标记的诱导系为父本。取诱导系花粉与被诱导材料授粉，同时记录授粉时间。授粉后同一天取诱导杂交果穗，进行剥胚，分别放置于对照培养基和加倍培养基上进行处理。
加倍处理后，分别从对照培养基和加倍培养基中挑选盾片无色的单倍体幼胚，进行转录组测序，比较对照组与加倍组单倍体幼胚差异表达基因及其富集通路，挖掘影响单倍体加倍的关键物质。
结合转录组结果，对所挖掘可能影响单倍体加倍效率的关键物质与常规加倍剂相结合，对其他遗传背景材料单倍体幼胚进行处理，同时设置空白对照、不同含量梯度对照，对不同加倍剂处理的单倍体进行成苗，结合散粉率、结实率和DH生产率等重要指标，最终获得可用于提高单倍体加倍效率的加倍剂。
上述方法中，所述具备高频化学加倍的种质可为秋水仙素处理后易加倍的自交系，例如B73、郑58、齐319等自交系中的任一种。
上述方法中，所述单倍体诱导系父本可选自具有R1-nj标记的单倍体诱导系中的任一种，例如CAU5。
上述方法中，所述用玉米单倍体加倍剂对玉米单倍体幼胚加倍包括以下步骤：
1)将玉米被诱导材料作为母本，以具有R1-nj标记的单倍体诱导系作为父本进行人工授粉杂交；
2)授粉后第12-20天取杂交果穗剥离幼胚，接种于所述含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基及相应不含有加倍试剂的对照培养基中进行加倍处理；
3)在处理12小时-72小时后的幼胚中挑选盾片颜色为无色的单倍体幼胚，进行成苗培养，
4)将成苗培养所得的幼苗定植后，自交获得单倍体染色体加倍的玉米DH种子。
上述方法中，所述人工授粉杂交，为确保父母本花期相遇，可将母本种植一期，父本可围绕母本播期播种多期(例如2-3期)。所述人工授粉杂交，母本花期去雄(剪去花丝)，雌穗严格套袋，取父本花粉人工过量授粉，记录授粉时间。
上述方法中，所述加倍处理的培养条件为全光照、温度26℃左右，湿度60％左右。
上述方法中，所述成苗培养采用常见植物组培的基础培养基，例如MS固体培养基、1/2MS固体培养基中的任一种。
上述方法中，所述成苗培养的时间可为2天-7天，具体可为4天。
上述方法中，所述成苗培养的培养条件为16小时光期/8小时暗期交替、温度26℃左右，湿度60％左右。
上述方法中，所述将成苗培养所得的幼苗定植，为定植到大田中，定植前可先进行缓苗炼苗，具体为：正常胚苗长至2-3叶一心后移栽至装有草炭土的营养钵中缓苗炼苗，长至5叶一心后定植到大田中。
上述方法中，所述对照培养基采用常见植物组培的基础培养基作为基础培养基，例如MS固体培养基、N6固体培养基中的一种。
上述方法中，所述玉米单倍体加倍剂的培养基为，在基础培养基的基础上，添加含量可为0.05-0.4g/L的秋水仙素和体积百分含量可为2％的二甲基亚砜。
上述方法中，所述玉米单倍体幼胚为以单倍体诱导系为父本和被诱导材料杂交后，授粉后第12-20天剥取的玉米单倍体幼胚，具体可为授粉后第15天剥取的玉米单倍体幼胚。
上述方法中，所述加倍处理的时间可为12小时-72小时，具体可为24小时。
上述方法中，所述结合转录组测序结果挖掘的影响单倍体加倍的关键物质可为赤霉素，可来源于已发现的赤霉素A1-A126的一种或多种，具体为Gibberellic Acid 3，简称GA3。
上述方法中，所述关键物质赤霉素与常规加倍剂(0.05-0.4g/L的秋水仙素和体积百分含量可为2％的二甲基亚砜)的结合对其他背景材料单倍体处理进行效果验证，秋水仙素、二甲基亚砜和赤霉素的配比可为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:0.1-50mg赤霉素，具体可为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:0.5-50mg赤霉素，更具体可为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:0.5mg赤霉素或5.0mg赤霉素或50mg赤霉素。
本发明所提供的玉米单倍体加倍的方法通过在幼胚加倍过程中外施赤霉素，可有效提高秋水仙素处理加倍率，大大提高单倍体加倍散粉率和结实率，从而提高DH生产效率。为提高秋水仙素作用的单倍体幼胚加倍效率提供了一个可行的方案，可大大提升单倍体育种技术的效率。
附图说明
图1为实施例1中非加倍组(CK)与加倍组(Q1)差异表达基因富集与赤霉素转导途径。图1中A为差异表达基因KEGG富集图；图1中B为赤霉素转运通路差异表达基因表达量比较；图1中C为赤霉素转运通路，其中绿色框表示标记的酶与相关基因下调有关。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施案例中的玉米(Zea mays L.)单倍体高频化学加倍材料B73(下文简称B73)，在文献“刘治先,赵宝和,韩静,刘朋.美国玉米自交系的种质基础分析[J].山东农业科学,2003(05):23-25.”中公开过，公众可从北京市农林科学院获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的玉米(Zea mays L.)单倍体诱导系CAU5具有R1-nj标记，为中国农业大学陈绍江老师课题发放，在文献“焦炎炎.玉米单倍体诱导系评价及当代遗传效应研究.[D].中国农业大学,2017.”中公开过，公众可从申请人处获得该材料，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
以下实施例中玉米自交系京黄欧1号和京J2418为本实验保存，玉米(Zea maysL.)自交系京黄欧1号(植物新品种权申请号20201000753)与京J2418(植物新品种权申请号20201000757)均由北京市农林科学院玉米研究所自选育，公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的蔗糖和琼脂糖均为北京吉普腾生物技术有限公司产品。
下述实施案例中的GA3为赤霉素，其CAS号为77-06-5，GA3和秋水仙素均为北京博友航生物科技有限公司产品。
下述实施案例中，加倍鉴别培养基的构成为MS固体培养基+玉米单倍体加倍剂(由MS固体培养基和玉米单倍体加倍剂组成)，其中MS固体培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，pH值为5.8的培养基(即配方为MS盐3.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH＝5.8)，其余为水；MS盐是上海宇涵生物科技有限公司的产品，产品目录号为140225。
玉米单倍体加倍剂的活性成分包括赤霉素、秋水仙素和二甲基亚砜(DMSO)，各组分的添加量具体可见Q1、Q1+T1、Q1+T2和Q1+T3组的培养基组成，秋水仙素的含量为0.04-0.5g/L，、DMSO的含量为20mL/L，赤霉素的含量为0.5-50g/L。
所述赤霉素来源于GA3，GA3根据实验需求设置不同的含量，例如：
CK:GA3含量为0mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L、GA3的含量为0mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
CK+G1:GA3含量为0.5mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L、GA3的含量为0.5mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
CK+G2:GA3含量为5.0mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L、GA3的含量为5.0mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
CK+G3:GA3含量为50mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L、GA3的含量为50mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
Q1:GA3含量为0mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，GA3的含量为0mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
Q1+G1:GA3含量为0.5mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，GA3的含量为0.5mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
Q1+G2:GA3含量为5.0mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，GA3的含量为5.0mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
Q1+G3:GA3含量为50mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，GA3的含量为50mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
下述实施案例中，成苗培养基为1/2MS固体培养基，具体是含有MS盐的含量为1.5g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，其余为水，pH值为5.8的培养基(即配方为MS盐1.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH＝5.8)。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1、单倍体加倍的机制探究与关键影响物挖掘
1.玉米单倍体幼胚的诱导
2021年在北京，以B73作为母本(被诱导材料)，以诱导系CAU5作为父本诱导单倍体。父本CAU5分两期种植，第一期于4月25日播种，第二期于4月30日播种；母本播期与第一期父本相同，以便花期相遇。母本统一剪花丝，严格去雄，用父本诱导系进行过量授粉，同时记录统一授粉时间。在授粉后15天(记为DAP15天)的幼胚为材料，进行幼胚体外培养。
2.玉米单倍体幼胚鉴别及加倍
将步骤1所得的北京DAP15天的幼胚进行如下2组处理：
CK(对照组)：具体是在含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，其余为水，pH值为5.8的培养基中进行培养。
Q1(处理组)：具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，其余为水，pH值为5.8的培养基中进行培养的。
各处理组培养时间均为24小时。培养条件为全光照、温度26℃左右，湿度60％。CAU5均具有R1-nj标记，幼胚培养24小时后，杂合二倍体幼胚的盾片由于携带有R1-nj标记而呈现紫红色，单倍体幼胚及双单倍体(DH)幼胚仅含有母本材料的一套染色体，不含R1-nj标记，因此单倍体幼胚的盾片呈现无色。根据盾片颜色挑选出单倍体幼胚，并接种到成苗培养基上进行成苗培养。培养条件为16小时光期/8小时暗期交替、温度26℃左右，湿度60％左右。置于培养室中，进行成苗培养4天。另外，分别挑选CK与Q1中单倍体幼胚各3份，每份500mg以上，放置于液氮中，并保存在-80冰箱中，用于转录组测序。
3.单倍体幼胚加倍转录组测序
对上述CK和Q1处理24小时后的各3个重复进行转录组测序，而后筛选差异表达基因并进行KEGG富集，结果发现相比于非加倍的对照组，加倍处理后差异表达基因除富集到氨基酸代谢、蛋白酶体等染色体加倍相关通路外，还显著富集到植物激素信号转导(图1中A)，进一步分析发现，秋水仙素处理可是赤霉素转导通路中的编码Della蛋白的基因(Zm00001eb118950和Zm00001eb141310)和转录因子(Zm00001eb059460)表达量显著下调(图1中B和C)。从而改变幼胚赤霉素含量，由此猜测赤霉素含量的变化可能影响单倍体加倍效率。
实施例2外施赤霉素对单倍体幼胚加倍效率的影响
为进一步验证赤霉素对单倍体加倍的影响，我们采用外施赤霉素的方式在加倍培养基中添加不同含量赤霉素。以京黄欧1号为母本，进行单倍体化学加倍效果验证，具体试验安排时间如下：
2022年在海南，以京黄欧1号作为母本(被诱导材料)，以诱导系CAU5作为父本诱导单倍体。母本京黄欧1号均于10月15日播种。父本错两期，分别于10月15日和20日播种。母本统一剪花丝，严格去雄，用父本诱导系进行过量授粉，同时记录授粉。授粉后15天剥取幼胚。分别在如下各组的培养基中培养：
CK:GA3含量为0mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，GA3的含量为0mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
CK+G1:GA3含量为0.5mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，GA3的含量为0.5mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
CK+G2:GA3含量为5.0mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，GA3的含量为5.0mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
CK+G3:GA3含量为50mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，GA3的含量为50mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
Q1:GA3含量为0mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，GA3的含量为0mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
Q1+G1:GA3含量为0.5mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，GA3的含量为0.5mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
Q1+G2:GA3含量为5.0mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，GA3的含量为5.0mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
Q1+G3:GA3含量为50mg/L的加倍鉴别培养基，具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的含量为2％(v/v)，GA3的含量为50mg/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。
各处理组培养时间均为24小时。培养条件为全光照、温度26℃左右，湿度60％左右。CAU5具有R1-nj标记，幼胚培养24小时后，杂合二倍体幼胚的盾片由于携带有R1-nj标记而呈现紫红色，单倍体幼胚及双单倍体(DH)幼胚仅含有母本材料的一套染色体，不含R1-nj标记，因此单倍体幼胚的盾片呈现无色。根据盾片颜色挑选出单倍体幼胚(幼胚的盾片呈现无色)，并接种到成苗培养基上进行成苗培养。成苗培养基成分为1/2MS固体培养基，具体是含有MS盐的含量为1.5g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，pH值为5.8的培养基。培养条件为16小时光期/8小时暗期交替、温度26℃左右，湿度60％左右。置于培养室中，进行成苗培养7天。而后进行室外炼苗，至幼苗3-5叶期进行田间移栽，待单倍体植株抽雄吐丝时，对各处理雄穗露药和散粉登记进行调查，具体调查指标参照Penghao Wu et al,NewInsights into the Genetics of Haploid Male Fertility in Maize 2017。雌穗严格套袋，单倍体散粉后严格自交，成熟收获后，统计单倍体露药得分、散粉得分、散粉率、结实率、平均结实数、DH生产率等关键指标，对各处理单倍体加倍效率进行评价。单倍体自交所得籽粒为双单倍体(DH)。具体结果见表1。
散粉率＝散粉单倍体株数/总单倍体株数×100％
结实率＝结实单倍体株数/散粉单倍体株数×100％
DH生产率＝结实单倍体株数/总单倍体株数×100％。
表1.不同含量GA3对单倍体幼胚加倍的影响
Figure BDA0003759642350000091
通过比较不同含量GA3对单倍体幼胚加倍情况可知，在不添加秋水仙素或单独添加不同含量GA3时，京黄欧1号露药得分和散粉得分均低于0.5，散粉率仅CK+G1达到20.44％，其余均处理组均低于20％，最终DH生产率也在10％以下。在常规加倍培养基Q1处理下，单倍体散粉率为65.15％，最终DH生产率为42.42％。相比于Q1，在外施GA3的基础上，Q1+G1与Q1+G2处理组在散粉率、平均结实数、平均结实率和DH生产率均明显提高，其中Q1+G1处理组DH生产率高达62.86％。Q1+G3处理组与Q1相比，散粉率有所降低，但最终散粉率、平均结实数、平均结实率和DH生产率均高于Q1处理组。综上所述，外施不同含量GA3结合常规加倍剂的处理下，可有效改善单倍体加倍结实率、平均结实数和最终的DH生产率。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、含量和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.提高玉米单倍体加倍效率的方法，所述方法包括用玉米单倍体加倍剂对玉米单倍体幼胚加倍，得到染色体加倍的玉米；其特征在于：所述玉米单倍体加倍剂的活性成分为秋水仙素、二甲基亚砜和赤霉素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述玉米单倍体加倍剂中，所述秋水仙素、二甲基亚砜和赤霉素的配比为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:0.1-50mg赤霉素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述玉米单倍体加倍剂中，所述秋水仙素、二甲基亚砜和赤霉素的配比为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:0.5-50mg赤霉素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述玉米单倍体加倍剂中，所述秋水仙素、二甲基亚砜和赤霉素的配比为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:0.5mg赤霉素或5.0mg赤霉素或50mg赤霉素。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述用玉米单倍体加倍剂对玉米单倍体幼胚加倍包括以下步骤：将玉米单倍体幼胚接种于含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基中进行加倍处理。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述赤霉素在含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基中的含量为0.1mg/L-50mg/L，具体为0.5mg/L-50mg/L，更具体为0.5mg/L或5.0mg/L或50mg/L。
7.权利要求1-6中任一项所述方法中的所述玉米单倍体加倍剂。
8.权利要求7所述的玉米单倍体加倍剂在提高玉米单倍体幼胚加倍率中的应用或在玉米单倍体育种中的应用。
9.秋水仙素、二甲基亚砜和赤霉素在制备玉米单倍体加倍剂中的应用或在玉米单倍体育种中的应用或在提高玉米单倍体加倍效率中的应用。
10.赤霉素在制备玉米单倍体加倍剂中的应用或在玉米育种中的应用或在提高玉米单倍体加倍效率中的应用。
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