CN112273219B

CN112273219B - 一种利用杂交结合f1代小孢子培养快速获得稳定纯合氮高效材料的方法

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Publication number: CN112273219B
Application number: CN202011079094.8A
Authority: CN
Inventors: 徐红卫; 高润红; 张述伟; 宗营杰; 李静; 黄琳丽; 陈志伟; 刘成洪
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-10-10
Filing date: 2020-10-10
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-10-10
Also published as: CN112273219A

Abstract

本发明涉及农业技术领域，具体是一种利用杂交F₁小孢子培养快速获得遗传稳定、纯合氮高效材料的方法，包括选用两份已鉴定的耐低氮大麦亲本杂交，收获其F₁代的小孢子，离体培养后，经过小孢子的分化和脱分化过程，将耐低氮双亲的氮高效(显隐性)基因快速纯合固定，培养获得再生的加倍单倍体M₀代种子，再通过水培和田间试验多年多点多重复的低氮胁迫培养鉴定，最终快速筛选获得低氮条件下苗期生物量和成熟期单株产量及氮素利用效率稳定提高、超过双亲的纯合大麦种质材料。

Description

一种利用杂交结合F1代小孢子培养快速获得稳定纯合氮高效材料的方法

技术领域

本发明涉及农业技术领域，具体地说，是一种快速创制氮素利用效率稳定超亲的大麦纯合种质材料的方法。

背景技术

氮素是植物生长不可或缺的大量矿质元素之一，占植物干重的1.5-2％，蛋白的16％。半个世纪以来，为了提高作物产量，氮肥的使用量增长了10倍。农田大量使用氮肥，其结果就导致了近几十年来育成的大部分高产作物品种对氮素等营养元素的依赖非常高，很多耐瘠的作物品种接近消失，使得种植成本大幅提高。同时，大量的氮肥得不到有效利用，能被作物利用的氮素约占 30-40％。中国每年有超过1500万吨的废氮流失到了农田之外，通过淋滤、挥发、地表径流、反硝化作用、微生物消耗等方式浪费掉，而这些过量的氮素进入到环境中就造成了日益严重的环境问题，如江河富营养化、地下水污染、诱发蓝藻爆发、全球气候变暖等。我国农业部已提出了“减化肥、减农药”的“双减”战略，据估计，作物氮素利用效率每提高1％每年将节省约11亿美元，因此，选育氮高效作物新品种，是保护环境、降低成本和改善作物品质最简洁和最有效的手段，不仅可以降低施肥成本，减少氮肥污染，同时还有利减轻病害发生，将产生良好的应用前景、生态效益、社会效益和经济效益。

拥有优良的种质资源是进行氮代谢机理研究的基础前提。目前生产氮高效专用的品种主要集中在杂交育种，基因工程育种和细胞工程育种。尽管转基因方法已有所报道，但是至今仍没有获得氮高效利用的商业化转基因品种。传统的杂交育种是作物产量和抗逆性等遗传改良最成功的育种方法之一，其核心是杂种优势。但是杂种优势主要存在于F₁代，由于孟德尔分离的规律，从第二代开始就明显下降，且氮高效很大程度上受到隐性基因控制，筛选需要在高世代进行，这将需要更长的时间，甚至6-10代才能获得纯合的氮高效种质材料。如何快速获得氮高效特性稳定超亲的纯合种质，仍是育种中亟待解决的难题之一。利用花药培养技术，可以快速创制出优良的DH株系，与花药相比，小孢子由于无花药壁，具有较高的再生频率，是一种更加理想的单倍体培养体系。通过小孢子培养方法，可快速聚合固定双亲的氮高效基因，获得基因重组体，经染色体加倍后，一步即可获得该性状稳定遗传的纯合加倍单倍体再生植株。前期已有报道，在苗期和成熟期利用生物量和单株产量等指标可对材料的耐低氮性状进行筛选和鉴定，本发明经过F₁代的小孢子培养，结合实验室苗期和大田成熟期的综合鉴定，可以迅速聚合位于不同品种的氮高效利用优良基因，选育出氮高效利用更强的新种质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用杂交结合F₁代小孢子培养来快速固定双亲的氮高效(显，隐)基因，获得氮高效纯合种质材料的方法，且所获材料的氮高效性状能稳定遗传。本发明通过以下方法实现该目的，所述方法具有稳定性和可重复性。

本发明选用两个鉴定为耐低氮类型的大麦亲本材料杂交，利用去除花药壁的小孢子进行培养，获得再生的加倍单倍体M0代种子，再通过水培和土培的低氮胁迫培养鉴定，最终获得了在低氮条件下氮素利用效率显著提高、超过双亲的纯合大麦种质材料。

本发明提供了一种快速、有效聚合双亲氮高效优势的方法，获得的氮高效材料具有纯合，稳定，可遗传的特点。包括：选用耐低氮双亲杂交，利用杂交结合F₁代小孢子进行培养将氮高效基因一步纯合固定，经过人工可控环境和田间低氮种植多年的鉴定后，最终快速获得在低氮条件下氮素利用效率稳定提高、超过双亲的纯合大麦种质材料。

本发明提供的方法具有以下特征：

1.亲本选择：选用两份耐低氮亲本；

2.F₁代小孢子的离体培养方法：对杂交获得的F₁代，采用小孢子培养技术快速固定氮高效的性状，获得纯合加倍单倍体(DH)株系，种质所有性状完全纯合，隐性性状可以当代显现；

3.于大田对材料在不同氮水平下成熟期的单株产量和氮素利用率进行鉴定；

4.于人工气候室对材料在不同氮水平下苗期的干物重和氮素利用率进行鉴定。

虽然前期有文献报道过源于大麦F₁小孢子氮胁迫培养方法(参考文献：徐红卫等,源于大麦F₁小孢子氮胁迫培养自交一代的耐低氮性评价,麦类作物学报,2015,35(12)：1646-1652.)，但该文献公开的内容中，首先在小孢子时期即进行了低氮胁迫培养，小孢子时期对胁迫响应非常敏感，影响了后续再生植株的获得效率；其次，获得的加倍单倍体株系，在温室塑料盆钵中种植，其氮肥的处理方式参考了黄亿等按照拌土：草木灰：泥土(青浦地)＝1：1：1等体积混复合肥(N：P₂O₅：K₂O＝25:13:7)进行施肥，分为正常供氮(13g)和低氮(6.5g)两个水平，氮肥作为基肥一次施肥，未加追肥。但此处的氮肥施加为复合肥，两个处理水平在降低氮肥的同时，也减少了生长必须的磷肥和钾肥，所以后期获得的材料表型不一定与低氮完全相关；再次，该温室中材料的种植时期为3月-7月的非正季筛选(一般大麦田间播种的季节是11月份，收获季节在来年5月份)，此时期获得的材料生长量相对较小，相关数据并未能最大限度反映材料对低氮胁迫的响应。

本发明的方法，在小孢子时期去掉了低氮培养的处理，而是保证了再生植株的最大获得效率，更高效的获得了聚合双亲优良基因的DH材料，同时综合利用田间和溶液培养的成熟的筛选方法在不同的氮素处理水平和时期对DH株系进行选育，相比文献中的报道，首先，去除了小孢子时期的氮胁迫处理，其次，在苗期和成熟期有多年的数据和重复，以及氮素处理的时期和水平的合理性，最终筛选获得了一份低氮条件下，氮素利用率显著优于双亲的DH材料。

为了实现上述目的，本发明提供一种利用杂交结合F₁代小孢子培养快速获得稳定纯合氮高效材料的方法，包括以下步骤：

(a)杂交：利用两份耐低氮优异材料作为亲本，在花粉成熟后进行相互授粉杂交，获得杂交F₀代种子，繁育该F₀代种子，获得F₁代植株；

(b)取材：取上述F₁代植株中小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，用保鲜膜包好，置于冰箱，5℃低温处理2-4周(优选2-3周)；

(c)接种：首先用10％的次氯酸钠溶液消毒麦穗，无菌水冲洗后，轻剥外壳，将取好的小花接入试管中，加入含有4-8％甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl₂和 0.8-1.2g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的预冷提取液，用高速分散器超速旋切，转速为15000rpm，利用300目的过滤网过滤，以700r·min^-1，低速离心5min，倒掉滤液，从而收集得到小孢子。

优选的，所述的预冷提取液含6％甘露醇，1.1g/L CaCl₂和0.976g/L MES。

(d)预处理小孢子：所获得的小孢子用预处理液于室温、黑暗预处理36-60 小时，其中，所述预处理液含有4-8％甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl₂和0.8-1.2g/L 的2-(N-吗啡啉)乙磺酸；

优选的，所述的预处理液含6％甘露醇，1.1g/L CaCl₂和0.976g/L MES。

(e)培养小孢子：预处理后的小孢子用21％麦芽糖进行纯化，加入诱导培养基，所述诱导培养基是以改良的N₆培养基为基本培养基，其中加有KT 0.5mg/L 和2,4-D 1.0mg/L，麦芽糖90g/L；具体配方见表1。将小孢子密度调节至1.0 ×10⁵个/ml，放入25℃培养箱中暗培养；

(f)再生获得纯合加倍单倍体：当小孢子发育成肉眼可见的愈伤组织时，把愈伤组织转到分化培养基，置于23-25℃，光照培养。其中，分化培养基以2/3MS 为基本培养基，其中加有6-BA 0.5mg/L、KT 1.5mg/L、NAA 0.05mg/L和麦芽糖30g/L，用6g/L琼脂粉固化，pH为5.8；具体配方见表2。待绿苗分化后移入壮苗生根培养基中，其中培养基以1/2MS为基本培养基，其中加有NAA 0.05mg/L、蔗糖30g/L，4.0mg/L多效唑，用6g/L琼脂粉固化培养基，pH为5.8；具体配方见表3。

(g)水培炼苗所述纯合加倍单倍体(DH)：挑选根系发达的无菌苗(芽长根长超过2cm时)，从培养基中移出，清水洗净根部琼脂，用海绵条包裹根基部，置于漂浮板上，利用Hoagland营养液水培，炼苗3-4周。

(h)小孢子再生植株种植，成熟后按照单株收获。种植条件：温度20±2℃，光照1000，湿度75％，土壤中的可利用氮含量在72.17mg/kg～122.69mg/kg。

优选在云南加代种植，原因是合适的生长条件可以更加高效的获得加倍单倍体的种子，或在符合上述要求的人工气候室中种植。

(i)大田筛选鉴定：对得到的DH植株种子收获后，利用田间基地，以成熟期的单株产量和氮素利用率为筛选指标在不同氮水平进行耐低氮性状筛选。设置氮素浓度水平分别为：150kg/hm^-2，45kg/hm^-2和0。筛选出统计学意义上显著超出双亲的单株产量和氮素利用率的植株。

(j)人工气候室筛选：对上述单株收获的种子，用10％NaClO消毒8min，清水冲洗干净，浸泡6～8h，25℃催芽过夜，然后选取露白一致的种子，出芽 4-5天后，播于周转箱中进行水培，首先用自来水培养1天，然后采用低氮营养液培养，低氮营养液中氮素浓度为正常供氮氮素浓度的1/10。培养28d后，利用人工气候室恒温恒湿的可控环境以苗期干物重和苗期氮素利用率为筛选指标进行氮高效性状筛选。人工气候室的光照强度约为1000x，温度为20±2℃，湿度为75％。

本发明实验中以改良版1/2N的Hoagland配方，作为对照正常供氮的营养液配方，具体如下：

NH₄NO₃(0.1mM)、KNO₃(2.5mM)、Ca(NO₃)₂(1mM)、MgSO₄(2mM)、 KH₂PO₄(0.1mM)、Na₂SiO₃(0.5mM)、NaFe(III)–EDTA(0.05mM)、H₃BO₃(0.01 mM)、MnCl₂(0.005mM)、ZnSO₄(0.005mM)、CuSO₄(0.0005mM)、Na₂MoO₃ (0.0001mM)，溶液pH为6.2±0.5左右。

低氮营养液中氮素浓度为正常供氮氮素浓度的1/10，具体配方如下：

NH₄NO₃(0.01mM)、KNO₃(0.25mM)、Ca(NO₃)₂(0.1mM)、MgSO₄(2mM)、 KH₂PO₄(0.1mM)、Na₂SiO₃(0.5mM)、NaFe(III)–EDTA(0.05mM)、H₃BO₃(0.01 mM)、MnCl₂(0.005mM)、ZnSO₄(0.005mM)、CuSO₄(0.0005mM)、Na₂MoO₃ (0.0001mM)，其中补加0.9mmol/L CaCl₂,1.125mmolK₂SO₄，溶液pH为6.2±0.5 左右。

通过第9和第10步两个时期的综合鉴定，既比较了苗期大麦各基因型在正常供氮和低氮胁迫间的差异，又比较了成熟期大麦各基因型在施肥和不施肥间的差异，同时兼顾了溶液培养简单、重复性好等特点和田间试验的真实性。

最终筛选到了相比双亲苗期生物重和成熟期单株产量以及氮素利用率在统计学意义上显著提高的材料。

表1：诱导培养基的配方(单位：mg/L)

表2：分化培养基的配方(单位：mg/L)

表3：壮苗生根培养基的配方(单位：mg/L)

注：可对上述表1、表2和表3所示的浓度做出适当的变动，例如有大约 5％或更低(例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围)的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。此外，N₆和MS培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。

本发明创新之处在于：

1)小孢子时期去除了低氮处理；

2)田间的氮素处理水平：分别为150kg·hm^-2，45kg·hm^-2和0kg·hm^-2，与常规选用的氮种植浓度(225kg·hm^-2)相比，设置了3个低氮梯度，且低氮条件下，仅降低了氮肥的施用量，对磷钾肥并无影响，效果是更能有助于阐明氮肥对材料的影响；

3)溶液培养的氮素处理水平：分别为：4.7mmol/L和0.47mmol/L 相比常用的国际水稻营养液配方，更加适合大麦生长，原因是大麦吸收过量的 NH4⁺会引起毒性，效果是可以明显区分不同材料的苗期干物重。

4)筛选获得了一份低氮条件下不论是苗期还是成熟期的氮素利用率都显著优于双亲的DH材料。

综合以上1-3点，会产生协同作用，首先通过两份耐低氮材料的杂交，聚合双亲的氮高效基因，再结合F₁代小孢子培养的方法，能快速固定获得纯合的氮高效加倍单倍体株系，该部分是基础；苗期和成熟期的鉴定也是必不可少，相互支持的，如果没有成熟期的验证，仅靠苗期的筛选，获得的材料未必在成熟期表现出显著优于亲本的氮高效性。如果没有苗期的验证，仅靠成熟期大田的筛选，且大田试验受到外界众多因素的影响，同时大田试验周期长，耗时耗力，对获得的材料大规模地进行氮高效品种筛选则工程艰巨，若能够结合人工气候室在恒定可控的条件下对苗期的材料进行初筛，后续再着重对材料进行成熟期验证，对高效筛选纯合的氮高效材料有重要意义。

本发明优点在于：

1、本发明利用杂交结合F₁代小孢子培养的技术将耐低氮双亲的氮高效优势性状进行快速纯合固定，经过低氮条件下苗期和成熟期的多年鉴定，其氮高效特性稳定，氮素利用效率、苗期生物量和成熟期单株籽粒产量表现均显著超过双亲。

2、本发明由于对小孢子的特殊处理以及大田和温室的复合筛选可大大缩短获得氮高效材料的时间，通常在一至两年即可实现。

附图说明

图1：a、b、c图分别为不同氮肥施加条件下亲本和10份子代的单株产量比较；

*表示亲本与子代在P<0.05水平上有显著性差异；

**表示亲本与子代在P<0.01水平上有显著性差异。

图2不同氮素水平下亲本和DH株系的相对干物重比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：大麦耐低氮亲本杂交

大麦(Hordeum vulgare L.)是继小麦、水稻和玉米之后的世界第四大重要禾谷类作物，被认为是研究小孢子培养高频再生技术和功能食品的优良模式植物。取实验室前期筛选获得的两份大麦耐低氮材料BI04和BI28(陈志伟等 201030(1)：158-162)的种子各100粒，表面采用10％次氯酸钠消毒8-10分钟，蒸馏水冲洗干净，置于湿润纱布上于室温暗处催芽过夜，正常发芽7天后，取生长一致的幼苗(苗长为5cm)移栽到大田，间距3cm，行距30cm。土壤中含有机质34.0g/kg、全氮2.41g/kg、速效氮37.30mg/kg，播种前施基肥20kg/ 亩，分蘖期追加10kg/亩尿素，待花粉成熟时，剪开母本植株穗子颖壳，取父本植株小花花粉进行授粉，同时进行挂牌标记，成熟后单独收获杂交种子。

实施例2：F₁代植株繁殖

杂交种子同上于播种季节种于大田，获得F₁代生长植株，作为游离小孢子的培养材料。

实施例3：游离F₁小孢子培养获得纯合DH株系

从大田中选取中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的小穗进行5℃低温处理2-3周，接种时穗子用75％酒精浸泡30秒，饱和的漂白粉溶液消毒15 分钟，无菌水冲洗4次，每个试管接10个穗子，倒入15ml预冷提取液(含 6％甘露醇，1.1g/L CaCl₂和0.976g/LMES)，用高速分散器超速旋切，300目筛网过滤，滤液以700r·min^-1离心5min，重复3次，收集小孢子。

小孢子用预处理液于25℃、黑暗预处理2d。预处理液含6％甘露醇，1.1g/L CaCl₂和0.976g/L MES。

培养前将预处理后的小孢子先用21％麦芽糖纯化，再用诱导培养基洗涤1 次，然后用诱导培养基将小孢子密度调节至1.0×10⁵/ml，取1ml小孢子悬浮液接种于培养皿(35×15mm)，Parafilm膜封口，25℃暗培养，诱导愈伤。

诱导培养基以改良的N₆培养基为基本培养基，其中加有KT 0.5mg/L和 2,4-D1.0mg/L，麦芽糖90g/L。具体配方见表1。

将愈伤组织转入分化培养基获得再生苗。分化培养基以2/3MS为基本培养基，其中加有6-BA 0.5mg/L、KT 1.5mg/L、NAA 0.05mg/L和麦芽糖30g/L，用6g/L琼脂粉固化。具体配方见表2。待绿苗分化后移入壮苗生根培养基中，壮苗生根培养基以1/2MS为基本培养基，其中加有NAA 0.05mg/L、蔗糖30 g/L，4.0mg/L多效唑，用6g/L琼脂粉固化培养基，pH5.8。具体配方见表3。

通过培养获得小孢子再生的植株，该材料是由一套染色体加倍而来纯合的加倍单倍体(DH)，亲本的遗传性状完全纯合，隐性性状可在当代植株表现。

实施例4：DH植株获取及筛选

将小孢子培养获得的再生植株(芽长根长超过2cm时)从培养基中移出，清水洗净根部琼脂，用海绵条包裹根基部，置于漂浮板上，放入大麦Hoagland 营养液中培养，生根炼苗，将再生苗送至昆明种植至籽粒成熟，共收获85份单株种子。

将收获的单株种子分别种植于温室盆钵中，初步筛选获得10份明显优于双亲的DH系。分别挑选大小均匀、籽粒饱满10份DH株系的种子播种于上海市农科院青浦基地，大田试验采取裂区设计，小区行长3.3米，行距0.33米，设置氮素浓度水平分别为：150kg/hm^-2，45kg/hm^-2和0，每个氮水平4个生物学重复，每个重复取5个单株，在成熟期对材料的农艺性状和单株产量进行统计分析。研究发现，在施加纯氮150kg/hm²下，材料1-30，1-31，1-49，1-53， 2-4与亲本的单株产量有显著性差异(图1a)，在施加纯氮45kg/hm²下，材料 1-30，1-31，1-45，1-49，1-53，2-4，2-6与亲本的单株产量有显著性差异(图 1b)，在施加氮肥为0kg/hm²下，材料1-5，1-31，1-45，1-49，2-4，2-6与亲本的单株产量有显著性差异(图1c)。相比高氮肥力(150kg/hm²)，低氮肥力 (45kg/hm²)下1-45、2-6与亲本的单株产量具有显著性差异，同时在氮肥完全缺失的条件下，发现1-45、2-6与亲本的单株产量皆显著优于亲本，说明：1-45和2-6为低氮条件下单株产量优于亲本的DH株系。

在水培条件下，比较10份DH株系材料和亲本苗期的干物质重量，发现 1-45的相对干物重显著优于亲本。

实施例5：氮高效材料DH45的苗期表型和生理特征

表4的结果显示，经本发明方法选育的大麦材料DH45氮素利用率显著高于亲本材料。例如，就苗期干物重而言，本发明大麦的干物重含量相对于亲本干物重含量显著提高，其中较BI04高出92.86％，较BI28高出68.75％；同样，本发明大麦的苗期氮素利用率相对于对照大麦显著增加(比较BI04高出 91.59％，比较BI28高出64.65％)。

采用水培的方式对材料在氮胁迫后7天分别测定各项生理指标发现，相比亲本，叶绿素含量、谷氨酰胺合成酶和硝酸还原酶活力皆具有显著的酶活差异，根中无明显差异(表5)。

表4 DH45与亲本在苗期水培28d干物重和氮素利用率的比较

注：*表示DH45与双亲的中亲值或者高亲值相比有显著性差异。

表5 DH45相比双亲在不同氮素水平下的生理指标比较

注：—表示与亲本比较无显著性差异，+％表示比亲本显著增加的百分比。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种利用杂交结合F₁代小孢子培养快速获得稳定纯合氮高效材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)杂交：利用两份耐低氮材料作为亲本，在花粉成熟后进行相互授粉杂交，获得杂交F₀代种子，繁育该F₀代种子，获得F₁代植株；

(b)取材：取上述F₁代植株中小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，用保鲜膜包好，5℃低温处理2-4周；

(c)接种：首先消毒麦穗，无菌水冲洗后，轻剥外壳，将取好的小花接入试管中，加入预冷提取液，所述的预冷提取液为6%甘露醇，1.1g/L CaCl₂和0.976g/L MES；用高速分散器超速旋切，转速为15000rpm，利用300目的过滤网过滤，以700r·min^-1，低速离心5min，倒掉滤液，从而收集得到小孢子；

(d)预处理小孢子：所获得的小孢子用预处理液于室温、黑暗预处理36-60小时，所述的预处理液为6%甘露醇，1.1g/L CaCl₂和0.976g/L MES；

(e)培养小孢子：预处理后的小孢子用21%麦芽糖进行纯化，加入诱导培养基，所述诱导培养基是以改良的N₆培养基为基本培养基，其中加有KT 0.5 mg/L和2,4-D 1.0 mg/L，麦芽糖90 g/L；将小孢子密度调节至1.0×10⁵个/ml，放入25℃培养箱中暗培养；

所述N₆培养基配方如下：(NH₄)₂SO₄ 463 mg/L，KNO₃ 2830 mg/L，CaCl₂•2H₂O 166 mg/L，MgSO₄•7H₂O 185 mg/L，KH₂PO₄ 400 mg/L，H₃BO₃ 1.6 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO₄•4H₂O 4.4mg/L，ZnSO₄•7H₂O 1.5 mg/L，Na₂EDTA 37.3 mg/L，FeSO₄•7H₂O 27.8 mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡多辛0.5 mg/L，甘氨酸 2.0 mg/L，烟酸0.5 mg/L，谷氨酰胺1600 mg/L，水解干酪素400 mg/L；

(f)再生获得纯合加倍单倍体：当小孢子发育成肉眼可见的愈伤组织时，把愈伤组织转到分化培养基，置于23-25℃，光照培养；其中，分化培养基以2/3MS为基本培养基，其中加有6-BA 0.5 mg/L、KT 1.5 mg/L、NAA 0.05 mg/L和麦芽糖30g/L，用6g/L琼脂粉固化，pH 为5.8；

2/3MS的配方如下：NH₄NO₄ 1100 mg/L，KNO₃ 1266.67 mg/L，CaCl₂•2H₂O 293.33 mg/L，MgSO₄•7H₂O 246.67 mg/L，KH₂PO₄113.33 mg/L，H₃BO₃ 4.13 mg/L，KI 0.55mg/L，MnSO₄•4H₂O3.72 mg/L，ZnSO₄•7H₂O 5.73 mg/L，Na₂MoO₄•2H₂O 0.17 mg/L，CuSO₄•5H₂O 0.017 mg/L，CoCl₂•6H₂O 0.017 mg/L，Na₂EDTA 24.87 mg/L，FeSO₄•7H₂O 18.53mg/L，盐酸硫胺素0.067mg/L，盐酸吡多辛0.33 mg/L，烟酸0.33 mg/L，甘氨酸1.33 mg/L，肌醇66.67 mg/L；

待绿苗分化后移入壮苗生根培养基中，其中壮苗生根培养基以1/2MS为基本培养基，其中加有NAA 0.05 mg/L、蔗糖30 g/L，4.0mg/L多效唑，用6g/L琼脂粉固化培养基，pH为5.8；

1/2MS配方如下：NH₄NO₄ 825mg/L，KNO₃ 950 mg/L，CaCl₂•2H₂O 220 mg/L，MgSO₄•7H₂O185 mg/L，KH₂PO₄ 85 mg/L，H₃BO₃ 3.1 mg/L，KI 0.415 mg/L，MnSO₄•4H₂O 11.15 mg/L，ZnSO₄•7H₂O 4.3 mg/L，Na₂MoO₄•2H₂O 0.125 mg/L，CuSO₄•5H₂O 0.0125 mg/L，CoCl₂•6H₂O0.0125 mg/L，Na₂EDTA 18.65 mg/L，FeSO₄•7H₂O 13.9 mg/L，盐酸硫胺素0.05 mg/L，盐酸吡多辛0.25 mg/L，烟酸0.25 mg/L，甘氨酸1.0 mg/L，肌醇50.0 mg/L；

(g) 水培炼苗所述纯合加倍单倍体：挑选根系发达的无菌苗，从培养基中移出，清水洗净根部琼脂，用海绵条包裹根基部，置于漂浮板上，利用Hoagland 营养液水培，炼苗3-4周；

(h)小孢子再生植株种植，成熟后按照单株收获；种植条件：温度20±2℃，光照1000，湿度75%，土壤中的可利用氮含量在 72.17mg/kg~122.69 mg/kg；

(i)大田筛选鉴定：对得到的加倍单倍体植株种子收获后，利用田间基地，以成熟期的单株产量和氮素利用率为筛选指标在不同氮素水平进行耐低氮性状筛选；

(j)人工气候室筛选：对上述单株收获的种子，用10% NaClO消毒8min，清水冲洗干净，浸泡6~8 h，25℃催芽过夜，然后选取露白一致的种子，出芽4-5天后，播于周转箱中进行水培，首先用自来水培养1天，然后采用低氮营养液培养，低氮营养液中氮素浓度为正常供氮氮素浓度的1/10；培养28d 后，利用人工气候室以苗期干物重和苗期氮素利用率为筛选指标进行氮高效性状筛选；所述的低氮营养液配方如下：NH₄NO₃ 0.01 mM、KNO₃0.25 mM、Ca(NO₃)₂ 0.1 mM、MgSO₄ 2 mM、KH₂PO₄ 0.1 mM、Na₂SiO₃ 0.5 mM、NaFe (III)–EDTA 0.05 mM、H₃BO₃ 0.01 mM、MnCl₂ 0.005 mM、ZnSO₄ 0.005 mM、CuSO₄ 0.0005 mM、Na₂MoO₃ 0.0001 mM，其中补加0.9 mmol/L CaCl₂，1.125mmol K₂SO₄，溶液pH 为6.2±0.5。

2.根据权利要求1所述的利用杂交结合F₁代小孢子培养快速获得稳定纯合氮高效材料的方法，其特征在于，步骤i中设置氮素浓度水平分别为：150 kg/hm^-2，45 kg/hm^-2和0。

3.根据权利要求1所述的利用杂交结合F₁代小孢子培养快速获得稳定纯合氮高效材料的方法，其特征在于，步骤j中人工气候室的光照强度为1000x，温度为20±2℃，湿度为75%。