CN115088615B - 一种利用谷胱甘肽提高玉米单倍体加倍效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用谷胱甘肽提高玉米单倍体加倍效率的方法。本发明所提供的玉米单倍体加倍的方法通过在幼胚加倍过程中外施谷胱甘肽，可有效提高秋水仙素处理加倍率，有效提高单倍加倍体散粉率和结实率，从而提高DH生产效率。为提高秋水仙素作用的单倍体幼胚加倍效率提供了一个可行的方案，可大大提升单倍体育种技术的效率。

Description

一种利用谷胱甘肽提高玉米单倍体加倍效率的方法
技术领域
本发明属于育种领域，具体涉及一种利用谷胱甘肽提高玉米单倍体加倍效率的方法。
背景技术
玉米具有饲料、食用、食品加工及清洁能源等用途。近年来，随着玉米的种植规模和产量的不断提高，它已成为我国最重要的作物之一。选育优良的自交系尤为重要。目前，国内外选育自交系的方法主要有轮回选择法、回交改良法、二环系选育法和单倍体育种技术等。其中，单倍体育种技术是用单倍体诱导系诱导普通母本材料，在其后代杂交果穗上可获得一定比例的单倍体籽粒，而后对单倍体进行加倍形成双单倍体(DH)纯系。单倍体技术经过两个世代就可获得理论上的纯系，而利用传统选系方法，一般需要7代以上。相对而言，单倍体育种技术可以缩短育种年限，加快进程，节约人力物力。但无论那种方式获得的玉米纯系，均需要对其进行评价和组配，只有纯系之间进行有效组合，才能利用其产量、农艺性状等方面的杂种优势，进而对玉米生产产生重要意义。单倍体育种技术包括单倍体产生、鉴别、加倍、DH系评价与应用等环节，其中，单倍体的产生是基础，准确快速的鉴别和高效的加倍是关键，优良DH系的获得是目的。因此提高玉米单倍体加倍效率可有效提高单倍体育种效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何解决秋水仙素进行单倍体幼胚加倍时存在DH生产效率低的问题。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供应用，所述应用选自下述任一种：
A1)、谷胱甘肽在玉米单倍体幼胚加倍中的应用；
A2)、谷胱甘肽在制备玉米单倍体幼胚加倍剂的产品中的应用；
A3)、谷胱甘肽在玉米单倍体育种中的应用；
A4)、谷胱甘肽在制备玉米单倍体育种的产品中的应用；
A5)谷胱甘肽在提高玉米单倍体加倍效率中的应用；
A6)、谷胱甘肽在植物育种中的应用。
所述提高玉米单倍体加倍效率可为提高秋水仙素对玉米单倍体的染色体加倍效率。
为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供提高玉米单倍体加倍效率的方法，所述方法包括使用玉米单倍体加倍剂处理玉米单倍体幼胚，得到染色体加倍的玉米；
所述玉米单倍体加倍剂的活性成分包括秋水仙素、二甲基亚砜和谷胱甘肽。
进一步地，所述玉米单倍体加倍剂的活性成分可为秋水仙素、二甲基亚砜(DMSO)和谷胱甘肽。
进一步地，上述的方法中，使用玉米单倍体加倍剂对玉米单倍体幼胚加倍包括将玉米单倍体幼胚接种于含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基中培养的步骤。
进一步地，上述的方法中，所述含有玉米单倍体加倍剂的培养基中所述秋水仙素的含量为0.1g/L，所述DMSO的体积含量为20mL/L，所述谷胱甘肽的含量为1.0-3.0mg/L。
进一步地，上述的方法中，所述含有玉米单倍体加倍剂的培养基组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，所述秋水仙素的含量为0.1g/L、所述DMSO的含量为20mL/L，所述谷胱甘肽的含量为1.0-3.0mg/L，其余为水。
进一步地，上述的方法中，所述将玉米单倍体幼胚接种于含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基中进行培养的培养时间为24小时，所述培养条件为全光照、温度26℃，湿度60％。
第三个方面，本发明提供上述的玉米单倍体加倍剂。
第四个方面，本发明提供上述的玉米单倍体加倍剂的应用，所述应用选自下述任一种：
P1)、所述的玉米单倍体加倍剂在玉米单倍体幼胚加倍中的应用；
P2)、所述的玉米单倍体加倍剂在玉米单倍体育种中的应用；
P3)、所述的玉米单倍体加倍剂在植物育种中的应用。
所述玉米单倍体加倍剂为使玉米单倍体染色体加倍的组合物。
本发明所提供的一种利用谷胱甘肽提高玉米单倍体加倍效率的方法具体包括以下步骤：
首先获得具备高频化学加倍的种质，即利用化学药剂，例如秋水仙素，处理后易加倍的自交系。以该材料为被诱导材料，以携带R1-nj颜色标记的诱导系为父本。取诱导系花粉与被诱导材料授粉，同时记录授粉时间。授粉后同一天取诱导杂交果穗，进行剥胚，分别放置于对照培养基和加倍培养基上进行处理。
加倍处理后，分别从对照培养基和加倍培养基中挑选盾片无色的单倍体幼胚，进行转录组测序，比较对照组与加倍组单倍体幼胚差异表达基因，并进行分析，从而挖掘影响单倍体加倍的关键物质。
结合转录组测序结果，对所挖掘可能影响单倍体加倍效率的关键物质与常规加倍剂相结合，对其他遗传背景材料单倍体幼胚进行处理，同时设置空白对照、不同含量梯度对照，对不同加倍剂处理的单倍体进行成苗，结合散粉率、结实率和DH生产率等重要指标，最终获得可用于提高单倍体加倍效率的加倍剂。
上述方法中，所述具备高频化学加倍的种质可为秋水仙素处理后易加倍的自交系，例如B73、齐319等自交系中的任一种。
上述方法中，所述单倍体诱导系父本可选自具有R1-nj标记的单倍体诱导系中的任一种，例如CAU5。
上述方法中，所述用玉米单倍体加倍剂对玉米单倍体幼胚加倍包括以下步骤：
1)将玉米被诱导材料作为母本，以具有R1-nj标记的单倍体诱导系作为父本进行人工授粉杂交；
2)授粉后第12-20天取杂交果穗剥离幼胚，接种于所述含有所述玉米单倍体加倍剂的培养基及相应不含有加倍试剂的对照培养基中进行加倍处理；
3)在处理12小时-72小时后的幼胚中挑选盾片颜色为无色的单倍体幼胚，进行成苗培养，
4)将成苗培养所得的幼苗定植后，自交获得单倍体染色体加倍的玉米DH种子。
上述方法中，所述人工授粉杂交，为确保父母本花期相遇，可将母本种植一期，父本可围绕母本播期播种多期(例如2-3期)。所述人工授粉杂交，母本花期去雄(剪去花丝)，雌穗严格套袋，取父本花粉人工过量授粉，记录授粉时间。
上述方法中，所述加倍处理的培养条件为全光照、温度26℃左右，湿度60％左右。
上述方法中，所述成苗培养采用常见植物组培的基础培养基，例如MS固体培养基、1/2MS固体培养基中的任一种。
上述方法中，所述成苗培养的时间可为2天-7天，具体可为4天。
上述方法中，所述成苗培养的培养条件为16小时光期/8小时暗期交替、温度26℃左右，湿度60％左右。
上述方法中，所述将成苗培养所得的幼苗定植，为定植到大田中，定植前可先进行缓苗炼苗，具体为：正常胚苗长至2-3叶一心后移栽至装有草炭土的营养钵中缓苗炼苗，长至5叶一心后定植到大田中。
上述方法中，所述对照培养基采用常见植物组培的基础培养基作为基础培养基，例如MS固体培养基、N6固体培养基中的一种。
上述方法中，所述玉米单倍体加倍剂的培养基为，在基础培养基的基础上，添加含量可为0.05-0.4g/L的秋水仙素和体积百分含量可为2％的二甲基亚砜。
上述方法中，所述玉米单倍体幼胚为以单倍体诱导系为父本和被诱导材料杂交后，授粉后第12-20天剥取的玉米单倍体幼胚，具体可为授粉后第15天剥取的玉米单倍体幼胚。
上述方法中，所述加倍处理的时间可为12小时-72小时，具体可为24小时。
上述方法中，所述结合转录组测序结果挖掘的影响单倍体加倍的关键物质可为谷胱甘肽。
上述方法中，所述关键物质谷胱甘肽与常规加倍剂(0.05-0.4g/L的秋水仙素和体积百分含量可为2％的二甲基亚砜)的结合对其他背景材料单倍体处理进行效果验证，秋水仙素、二甲基亚砜和谷胱甘肽的配比可为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:0.5-3.0g谷胱甘肽，具体可为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:1.0-3.0g谷胱甘肽，更具体可为0.05-0.4g秋水仙素:20mL二甲基亚砜:1.0g谷胱甘肽。
本发明所提供的玉米单倍体加倍的方法通过在幼胚加倍过程中外施谷胱甘肽，可有效提高秋水仙素处理加倍率，大大提高单倍体加倍散粉率和结实率，从而提高DH生产效率。为提高秋水仙素作用的单倍体幼胚加倍效率提供了一个可行的方案，可大大提升单倍体育种技术的效率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施案例中的玉米(Zea mays L.)单倍体高频化学加倍材料B73，在文献“刘治先,赵宝和,韩静,刘朋.美国玉米自交系的种质基础分析[J].山东农业科学,2003(05):23-25.”中公开过，公众可从北京市农林科学院获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的玉米(Zea mays L.)单倍体诱导系CAU5具有R1-nj标记，为中国农业大学陈绍江老师课题发放，在文献“焦炎炎.玉米单倍体诱导系评价及当代遗传效应研究.[D].中国农业大学,2017.”中公开过，公众可从申请人处获得该材料，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
以下实施例中玉米自交系京黄欧1号和京J2418为本实验保存，玉米(Zea maysL.)自交系京黄欧1号(植物新品种权申请公告号20201000753)与京J2418(植物新品种权申请公告号20201000757)均由北京市农林科学院玉米研究所自选育，公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的蔗糖和琼脂糖均为北京吉普腾生物技术有限公司产品。
下述实施案例中的谷胱甘肽(CAS号为70-18-8)、秋水仙素均为北京博友航生物科技有限公司产品。
下述实施案例中，加倍鉴别培养基的构成为MS固体培养基+玉米单倍体加倍剂，其中MS固体培养基的组成是：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，其余为水，pH值为5.8的培养基(即配方为MS盐3.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，pH＝5.8)；MS盐是上海宇涵生物科技有限公司的产品，产品目录号为140225。
玉米单倍体加倍剂的活性成分包括谷胱甘肽、秋水仙素和二甲基亚砜(DMSO)，各组分的添加量具体可见Q1、Q1+T1、Q1+T2和Q1+T3组的培养基组成，秋水仙素的含量为0.04-0.5g/L，、DMSO的含量为20mL/L，谷胱甘肽的含量为1.0-3.0g/L。
CK：谷胱甘肽含量为0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，谷胱甘肽的含量为0g/L，其余为水，pH值为5.8。
CK+T1：谷胱甘肽含量为1.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，谷胱甘肽的含量为1.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
CK+T2：谷胱甘肽含量为2.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，谷胱甘肽的含量为2.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
CK+T3：谷胱甘肽含量为3.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，谷胱甘肽的含量为3.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
Q1：谷胱甘肽含量为0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的体积含量为20mL/L，谷胱甘肽的含量为0g/L，其余为水，pH值为5.8。
Q1+T1：谷胱甘肽含量为1.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的体积含量为20mL/L，谷胱甘肽的含量为1.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
Q1+T2：谷胱甘肽含量为2.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的体积含量为20mL/L，谷胱甘肽的含量为2.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
Q1+T3：谷胱甘肽含量为3.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的体积含量为20mL/L，谷胱甘肽的含量为3.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1、单倍体加倍的机制探究与关键影响物挖掘
1.玉米单倍体幼胚的诱导
2021年在北京，以B73作为母本(被诱导材料)，以诱导系CAU5作为父本诱导单倍体。父本CAU5分两期种植，第一期于4月25日播种，第二期于4月30日播种；母本播期与第一期父本相同，以便花期相遇。母本统一剪花丝，严格去雄，用父本诱导系进行过量授粉，同时记录统一授粉时间。在授粉后15天(记为DAP15天)的幼胚为材料，进行幼胚体外培养。
2.玉米单倍体幼胚鉴别及加倍
将步骤1所得的北京DAP15天的幼胚进行如下2组处理：
CK：其培养基组成为MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，其余为水，pH值为5.8。
Q1：具体是含有MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的含量为20mL/L，其余为水，pH值为5.8的处理组。
各处理组培养时间均为24小时。培养条件为全光照、温度26℃左右，湿度60％。CAU5均具有R1-nj标记，幼胚培养24小时后，杂合二倍体幼胚的盾片由于携带有R1-nj标记而呈现紫红色，单倍体幼胚仅含有母本材料的一套染色体，不含R1-nj标记，因此单倍体幼胚的盾片呈现无色。根据盾片颜色挑选出单倍体幼胚，并接种到成苗培养基上进行成苗培养。培养条件为16小时光期/8小时暗期交替、温度26℃左右，湿度60％左右。置于培养室中，进行成苗培养4天。另外，分别挑选CK与Q1中单倍体幼胚各3份，每份500mg以上，放置于液氮中，并保存在-80冰箱中，用于转录组测序。
3.单倍体幼胚加倍转录组测序分析
对上述CK和Q1处理24小时后的各3个重复进行转录组测序，而后筛选差异表达基因并进行KEGG富集，结果发现(表1)相比于非加倍的对照组，由于加倍处理组受秋水仙素胁迫，因此加倍处理后差异表达基因除富集到苯丙素合成通路(Phenylpropanoidbiosynthesis)，除此之外，还富集到植物激素信号转导(Plant hormone signaltransduction)、谷胱甘肽代谢等(Glutathione metabolism)等途径，其中在谷胱甘肽代谢通路中，5个差异表达基因中，1个下调表达，4个上调表达，最终可能导致植物体内谷胱甘肽水平发生变化，由此猜测谷胱甘肽含量的变化可能影响单倍体加倍效率。
表1.CK VS Q1前20KEGG富集通路
Figure BDA0003757862770000071
实施例2外施谷胱甘肽对单倍体幼胚加倍效率的影响
为进一步验证谷胱甘肽对单倍体加倍的影响，我们采用外施谷胱甘肽的方式在加倍培养基中添加不同含量谷胱甘肽。以京黄欧1号为母本，进行单倍体化学加倍效果验证，具体试验安排时间如下：
2022年在海南，以京黄欧1号作为母本(被诱导材料)，以诱导系CAU5作为父本诱导单倍体。母本京黄欧1号均于10月15日播种。父本错两期，分别于10月15日和20日播种。母本统一剪花丝，严格去雄，用父本诱导系进行过量授粉，同时记录授粉。授粉后15天剥取幼胚。分别在如下培养基中培养：
CK：谷胱甘肽含量为0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，谷胱甘肽的含量为0g/L，其余为水，pH值为5.8。
CK+T1：谷胱甘肽含量为1.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，谷胱甘肽的含量为1.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
CK+T2：谷胱甘肽含量为2.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，谷胱甘肽的含量为2.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
CK+T3：谷胱甘肽含量为3.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，谷胱甘肽的含量为3.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
Q1：谷胱甘肽含量为0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的体积含量为20mL/L，谷胱甘肽的含量为0g/L，其余为水，pH值为5.8。
Q1+T1：谷胱甘肽含量为1.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的体积含量为20mL/L，谷胱甘肽的含量为1.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
Q1+T2：谷胱甘肽含量为2.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的体积含量为20mL/L，谷胱甘肽的含量为2.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
Q1+T3：谷胱甘肽含量为3.0g/L的加倍鉴别培养基，其组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，秋水仙素的含量为0.1g/L、DMSO的体积含量为20mL/L，谷胱甘肽的含量为3.0g/L，其余为水，pH值为5.8。
各处理组培养时间均为24小时。培养条件为全光照、温度26℃左右，湿度60％左右。CAU5具有R1-nj标记，幼胚培养24小时后，杂合二倍体幼胚的盾片由于携带有R1-nj标记而呈现紫红色，单倍体幼胚及双单倍体(DH)幼胚仅含有母本材料的一套染色体，不含R1-nj标记，因此单倍体幼胚的盾片呈现无色。根据盾片颜色挑选出单倍体幼胚(幼胚的盾片呈现无色)，并接种到成苗培养基上进行成苗培养。成苗培养基成分为1/2MS固体培养基，其组成为：MS盐的含量为1.5g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，其余为水，pH值为5.8的培养基。培养条件为16小时光期/8小时暗期交替、温度26℃左右，湿度60％左右。置于培养室中，进行成苗培养7天。而后进行室外炼苗，至幼苗3-5叶期进行田间移栽，待单倍体植株抽雄吐丝时，对各处理雄穗露药和散粉登记进行调查，具体调查指标参照Penghao Wu etal,New Insights into the Genetics of Haploid Male Fertility in Maize 2017。雌穗严格套袋，单倍体散粉后严格自交，成熟收获后，统计单倍体露药得分、散粉得分、散粉率、结实率、平均结实数、DH生产率等关键指标，对各处理单倍体加倍效率进行评价。自交结实的单倍体为双单倍体(DH)。具体结果见表2。
散粉率＝散粉单倍体株数/总单倍体株数×100％
结实率＝结实单倍体株数/散粉单倍体株数×100％
DH生产率＝结实单倍体株数/总单倍体株数×100％。
表2.不同含量谷胱甘肽对单倍体幼胚加倍的影响
Figure BDA0003757862770000091
通过比较不同含量谷胱甘肽对单倍体幼胚加倍情况可知，在不添加秋水仙素或单独添加不同含量谷胱甘肽时，京黄欧1号露药得分和散粉得分均低于0.5，散粉率均低于20％，最终DH生产率仅CK+T1达到10.9％，其余处理组均在10％以下。利用秋水仙素加倍剂处理后，单倍体加倍效率均得到明显提升。在常规加倍培养基Q1处理下，单倍体散粉率为65.15％，最终DH生产率为42.42％。相比于Q1，在外施谷胱甘肽的时，露药得分和散粉得分略低于Q1，但散粉率均得到提升，Q1+T1与Q1+T2处理组平均结实数均高于Q1，且Q1+T1最终平均结实率和DH生产率均高于常规加倍处理组Q1。综上所述，外施不同含量谷胱甘肽结合常规加倍剂的处理下，可有效提升单倍体加倍散粉率、结实率和最终的DH生产率。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、含量和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (5)

1.提高玉米单倍体加倍效率的方法，所述方法包括将玉米单倍体幼胚接种于含有玉米单倍体加倍剂的培养基中培养24h，得到染色体加倍的玉米；
所述玉米单倍体加倍剂的活性成分为秋水仙素、二甲基亚砜和谷胱甘肽；
所述含有玉米单倍体加倍剂的培养基中所述秋水仙素的含量为0.1g/L，所述二甲基亚砜的体积含量为20mL/L，所述谷胱甘肽的含量为1.0g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有玉米单倍体加倍剂的培养基组成为：MS盐的含量为3.0g/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7.5g/L，所述秋水仙素的含量为0.1g/L、所述二甲基亚砜的含量为20mL/L，所述谷胱甘肽的含量为1.0g/L，其余为水。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述培养的培养条件为全光照、温度26℃，湿度60%。
4.一种玉米单倍体加倍剂，其活性成分为秋水仙素、二甲基亚砜和谷胱甘肽，所述加倍剂在培养基中的终浓度为所述秋水仙素的含量为0.1g/L，所述二甲基亚砜的体积含量为20mL/L，所述谷胱甘肽的含量为1.0g/L。
5.权利要求4所述的玉米单倍体加倍剂的应用，所述应用选自下述任一种：
P1)、所述玉米单倍体加倍剂在玉米单倍体幼胚加倍中的应用；
P2)、所述玉米单倍体加倍剂在玉米单倍体育种中的应用。
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