CN102106258B

CN102106258B - 一种改良麦类作物耐低氮性状的方法

Info

Publication number: CN102106258B
Application number: CN 200910200607
Authority: CN
Inventors: 黄剑华; 陆瑞菊; 王亦菲; 陈志伟; 何婷
Original assignee: SHANGHAI CO-ELITE AGRICULTURAL SCI-TECH (GROUP) CO LTD; Shanghai Lvjian Agriculture Technology Co ltd; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: SHANGHAI CO-ELITE AGRICULTURAL SCI-TECH (GROUP) CO LTD; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2029-12-24
Also published as: CN102106258A

Abstract

本发明提供一种麦类作物耐低氮性状改良的方法，该方法包括在小孢子离体培养的胚状体诱导、胚状体的分化培养阶段分别给予有机氮的低氮胁迫筛选，获得再生植株。本发明的单倍体细胞水平有机氮低氮胁迫筛选所获得耐低氮性提高的再生植株的所有性状可以一次性纯合，提高了耐低氮育种的效率。本发明实施方法简便，易于掌握，整个筛选过程都在实验室完全一致的可控条件下进行，使结果真实可靠。

Description

一种改良麦类作物耐低氮性状的方法

技术领域

本发明属于作物育种技术领域，涉及以种子作为繁殖方式的麦类作物的耐低氮性状的改良方法。

背景技术

小麦和大麦是世界上二大谷类作物，小麦是我国的主要粮食作物，大麦是制造啤酒的主要原料，也是优良饲料。氮素是作物生长必需的营养元素，为了保证了作物高产和稳产，就必须大量施用氮肥。近年来，随着氮肥的大量使用，在促进作物增产、稳产的同时，也带来了诸多弊端，如经济效益下降、氮肥利用率降低、环境污染等等，不仅造成了巨大的经济损失，而且严重污染了环境，对人类健康构成了潜在的威胁。啤酒大麦要求籽粒蛋白质含量的优级标准为10％～12％，但生产上往往为了追求产量而增大氮肥施用量或生育中后期重施追肥，结果籽粒蛋白质含量超标，因而降低了制啤质量。因此，培育新的耐低氮作物、提高作物的耐低氮性研究显得日益重要。

以种子作为繁殖方式的禾谷类作物，小麦的耐低氮性较差，大麦的耐低氮性一般，培育耐低氮新品种是克服上述问题的主要途径。在缺乏耐低氮种质资源的情况下，麦类作物的耐低氮育种的策略主要建立在种质创新和加快有效基因积累的基础上。目前通常利用各类诱变手段，使供试材料发生变异，通过低氮胁迫筛选选育出耐低氮新种质；通过杂交育种方法，使位于不同品种中的耐低氮基因聚合到一个材料上，通过耐低氮胁迫，筛选出耐低氮新品种。因此。低氮胁迫的筛选和耐低氮基因的聚合效率在很大程度上决定了种质创新和新品种培育的效果。

小孢子培养是真正意义上的单倍体细胞培养，对低氮胁迫的反应更为敏感，在小孢子培养过程中进行低氮胁迫，可以对杂交后代中丰富多样的小孢子重组体进行筛选，存活的耐低氮的小孢子形成胚状体，在胚状体的萌发过程中进行进一步的低氮胁迫。小孢子在低氮胁迫下经过脱分化与分化二个细胞生长发育程序再生成株，经过染色体加倍后其携带的所有基因均一次性纯合，成为加倍单倍体植株，收获种子后即成遗传稳定的株系。通过该技术二年内就可以获得耐低氮性提高的纯合株系。

本领域仍需要获得以种子作为繁殖方式的麦类作物耐低氮性状的种质材料，在我国贫瘠土上能够大量种植，有效利用有限资源。

发明内容

本发明针对麦类作物中现有种质材料中缺乏耐低氮材料的不足，提供一种新的麦类耐低氮株系的获得及离体筛选的方法，且筛选条件易于统一控制，不受外界自然条件的限制。

因此，本申请第一方面提供一种改良麦类作物耐低氮性状的方法，该方法包括：

1)取麦类作物孕穗期花药游离小孢子，置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L的不含无机氮源的N6诱导培养基上培养，获取胚状体；

2)将步骤1)所得的胚状体置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L的不含无机氮源2/3MS分化培养基上培养，获取再生植株；和

3)将再生植株置于添加NAA 0.03～1.00mg/L、多效唑3.0～10.0mg/L和蔗糖10～40g/L，pH5.5～6.2的1/2MS生根壮苗培养基生根培养基上培养，获取根、茎、叶完整的再生植株；

由此获得具备耐低氮性状的再生植株。

在一优选实施例中，所述麦类作物是大麦和小麦。

在一优选实施例中，步骤1)、2)中所述不含无机氮源指不含KNO₃和(NH₄)₂SO₄。

在一优选实施例中，所述N₆诱导培养基还添加有2，4，5-T 0.5～1.5mg/L、KT 0.3～0.8mg/L和麦芽糖70～120g/L。

在一优选实施例中，所述2/3MS分化培养基6-BA 0.3～0.8mg/L、KT 1～2mg/L、NAA 0.02～0.08mg/L和麦芽糖10～50g/L。

在一优选实施例中，所述方法还包括：

4)将步骤3)所得再生植株培养成为完整植株，移栽生长至成熟，获取成熟后的种子；

5)培养所收获的种子，获取幼苗，去胚乳后用按Hoagland’s营养液配方配制的营养液于15±5℃培养，培养在正常供氮和1/4供氮2个水平下进行，3-5周后收苗，从而获得耐低氮株系。

在一优选实施例中，所述正常供氮以1～1.8mmol/L的浓度供氮，所述1/4供氮中氮的浓度为正常供氮水平的1/4。

本申请另一方面还包括用于实施本申请方法的N₆诱导培养基、2/3MS分化培养基和1/2MS生根壮苗培养基。

用于权利要求1所述方法的N₆诱导培养基，以N₆培养基为基础培养基，添加有谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L，且不含无机氮源。

用于权利要求1所述方法的2/3MS分化培养基，以MS培养基为基础培养基，其中MS培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有机元素不变，所述2/3MS分化培养基添加有谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L，且不含无机氮源。

用于权利要求1所述方法的1/2MS生根壮苗培养基，以MS培养基为基础培养基，其中MS培养基的大量元素减半，而微量元素、铁盐和有机元素不变。

本申请再一方面还包括含有本申请所述N₆诱导培养基、2/3MS分化培养基和/或1/2MS生根壮苗培养基的套盒。

具体实施方式

本申请涉及一种改良麦类作物耐低氮性状的方法，该方法包括：

1)取麦类作物孕穗期花药游离小孢子，收集后置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L的无KNO₃和(NH₄)₂SO₄的N₆诱导培养基上培养，获取胚状体；

2)将步骤1)所得的胚状体置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L的无KNO₃和NH₄NO₄的2/3MS分化培养基上培养，获取再生植株；和

3)再生植株置于添加NAA 0.03～1.00mg/L、多效唑(MET)3.0～10.0mg/L和蔗糖10～40g/L，pH5.5～6.2的1/2MS生根壮苗培养基上培养，获取根、茎、叶完整的再生植株。

在实施本申请时，可从大田选取中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的穗子，放入冰箱冷藏10～25天左右，例如冷藏15天左右。

接种前消毒穗子。可采用常规的方法消毒，例如饱和的漂白粉溶液消毒15min。然后用无菌水冲洗2～4次。每个试管接5～15个穗子(例如大约10个穗子)，倒入10～25ml含有甘露醇50～70g/L(优选55、60或65g/L)、CaCl₂0.9～1.3g/L(优选1.1g/L)、MES 0.95～1.0g/L(优选0.976g/L)的提取液，用高速分散器超速旋切(2500～4000rpm，优选3000rpm)，150目筛网过滤，滤液以600～800rpm(优选800rpm)低速离心，重复几次(例如3次左右)，收集小孢子。小孢子用提取液于室温(优选25℃)、黑暗预处理2～3天。

诱导培养基以不含无机氮源的N₆培养基为基本培养基，其中加有谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L，pH 5.5～6.2。培养前将小孢子用培养基洗涤1～2次，然后用该培养基将小孢子密度调节至1.0～1.2×10⁵/ml，取约1～2ml小孢子悬浮液接种于培养皿(例如，30×15mm)，Parafilm封口，室温(例如25℃)暗培养15～25天。

在一具体实施例中，所述N6培养基中不含有KNO₃和(NH₄)₂SO₄。

N₆培养基中还可添加有2，4，5-T 0.5～1.5mg/L、KT 0.3～0.8mg/L和麦芽糖70～120g/L。

N₆培养基中所含的2，4，5-T较佳为0.8～1.2mg/L，更佳为约1.0mg/L。

KT较佳为0.4～0.6mg/L，更佳为约0.5mg/L。

麦芽糖较佳为80～100g/L，优选为90g/L。

谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L，更佳为约500～600mg/L。

pH优选为约5.6～5.8。

2，4，5-T可用2，4-D代替，浓度为0.5～1.5mg/L，优选为0.8～1.2mg/L，更佳为约1.0mg/L。

或者可同时使用2，4，5-T和2，4-D，两者的总浓度范围为0.5～1.5mg/L，优选为0.8～1.2mg/L，更佳为约1.0mg/L。

在一个优选的实施方式中，培养基N₆的配方为如下表1所示(单位：mg/L)：

表1

N₆大量元素：

CaCl₂·2H₂O 166

MgSO₄·7H₂O 185

KH₂PO₄ 400

N₆微量元素：

H₃BO₃ 1.6

KI 0.83

MnSO₄·4H₂O 5.0

ZnSO₄·7H₂O 1.5

N₆铁盐：

Na₂EDTA 37.3

FeSO₄·7H₂O 27.8

N₆有机元素：

盐酸硫胺素 1.0

盐酸吡多辛 0.5

甘氨酸 2.0

烟酸 0.5

肌醇 100.0

N₆培养基可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品，然后按照上述配方添加所需的成分。本领域技术人员将理解，可对上述表1所示的浓度作出适当的变动，例如有大约5％(例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围)或更低的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如，以肌醇为例，每升N₆培养基中可含有大约95～105mg的肌醇(5％的变动幅度)。其它成分的浓度也如此变动。此外，N₆培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。

诱导培养后将胚状体转移至分化培养基上。分化培养基以无KNO₃和NH₄NO₄的2/3MS为基础培养基，其中加有谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L，PH为5.5～6.2。在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下分化胁迫培养25～30天，直至分化出绿色再生植株。

分化培养基中还可添加有6-BA 0.3～0.8mg/L、KT 1～2mg/L、NAA 0.02～0.08mg/L和麦芽糖10～50g/L。

6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)的浓度优选为0.4～0.6mg/L，更优选为约0.5mg/L。

KT(6-糠氨基嘌呤)的浓度优选为1.2～1.8mg/L，更优选为约1.5mg/L。

NAA(萘乙酸)的浓度优选为0.04～0.06mg/L，更优选为约0.05mg/L。

麦芽糖的浓度优选为20～40g/L，更优选为约30g/L。

谷氨酰胺和水解干酪素的浓度优选分别为400～500mg/L，更优选分别为400mg/L。

培养基的pH优选约为5.6～5.8。

选取分化出的再生植株，转入添加有多效唑(MET)3.0～10.0mg/L和蔗糖10～30g/L，pH5.5～6.2的1/2MS生根壮苗培养基。在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行25～30天的生根壮苗培养。

该1/2MS生根壮苗培养基中，NAA的优选浓度为0.03～0.1mg/L，更优选浓度为0.05mg/L。MET的浓度优选为4.0～6.0m/L，更优选为约5.0mg/L。蔗糖的浓度优选分别为15～25g/L，更优选分别为20g/L。pH优选为约5.6～5.8。

经过生根壮苗培养的耐低氮植株成为根茎叶齐全的完整植株，移栽前1天先将培养瓶打开，在实验室中炼苗。炼苗结束后，用镊子小心地把植株从培养瓶中移出，尽量保持根系的完整，洗去附着的培养基，将苗移入育苗钵中，浇水后用塑料薄膜罩住，保湿2～4天左右。去掉塑料薄膜后在20±1℃，每天10～12小时光照的条件下生长至成熟。成熟后的种子按株收获。

所收获的种子用溶液培养法培养。种子先用例如1％NaClO消毒30分钟，用清水冲洗干净，28～32℃浸种3～6小时，室温例如25～28℃催芽过夜，露白后播种到经高温高压灭菌的蛭石中，两叶一心时，挑选整齐一致的幼苗，去胚乳后用海绵条固定在打孔的泡沫板上，然后放入盛有清水的周转箱(40cm×27cm×10cm)中，恢复两天后换上营养液，每块泡沫板上平均分布30个孔(6×5)，每个处理7～10株。

营养液配置方法参照Hoagland’s营养液配方，设正常供氮和1/4供氮2个水平。正常供氮时氮的浓度为1～1.8mmol/L，优选1.2～1.6mmol/L，更优选1.4～1.5mmol/L，例如可以为约1.44mmol/L。

1/4供氮时氮的浓度为正常供氮水平的1/4，例如，当正常供氮为1.44mmol/L时，1/4供氮为0.36mmol/L。

可以各种形式供氮，例如以NH₄NO₃形态供应，每周更换一到两次营养液，每天补充水分，调pH为5.5～5.7左右，生长期间温度为15±5℃，病、虫害按常规方法管理，约5周后收苗。收获的植株先用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗，从而可获得耐低氮株系。

在一个优选的实施方式中，基础培养基MS的配方为如下表2所示(单位：mg/L)：

表2

MS大量元素：

NH₄NO₄ 1650

KNO₃ 1900

CaCl₂·2H₂0 440

MgSO₄·7H₂O 370

KH₂PO₄ 170

MS微量元素：

H₃BO₃ 6.2

KI 0.83

MnSO₄·4H₂O 22.3

ZnSO₄·7H₂O 8.6

Na₂MoO₄·2H₂O 0.25

CuSO₄·5H₂O 0.025

CoCl₂·6H₂O 0.025

MS铁盐：

Na₂EDTA 37.3

FeSO₄·7H₂O 27.8

MS有机元素：

盐酸硫胺素 0.1

盐酸吡多辛 0.5

烟酸 0.5

甘氨酸 2.0

肌醇 100.0

MS培养基可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品，并根据上述配方加入所需的成分。1/2MS培养基则是将MS培养基的大量元素减半，2/3MS培养基则是将MS培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有机元素不变。1/2MS和2/3MS培养基的pH通常在5.4～6.0的范围内，例如可以是5.6～5.8。

本领域技术人员将理解，可对上述表2所示的浓度作出适当的变动，例如有大约5％(例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围)或更低的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如，以肌醇为例，每升N₆培养基中可含有大约95～105mg的肌醇(5％的变动幅度)。其它成分的浓度也如此变动。此外，2/3MS诱导培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。

与传统育种方法相比，本发明方法简便，易于掌握、实施；耐低氮株系的获得和耐低氮性状的筛选都在实验室完全一致的条件下进行，不受外界条件的影响；利用小孢子作为起始材料，可获得大量的胚状体，在小孢子培养过程中进行耐低氮性状离体筛选，可严格筛选，大胆淘汰；整个过程都在培养室中进行，同时又降低了劳动力和农田的使用，且可周年重复试验，不断提供筛选材料，既缩短了育种时间，又能获得大量的种质材料；采用胚状体诱导和再生植株分化二个阶段分别进行离体耐低氮筛选，并结合耐低氮株系种子苗期生长过程中的回复筛选，筛选结果真实可信。

申请人的实验表明，利用本发明可在不到二年的时间内完成麦类耐低氮株系获得及筛选。本发明可大大缩短育种时间。所得材料是经过二步胁迫筛选，经过染色体加倍后耐低氮性状得以纯合、固定，同一株系的后代，表现统一。利用本发明，在二年时间内，已离体筛选获得3份耐低氮株系。

因此，本申请另一方面还包括采用本发明方法获得的各步骤所产生的胚状体、最后所获得的耐低氮株系等。

本申请的麦类作物可包括大麦和小麦。

本申请还包括用于改良麦类作物耐低氮性状的诱导培养基、分化培养基和生根壮苗培养基。

所述诱导培养基以N₆培养基为基础，不含无机氮源，例如KNO₃和(NH₄)₂SO₄，而添加了谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L，pH 5.5～6.2。N₆诱导培养基的基础成分如上述表1所示。

所述培养基还可含有2，4，5-T 0.5～1.5mg/L、KT 0.3～0.8mg/L，和麦芽糖70～120g/L。

2，4，5-T的浓度较佳为0.8～1.2mg/L，更佳为约1.0mg/L。

KT的浓度较佳为0.4～0.6mg/L，更佳为约0.5mg/L。

麦芽糖的浓度较佳为80～100g/L，优选为90g/L。

谷氨酰胺和水解干酪素的浓度更佳为约500～600mg/L。

2，4，5-T(2，4，5-三氯苯氧乙酸)可用2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)代替，浓度为0.5～1.5mg/L，优选为0.8～1.2mg/L，更佳为约1.0mg/L。

诱导培养基基的pH优选约为5.6～5.8。

所述分化培养基以不含无机氮源(例如KNO₃和NH₄NO₄)的2/3MS为基本培养基，其中加有谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L，pH为5.5～6.2。MS培养基的基本成分如上表2所示。2/3MS培养基则是将MS培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有机元素不变。分化培养基还可含有6-BA0.3～0.8mg/L、KT 1～2mg/L、NAA 0.02～0.08mg/L和麦芽糖10～50g/L。

在优选的实施方式中，分化培养基中6-BA的浓度优选为0.4～0.6mg/L，更优选为约0.5mg/L。

KT的浓度优选为1.2～1.8mg/L，更优选为约1.5mg/L。

NAA的浓度优选为0.04～0.06mg/L，更优选为约0.05mg/L。

麦芽糖的浓度优选为20～40g/L，更优选为约30g/L。

谷氨酰胺和水解干酪素的浓度优选分别为400～600mg/L，更优选分别为400mg/L。

分化培养基的pH优选约为5.6～5.8。

生根壮苗培养基以1/2MS培养基为基础，添加有NAA 0.03～1.00mg/L，多效唑(MET)3.0～8.0mg/L和蔗糖10～30g/L，pH5.5～6.2。

NAA的优选浓度为0.03～0.1mg/L，更优选浓度为0.05mg/L。

MET的浓度优选为4.0～6.0m/L，更优选为约5.0mg/L。

蔗糖的浓度优选分别为15～25g/L，更优选分别为20g/L。

生根壮苗培养基的pH优选为约5.6～5.8。

须知，可对表1和2中所示的成分作出适当的变动，只要由此变动得到的培养基仍发挥与原始培养基一样的作用即可。

本申请还包括含有本申请所述N₆诱导培养基、2/3MS分化培养基和1/2MS生根壮苗培养基的套盒。任选地，该套盒还可包括指导使用其中所包含的试剂实施获得抗赤霉病性状稳定的材料的方法的说明书。

在一具体实施例中，所述套盒含有所述N₆诱导培养基、2/3MS分化培养基和1/2MS生根壮苗培养基。

在另一具体实施例中，所述套盒还含有本文所述的提取液，该提取液含有甘露醇50～70g/L、CaCl₂0.9～1.3g/L、MES(2-吗啉乙磺酸)0.95～1.0g/L(优选0.976g/L)。在一优选实施例中，甘露醇的优选浓度为55～65g/L，更优选为60～65g/L。CaCl₂的优选浓度为1.0～1.2g/L，更优选为1.1g/L。MES的优选浓度为0.96～0.99g/L，更优选为0.97～0.98g/L。

下文将以大麦为例对本发明进行描述。应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下可对本发明做出各种修改和变动。且也可采用本发明的方法用于其它禾谷类作物，并能产生相同的效果。以下实施例仅仅是阐述性的，本发明的范围由本申请的权利要求加以限定。如无特别说明，本发明所用的百分比为重量体积百分比。此外，应理解，上述各培养基中各成分的优选范围可任意组合，只要其能实现本发明的发明目的即可。

实施例

实施例1：大麦小孢子的耐低氮胁迫培养

以“花30”为供试材料，从大田选取中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的穗子，放入冰箱冷藏15天。接种时，穗子用饱和的漂白粉溶液消毒15min，无菌水冲洗3～4次。每个试管接10个穗子，倒入15ml甘露醇60g/L、CaCl₂1.1g/L、MES 0.976g/L的提取液，用3000rpm的高速分散器超速旋切，150目筛网过滤，滤液以800rpm低速离心，重复3次，收集小孢子。小孢子用提取液于25℃、黑暗预处理2d。诱导培养基以无KNO₃和(NH₄)₂SO₄的N₆培养基为基本培养基，其中加有2，4，5-T 1.0mg/L、KT 0.5mg/L，麦芽糖90g/L，谷氨酰胺和水解干酪素各600mg/L，pH 5.8。培养前将小孢子用培养基洗涤1次，然后用培养基将小孢子密度调节至1.0～1.2×10⁵/ml，取1.5ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)，Parafilm封口，25℃暗培养21d。

实施例2：耐低氮再生植株的获取

诱导培养21d后将胚状体转移至分化培养基上。分化培养基以无KNO₃和NH₄NO₄的2/3MS为基本培养基，其中加有6-BA 0.5mg/L、KT 1.5mg/L、NAA0.05mg/L和麦芽糖30g/L，谷氨酰胺和水解干酪素各400mg/L，PH为5.8。在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下分化胁迫培养25～30天，直至分化出绿色再生植株。

实施例3：耐低氮再生植株的生根培养

选取分化出的再生植株，转入添加谷氨酰胺和水解干酪素各400mg/L、多效唑(MET)5.0mg/L和蔗糖20g/L，pH5.8的1/2MS生根壮苗培养基。在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行25～30天的生根壮苗培养。

实施例4：耐低氮植株的移栽及种子收获

经过生根壮苗培养的耐低氮植株成为根茎叶齐全的完整植株，移栽前1天先将培养瓶打开，在实验室中炼苗。炼苗结束后，用镊子小心地把植株从培养瓶中移出，尽量保持根系的完整，洗去附着的培养基，将苗移入育苗钵中，浇水后用塑料薄膜罩住，保湿3d。去掉塑料薄膜后在20±1℃，每天10～12小时光照的条件下生长至成熟。成熟后的种子按株收获。

实施例5：耐低氮株系的苗期筛选

溶液培养法的种子用1％NaClO消毒30分钟，用清水冲洗干净，30℃浸种5小时，25℃催芽过夜，露白后播种到经高温高压灭菌的蛭石中，两叶一心时，挑选整齐一致的幼苗，去胚乳后用海绵条固定在打孔的泡沫板上，然后放入盛有清水的周转箱(40cm×27cm×10cm)中，恢复两天后换上营养液，每块泡沫板上平均分布30个孔(6×5)，每个处理7～10株。营养液配置方法参照Hoagland’s营养液配方，设正常供氮(1.44mmol/L)和1/4供氮(0.36mmol/L)2个水平，以NH₄NO₃形态供应，每周更换一次营养液，每天补充水分，调pH为5.5左右，生长期间温度为15±5℃，病、虫害按常规方法管理，5周后收苗。收获的植株先用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗，测定株高和根长，然后分成地上部和根两部分，分别在105℃下杀青30分钟，70℃下烘至恒重，测定茎叶和根的干物质重量。

实施例6

按实施例1收集大麦品种“花30”的小孢子培养诱导胚状体，按实施例2获取耐低氮的再生植株，按实施例3进行生根壮苗培养，按实施例4移栽并收获种子，收获后的种子按实施例5进行进一步的耐低氮株系筛选。

以原始材料的种子作为对照，同时进行耐低氮苗期筛选。

实验证明，在含1/4N的营养液中，3份耐低氮株系自交一代株高下降率在22.89％～28.32％、主根长度下降率10.99％～25.12％、茎叶干重下降率在33.96％～36.44％、根干重下降率在31.45％～39.58％，而起始材料花30的株高下降率为37.35％、主根长度下降率36.25％、茎叶干重下降率为58.19％、根干重下降率为61.66％。由此可见，筛选出的株系较原始品种的耐低氮性状十分明显。结果见下表3。

表3中，下降率＝(正常供氮-1/4供氮)/正常供氮×100％。

实施例7

以大麦品系“BI-49”为供试材料，按实施例1获得胚状体，按实施例2获得再生植株，按实施例3获得生根的再生植株，按实施例4收获种子，按实施例5进行苗期筛选，获得2个耐盐株系，结果见表4。

表4中，下降率＝(正常供氮-1/4供氮)/正常供氮×100％。

Claims

1.一种改良大麦耐低氮性状的方法，该方法包括：

1)取大麦孕穗期花药游离小孢子，置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L的不含无机氮源的N₆诱导培养基上培养，获取胚状体；

2)将步骤1)所得的胚状体置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L的不含无机氮源的2/3MS分化培养基上培养，获取再生植株；和

3)将再生植株置于添加萘乙酸0.03～1.00mg/L、多效唑3.0～10.0mg/L和蔗糖10～40g/L，pH5.5～6.2的1/2MS生根壮苗培养基上培养，获取根、茎、叶完整的再生植株；

由此获得具备耐低氮性状的再生植株；

其中，所述N₆诱导培养基还添加有2，4，5-三氯苯氧乙酸和/或2，4-二氯苯氧基乙酸0.5～1.5mg/L、6-糠氨基嘌呤0.3～0.8mg/L和麦芽糖70～120g/L；所述2/3MS分化培养基还添加有6-苄氨基腺嘌呤0.3～0.8mg/L、6-糠氨基嘌呤1～2mg/L、萘乙酸0.02～0.08mg/L和麦芽糖10～50g/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N₆诱导培养基添加有2，4，5-三氯苯氧乙酸0.8～1.2mg/L、6-糠氨基嘌呤0.3～0.8mg/L和麦芽糖70～120g/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N₆诱导培养基还添加有2，4，5-三氯苯氧乙酸和/或2，4-二氯苯氧基乙酸0.8～1.2mg/L、6-糠氨基嘌呤0.4～0.6mg/L和麦芽糖80～100g/L。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2/3MS分化培养基还添加有6-苄氨基腺嘌呤0.4～0.6mg/L、6-糠氨基嘌呤1.2～1.8mg/L、萘乙酸0.04～0.06mg/L和麦芽糖20～40g/L。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述正常供氮以1～1.8mmol/L的浓度供氮，所述1/4供氮中氮的浓度为正常供氮水平的1/4。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，N₆诱导培养基中谷氨酰胺和水解干酪素的浓度各为500～600mg/L。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N₆诱导培养基的pH为5.6～5.8。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，2/3MS分化培养基中谷氨酰胺和水解干酪素的浓度各为400～500mg/L。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2/3MS分化培养基的pH为5.6～5.8。

11.用于权利要求1所述方法的N₆诱导培养基，其特征在于，所述培养基以N₆培养基为基础培养基，添加有谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L、2，4，5-三氯苯氧乙酸和/或2，4-二氯苯氧基乙酸0.5～1.5mg/L、6-糠氨基嘌呤0.3～0.8mg/L和麦芽糖70～120g/L，且不含无机氮源。

12.如权利要求11所述的N₆诱导培养基，其特征在于，所述培养基以N₆培养基为基础培养基，添加有谷氨酰胺和水解干酪素各500～600mg/L、2，4，5-三氯苯氧乙酸0.8～1.2mg/L、6-糠氨基嘌呤0.4～0.6mg/L和麦芽糖80～100g/L，且不含无机氮源。

13.用于权利要求1所述方法的2/3MS分化培养基，其特征在于，所述培养基以MS培养基为基础培养基，其中MS培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有机元素不变，且所述2/3MS分化培养基添加有谷氨酰胺和水解干酪素各400～800mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.3～0.8mg/L、6-糠氨基嘌呤1～2mg/L、萘乙酸0.02～0.08mg/L和麦芽糖10～50g/L，且不含无机氮源。

14.用于权利要求1所述方法的1/2MS生根壮苗培养基，其特征在于，所述培养基以MS培养基为基础培养基，其中MS培养基的大量元素减半，且所述1/2MS生根壮苗培养基添加有萘乙酸0.03～1.00mg/L、多效唑3.0～10.0mg/L和蔗糖10～40g/L，pH5.5～6.2。