CN105340755B - 禾谷类作物单株来源小孢子连续培养高频再生植株方法 - Google Patents

禾谷类作物单株来源小孢子连续培养高频再生植株方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及禾谷类作物单株来源小孢子连续培养高频再生植株方法。具体而言，本发明涉及禾谷类作物小孢子培养方法和由禾谷类作物单株来源小孢子培养获得再生植株的方法，包括从禾谷类作物的单株幼穗中分离出小孢子，并对分离出的小孢子进行愈伤诱导和分化的步骤，其中，所述从禾谷类作物的幼穗中分离出小孢子的步骤包括不断地从室内种植的、不断分蘖孕穗的同一株禾谷类作物获取中部小花小孢子发育处于单核早‑中期的幼穗，以对每次获取的幼穗实施所述分离、愈伤诱导和分化步骤。

Description

禾谷类作物单株来源小孢子连续培养高频再生植株方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及禾谷类作物单株来源小孢子连续培养高频再生植株方法。
背景技术
小孢子离体培养技术是目前发展起来的一种重要单倍体育种技术，在多种植物中都已开展游离小孢子培养，但高频再生体系的建立还仅限于大麦、油菜、烟草、小麦等作物。陆瑞菊(陆瑞菊，大麦游离小孢子培养技术的优化及单倍体耐盐、耐低氮胁迫筛选体系的建立[D]，南京农业大学，2012年)等以大田种植大麦(Hordeum vulgare L.)材料为供体植株，建立了高效的小孢子再生体系，但由于大田环境复杂、受天气等影响较大，供体植株生长条件难以控制，并且只能在当季获得小孢子培养供体材料，取材(幼穗)受季节性限制。温室种植可在很大程度上克服大田种植的局限，提供稳定一致的生长环境，并且可以人为调节光、温、水、肥等生长条件，使供体植株处于最佳生长状态。
小孢子培养阶段结合高盐、低氮等胁迫培养，可以在小孢子培养的早期阶段进行基因重组体的筛选与纯合，从而减少育种选择的强度和工作量，大大提高育种效率(黄剑华等，2003；黄剑华，2007；万光龙，2007)。利用单株来源小孢子连续培养，可以长时期开展离体小孢子的胁迫培养，并且使多世代的小孢子连续胁迫培养成为可能，提高定向选择的稳定性。
对种子或离体小孢子进行理化诱变，结合小孢子培养可以获得耐逆性提高的育种材料(顾宏辉等，2003；程芳芳，2014；陆瑞菊等，2014；王亦菲等，2014)。利用理化措施对单株来源的小孢子进行诱变，可以获得单株(或单粒种子)起源遗传背景完全一致的性状纯合的再生植株，是进行遗传突变分析的理想材料，目前还未见利用大麦等禾谷类作物单株来源的小孢子开展诱变和培养工作。
发明内容
本发明的目的是改进已有大麦等禾谷类作物小孢子培养流程，提供一种以室内种植单株为供体材料，利用单株持续分蘖实现游离小孢子连续培养的方法。
本发明第一方面提供一种单株起源的小孢子培养方法，包括从禾谷类作物的幼穗中分离出小孢子，并对分离出的小孢子进行愈伤诱导和分化的步骤，其中，所述从禾谷类作物的幼穗中分离出小孢子的步骤包括不断地从室内种植的、不断分蘖孕穗的同一株禾谷类作物获取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，以对每次获取的幼穗实施所述分离、愈伤诱导和分化步骤。
本发明第二方面提供一种由禾谷类作物单株来源小孢子培养获得再生植株的方法，包括从禾谷类作物的幼穗中分离出小孢子，并对分离出的小孢子进行愈伤诱导和分化，以及将分化获得的再生苗培养成再生植株的步骤，其中，所述从禾谷类作物的幼穗中分离出小孢子的步骤包括不断地从室内种植的、不断分蘖孕穗的同一株禾谷类作物获取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，以对每次获取的幼穗实施所述分离、愈伤诱导、分化和培养步骤。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，在以下条件进行室内种植：光照强度1500～2500lx，光照时间10～16h/天，湿度60％～80％，光照时室温20～25℃，黑暗时室温16～22℃。
在一个具体实施例中，在以下条件进行室内种植：光照2000lx，光照时间12h/天，湿度70％，光照时室温22℃，黑暗时室温18℃。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，选取所述禾谷类作物中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，剪去叶片，保留上部两片叶子基部1～2.0cm。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，获取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗后，保湿条件下于0～8℃放置10～30天。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述分离包括：将幼穗的花苞加到提取液中，超速旋切，过滤，从而分离得到小孢子。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，分离获得小孢子后，将分离到的小孢子加到提取液中，于室温(例如23～28℃)、黑暗中放置18～28小时后，纯化小孢子。
在一个具体实施例中，所述提取液为55～65g/L甘露醇，1.0～1.2g/L CaCl2、0.960～0.985g/L MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)和15～30mg/L秋水仙碱，pH 5.6～6.0；优选60g/L的甘露醇，1.1g/L CaCl2、0.976g/L MES和20mg/L秋水仙碱，pH 5.8。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，将纯化的小孢子加到愈伤诱导培养基中进行愈伤诱导，其中，所述愈伤诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/L KT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L MES、300～500mg/L水解干酪素和1400～1800mg/L谷氨酰胺，pH为5.6～6.0。
在一个具体实施例中，所述愈伤诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)、400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8。
在一个具体实施例中，在室温(如23～28℃)、黑暗条件下进行愈伤诱导15～25天，优选18～21天。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，愈伤诱导结束后，将获得的愈伤组织转移到分化培养基，诱导分化形成再生苗。
在一个具体实施例中，分化培养基为2/3MS，添加20～40g/L的麦芽糖、0.3～0.7mg/L的6-BA、1.3～1.7mg/L的KT、0.03～0.07mg/L的NAA和4.5～6.5g/L的琼脂，pH为5.6～6.0。
在一个具体实施例中，分化培养基为2/3MS，添加30g/L的麦芽糖、0.5mg/L的6-BA、1.5mg/L的KT、0.05mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂，pH 5.8。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，待分化的再生苗长至2～4cm时将其转移至壮苗培养基。
在一个具体实施例中，壮苗培养基为1/2MS，添加20～40g/L的麦芽糖、0.03～0.07mg/L的NAA、3.0～5.0mg/L的多效唑和4.5～6.5g/L的琼脂，pH为5.6～6.0。
在一个具体实施例中，壮苗培养基为1/2MS，添加30g/L的麦芽糖、0.05mg/L的NAA、4.0mg/L的多效唑和5.5g/L的琼脂，pH为5.8。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，再生苗转至壮苗培养基后，至再生苗长3～5cm时，取出洗净根部培养基，然后置于清水中漂苗2～3天。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，漂苗结束后，加入Hoagland溶液，水培5～15天，至根长5～10cm。
在一个具体实施例中，所述Hoagland溶液的配方如下：0.1～0.3mM NH4NO3，4～6mMKNO3，1～3mM Ca(NO3)2，1～3mM MgSO4，0.05～0.15mM KH2PO4，0.3～0.07mM Na2SiO3，0.03～0.07mM NaFe(III)–EDTA，0.008～0.012mM H3BO3，0.003～0.007mM MnCl2，0.003～0.007mMZnSO4，0.0003～0.0007mM CuSO4，0.00008～0.00015mM Na2MoO3，使用前将其pH值调节至5.8～6.2。
在一个具体实施例中，所述Hoagland溶液的配方如下：0.2mM NH4NO3，5mM KNO3，2mM Ca(NO3)2，2mM MgSO4，0.1mM KH2PO4，0.5mM Na2SiO3，0.05mM NaFe(III)–EDTA，0.01mMH3BO3，0.005mM MnCl2，0.005mM ZnSO4，0.0005mM CuSO4，0.0001mM Na2MoO3，使用前溶液pH值用稀盐酸调节至6.0左右。
在本发明第二方面的一个具体实施例中，所述方法还包括：将所获得的再生植株室内种植，并从其不断分蘖孕穗的同一株禾谷类作物获取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，对每次获取的幼穗实施所述分离、愈伤诱导、分化和培养，以获得下一代植株。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，在所述愈伤诱导培养基中添加400～800mg/L的NaCl或将所述愈伤诱导培养基的N6基本培养基中的氮含量降低为0.5～1.5mM，对小孢子形成愈伤组织过程中进行盐胁迫或低氮营养胁迫。
在一个具体实施例中，盐胁迫或低氮营养胁迫后，将所得愈伤组织在所述分化培养基中分化成苗，将所得再生苗经倍性鉴定后实施所述壮苗，然后转移到盆钵，在人工气候室种植获得幼穗，直接作为下一代小孢子培养供体植株。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，分离获得小孢子后，将分离到的小孢子加到提取液中，在提取液中加入化学诱变剂，于室温(例如23～28℃)、黑暗中放置18～28小时后，纯化小孢子，其中，所述提取液为55～65g/L、优选60g/L的甘露醇，添加1.0～1.2g/L、优选1.1g/L的CaCl2，0.960～0.985g/L、优选0.976g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)和15～30mg/L、优选20mg/L的秋水仙碱，pH 5.6～6.0，优选5.8，加入1～5mg/L、优选3mg/L的甲基磺酸乙酯(EMS)作为化学诱变剂。
在一个具体实施例中，所述提取液为甘露醇60g/L，添加1.1g/L CaCl2、0.976g/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)和20mg/L秋水仙碱，pH 5.8，加入3mg/L的甲基磺酸乙酯(EMS)作为化学诱变剂。
在本发明上述方面的一个具体实施例中，对幼穗采用5～15Gy的钴60γ射线进行辐照后，再分离小孢子。
本发明还涉及上述方法在突变群体创制、遗传分析、作物新品种的创制和品种选育中的应用。
本发明建立方法相对于目前已报道的小孢子培养方法，其改进之处在于：
1)利用人工气候室种植的单株为供体材料，促进其持续分蘖获得幼穗(取材周期可延长半年以上)进行游离小孢子培养；
2)小孢子培养获得的再生植株(不经种子阶段)直接用于再次小孢子培养，缩短了不同世代间小孢子培养时间。
具体实施方式
本发明的禾谷类作物单株起源小孢子培养方法包括从禾谷类作物的单株幼穗中分离出小孢子，并对分离出的小孢子进行愈伤诱导和分化的步骤。其中，所述从禾谷类作物的单株幼穗中分离出小孢子的步骤包括不断地从室内种植的、不断分蘖孕穗的同一株禾谷类作物获取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，以对每次获取的幼穗实施所述分离、愈伤诱导和分化步骤。本发明的方法还包括将分化获得的再生苗不经种子阶段直接进行小孢子培养成再生植株的步骤。
本发明方法还可以进一步结合诱变和胁迫培养：通过单株幼穗或游离小孢子诱变可以获得单株(或单粒种子)起源遗传背景完全一致的性状纯合的再生突变体植株；通过小孢子连续培养阶段的胁迫培养，可以针对同一单株来源材料进行多世代的胁迫筛选，有利于抗逆再生植株的定向选择。这一方法的建立和应用，将会提高小孢子培养技术在大麦等禾谷类作物的利用效率，为育种应用和遗传分析提供优异种质材料。
本发明中，“连续培养”指多次从同一株禾谷类作物获得幼穗、进行小孢子培养，也包括从单株禾谷类作物获得小孢子、将其再生成植株后，再使用该再生植株不经种子再生阶段而直接获得幼穗进行小孢子培养。
室内种植
可采用常规的方法室内种植禾谷类作物。适用于本发明的禾谷类作物优选是那些具有无限分蘖的特性的禾谷类作物，尤其是任何适于温室和大田种植的大麦、小麦和水稻等禾谷类作物。
室内种植的条件一般包括：光照强度1500～2500lx，光照时间10～16h/天，湿度60％～80％，光照时室温20～25℃，黑暗时室温16～22℃。优选的实施例中，室内种植的条件为：光照2000lx，光照时间12h/天，湿度70％，光照时室温22℃，黑暗时室温18℃。
室内种植时，可通过水肥调节来促进室内种植的禾谷类作物不断分蘖孕穗，延长植株的分蘖期可达6个多月，从而可实现单株连续取材进行游离小孢子培养。
供体材料的取材和预处理
通常从室内种植的禾谷类作物单株上选取其中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，剪去叶片，保留上部两片叶子基部1～2.0cm，用干净的湿纱布包好幼穗，放入保鲜袋中保湿，0～8℃放置10～30天，通常是15-25天，例如15天左右。冷藏的温度可以在0-8℃范围之间，例如可以为3-8℃。通常可在约4℃冷藏。
在一个具体实施例中，对幼穗采用5～15Gy的钴60γ射线进行辐照后，如上文所述冷藏2－4周再分离小孢子。
小孢子游离
可采用常规的技术实施小孢子游离，例如可参照陆瑞菊等(2001)和Lu等(2008)。
通常，穗子先消毒，例如用饱和的漂白粉溶液消毒10-20min，无菌水冲洗2-4次。每个离心管中接入3～10个穗子的花苞，倒入15-20ml提取液(55～65g/L、优选60g/L的甘露醇)，用高速分散器超速(例如3000-4000rpm)旋切，300目筛网过滤，滤液低速(例如500-1000rpm)离心3～6分钟，重复2-3次，收集小孢子。
分离获得小孢子后，将分离到的小孢子加到提取液中，于室温(例如23～28℃)、黑暗中放置18～28小时后，纯化小孢子。
在一个具体实施例中，分离获得小孢子后，将分离到的小孢子加到提取液中，于室温(例如23～28℃)、黑暗中放置18～28小时后，纯化小孢子，其中，所述提取液为55～65g/L、优选60g/L的甘露醇，添加1.0～1.2g/L、优选1.1g/L的CaCl2，0.960～0.985g/L、优选0.976g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)和15～30mg/L、优选20mg/L的秋水仙碱，pH 5.6～6.0，优选5.8。优选的是，所述提取液为甘露醇60g/L，添加1.1g/L CaCl2、0.976g/L MES和20mg/L秋水仙碱，pH 5.8。
在一个具体实施例中，在提取液中加入1～5mg/L、优选3mg/L的甲基磺酸乙酯(EMS)作为化学诱变剂，在加入分离的小孢子后在室温、黑暗中放置18～28小时。
愈伤诱导
诱导前，先用愈伤诱导培养基洗涤小孢子，然后将小孢子加到愈伤诱导培养基中，在室温(如23～28℃)、黑暗条件下进行愈伤诱导15～25天，优选18～21天。
通常，培养前先用愈伤诱导培养基洗涤小孢子1到2次，然后用该培养基将小孢子密度调节至1.0～1.2×105个/ml，取大约1.5-3ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)，Parafilm封口，进行愈伤诱导。
适用于本发明的愈伤诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/L KT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L MES、300～500mg/L水解干酪素和1400～1800mg/L谷氨酰胺，pH为5.6～6.0。
优选的，愈伤诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8。
N6基本培养基为本领域周知的培养基，其配方如下表1所示：
表1：N6培养基的配方(单位：mg/L)
N6大量元素：
(NH4)2SO4 463
KNO3 2830
CaCl2·2H2O 166
MgSO4·7H2O 185
KH2PO4 400
N6微量元素：
H3BO3 1.6
KI 0.83
MnSO4·4H2O 4.4
ZnSO4·7H2O 1.5
N6铁盐：
Na2EDTA 37.3
FeSO4·7H2O 27.8
N6有机元素：
盐酸硫胺素 1.0
盐酸吡多辛 0.5
甘氨酸 2.0
烟酸 0.5
在一个具体实施例中，在所述愈伤诱导培养基中添加400～800mg/L的NaCl或将所述愈伤诱导培养基的N6基本培养基中的氮含量降低为0.5～1.5mM，对小孢子形成愈伤组织过程中进行盐胁迫或低氮营养胁迫。盐胁迫或低氮营养胁迫后，可将所得愈伤组织在所述分化培养基中分化成苗，将所得再生苗经倍性鉴定后实施所述壮苗，然后转移到盆钵，在人工气候室种植，作为下一代供体植株。
愈伤组织分化
小孢子培养形成愈伤周知后，将其转移至分化培养基诱导分化再生苗。分化可在常规条件下进行。
适用于本发明的分化培养基为2/3MS，添加了20～40g/L的麦芽糖、0.3～0.7mg/L的6-BA、1.3～1.7mg/L的KT、0.03～0.07mg/L的NAA和4.5～6.5g/L的琼脂，pH为5.6～6.0。在一个具体实施例中，分化培养基为2/3MS，添加了30g/L的麦芽糖、0.5mg/L的6-BA、1.5mg/L的KT、0.05mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂，pH 5.8。
MS培养基为本领域周知的培养基，其配方如下表2所示(单位：mg/L)：
表2
MS大量元素：
NH4NO4 1650
KNO3 1900
CaCl2·2H2O 440
MgSO4·7H2O 370
KH2PO4 170
MS微量元素：
H3BO3 6.2
KI 0.83
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
MS铁盐：
Na2EDTA 37.3
FeSO4·7H2O 27.8
MS有机元素：
盐酸硫胺素 0.1
盐酸吡多辛 0.5
烟酸 0.5
甘氨酸 2.0
肌醇 100.0
N6和MS可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品。2/3MS培养基则是将MS培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有机元素不变。然后根据本文所述配方配制本文的2/3MS诱导培养基。1/2MS培养基则是将MS培养基的大量元素减少1/2，而微量元素、铁盐和有机元素不变。然后根据本文所述配方配制本文的1/2MS诱导培养基。
本领域技术人员将理解，可对上述表1和2所示的浓度做出适当的变动，例如有大约5％或更低(例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围)的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如，以肌醇为例，每升MS培养基中可含有大约95-105mg的肌醇(5％的变动幅度)。其它成分的浓度也如此变动。此外，培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。
再生苗成株
待分化获得的再生苗长至2～4cm时将其转移至壮苗培养基。壮苗培养基为1/2MS，添加20～40g/L的麦芽糖、0.03～0.07mg/L的NAA、3.0～5.0mg/L的多效唑和4.5～6.5g/L的琼脂，pH为5.6～6.0。在一个具体实施例中，壮苗培养基为1/2MS，添加30g/L的麦芽糖、0.05mg/L的NAA、4.0mg/L的多效唑和5.5g/L的琼脂，pH为5.8。
再生苗转至壮苗培养基后，至再生苗长3～5cm时，取出洗净根部培养基，然后置于清水中漂苗2～3天。漂苗结束后，加入Hoagland溶液，水培5～15天，至根长5～10cm。
适用于本发明的Hoagland溶液通常含有NH4NO3，KNO3，Ca(NO3)2，MgSO4，KH2PO4，Na2SiO3，NaFe(III)–EDTA，H3BO3，MnCl2，ZnSO4，CuSO4，Na2MoO3，使用前将其pH值调节至5.8～6.2。
在一个具体实施例中，适用于本发明的Hoagland溶液的配方如下：0.1～0.3mMNH4NO3，4～6mM KNO3，1～3mM Ca(NO3)2，1～3mM MgSO4，0.05～0.15mM KH2PO4，0.3～0.07mMNa2SiO3，0.03～0.07mM NaFe(III)–EDTA，0.008～0.012mM H3BO3，0.003～0.007mM MnCl2，0.003～0.007mM ZnSO4，0.0003～0.0007mM CuSO4，0.00008～0.00015mM Na2MoO3，使用前将其pH值调节至5.8～6.2。
在一个具体实施例中，所述Hoagland溶液的配方如下：0.2mM NH4NO3，5mM KNO3，2mM Ca(NO3)2，2mM MgSO4，0.1mM KH2PO4，0.5mM Na2SiO3，0.05mM NaFe(III)–EDTA，0.01mMH3BO3，0.005mM MnCl2，0.005mM ZnSO4，0.0005mM CuSO4，0.0001mM Na2MoO3，使用前溶液pH值用稀盐酸调节至6.0左右。
任选地，将所获得的再生植株室内种植，并从其不断分蘖孕穗的同一株禾谷类作物获取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，对每次获取的幼穗实施本文所述的分离、愈伤诱导、分化和培养，从而可获得下一代植株。这一过程正常至少需要一年，而采用本发明方法至少可以节省半年时间就可实现跨世代培养。
大田培养
水培至根长约5～10cm时，将植株移栽至大田。95％以上植株自交结实，获得单株来源的永久DH株系群体。
本发明的效果
该方法具有以下优点：1)小孢子培养取材不受季节限制(幼穗取材时间约1个月左右)，当代幼穗的取材时间可以长达半年以上；2)可以短时间内实现不同世代的连续小孢子培养，母本材料的小孢子培养再生植株可以直接作为下一代供体植株(不经种子阶段)，这一过程正常至少需要一年，采用本发明方法至少可以节省半年时间实现跨世代培养；3)结合逆境胁迫措施(高盐、低氮等)可以在不同世代进行连续胁迫培养，用于定向选择；4)结合理化诱变措施可以获得单株(或单粒种子)起源的小孢子再生突变群体，用于突变体创制和遗传分析等。
以下将以具体实施例的方式描述本发明。应理解，本发明并不限于具体实施例所描述的方案。实施例中所采用到的方法、试剂，除非另有说明，否则按常规的方法实施所述方法、使用所述试剂。
用于本发明的提取液和愈伤诱导培养基经过滤灭菌，分化培养基和壮苗培养基为0.11Mpa、121℃高温高压灭菌15min。
大麦品种“花30”为长三角地区主栽啤酒大麦品种。
实施例1 大麦单株供体材料的温室种植
大麦品种“花30”株系6-3的三个单株(编号6-3-4，6-3-7，6-3-23)，均来自于“花30”小孢子培养再生获得的纯合株系6-3，种植于人工气候室，植株培养条件为：光照2000lx，12h/d，湿度70％，温度设置为光照22℃/黑暗18℃。通过水肥调节促进其不断分蘖孕穗，延长植株的分蘖期，最终可以连续6个多月取材进行游离小孢子培养。
实施例2 大麦单株供体材料的取材和预处理
选取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的大麦穗子，剪去叶片(保留上部两片叶子基部约1.5cm)，用干净的湿纱布包好幼穗，放入保鲜袋中保湿，标明取材日期和数量等，放入4℃冰箱中进行2～4周低温预处理。
实施例3 大麦单株来源小孢子游离培养
经过低温处理的材料取花苞游离小孢子，小孢子游离方法参照陆瑞菊等(2001)和Lu等(2008)。接种时，穗子消毒灭菌方法参照郭桂梅等(2014)。每个试管接4个穗子的花苞，加入12ml提取液(甘露醇60g/L，添加1.1g/L CaCl2、0.976g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)和20mg/L秋水仙碱，pH 5.8)，用高速分散器超速旋切。把旋切好的悬浮液，用300目筛网过滤，滤液以700rpm，5min低速离心，重复3次，收集小孢子。收集到的小孢子用提取液(甘露醇60g/L，添加1.1g/L CaCl2、0.976g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)和20mg/L秋水仙碱，pH5.8)于25℃、黑暗中预处理2d后再纯化培养小孢子。
培养前小孢子用愈伤诱导培养基洗涤1次，密度调节至1.0×105/m1，取1.5ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)中，Parafilm封口，25℃，暗培养。小孢子愈伤诱导培养基(N6基本培养基，铁盐加倍，添加90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/LMES、400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8)，小孢子培养18d时转移至分化培养基前统计愈伤组织数量。愈伤转到分化培养基(2/3MS+麦芽糖30g/L+6-BA 0.5mg/L+KT1.5mg/L+NAA 0.05mg/L+琼脂5.5g/L，pH 5.8)进行分化。
大麦单株来源的小孢子的愈伤诱导反应在连续培养中出现较大的波动性，小孢子愈伤产量随人工气候室供体植株的抽穗取材时间呈先增加后降低、不断反复的规律。抽穗后第15周取材愈伤产量最高，第7周取材愈伤产量为最低，两者相差近5倍。
通过人工气候室种植大麦单株连续6个多月不断取材进行小孢子培养，经过18次连续培养(包括盐胁迫培养)，3个单株都累计获得了千株以上的绿苗产量，平均单株成苗数为2035株，其中单株6-3-7成苗数最高，达3139株；单株6-3-4成苗数达1845株；单株6-3-23成苗数最少，为1122株。
实施例4 大麦单株来源小孢子再生苗的成株与结实
待实施例3获得的分化芽长至2-4cm时将其转移至壮苗培养基：1/2MS+蔗糖30g/L+NAA 0.05mg/L+多效唑4.0mg/L+琼脂5.5g/L，pH 5.8。至再生苗长约3-5cm时，取出用自来水洗净根部培养基，置于泡沫板上清水漂苗2-3天，炼苗同时促进部分弱苗生根，最后加入营养液，其为改良Hoagland溶液，配方如下：0.2mM NH4NO3，5mM KNO3，2mM Ca(NO3)2，2mMMgSO4，0.1mM KH2PO4，0.5mM Na2SiO3，0.05mM NaFe(III)–EDTA，0.01mM H3BO3，0.005mMMnCl2，0.005mM ZnSO4，0.0005mM CuSO4，0.0001mM Na2MoO3，使用前溶液pH值用稀盐酸调节至6.0左右。水培1-2周，至根长约5-10cm时用湿纱布包裹空运至云南繁殖，95％以上植株自交结实，获得单株来源的永久DH株系群体。
实施例5 大麦单株来源小孢子盐胁迫培养多个世代筛选
盐胁迫是作物生长中普遍面临的一种非生物胁迫方式，往往会使作物的生长发育受到影响，造成作物减产，通过单株来源小孢子盐胁迫培养可以进行单倍体细胞水平的胁迫响应研究和早期的耐盐、耐逆筛选。
在小孢子愈伤诱导培养基(N6基本培养基，铁盐加倍，添加90g/L麦芽糖、0.5mg/LKT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8)基础上添加500mg/L NaCl对大麦单株来源的小孢子进行盐胁迫培养。
与正常培养相比，盐胁迫培养对单株小孢子的愈伤诱导和植株再生具有明显抑制作用，单株平均愈伤产量下降了46％，单株平均绿苗产量下降了67％。单株6-3-4来源的小孢子诱导愈伤产量无论在正常诱导培养还是盐胁迫诱导培养条件下，都要显著低于另外两个单株6-3-7和6-3-23。单株小孢子培养中添加500mg/L NaCl可对小孢子的愈伤诱导和植株再生产生近半数的抑制率，可用于小孢子连续培养中进行耐盐、耐逆突变体的早期筛选。
对小孢子盐胁迫培养获得的再生植株，盆钵种植于人工气候室，利用其单株分蘖形成幼穗进行连续小孢子培养(步骤同前述实例1-3)，在小孢子培养过程中仍然如上述条件采用盐胁迫，获得小孢子再生植株，按照实例4通过自交繁殖获得了第二代的永久DH株系。
DH株系的种子置于湿润滤纸上于培养皿中发芽7天，幼苗转入营养液水培(实施方法见实施例4)至2叶1心期，在营养液中添加300mM NaCl胁迫，根据其在300mM NaCl胁迫下的存活率和生长量与原始供体材料比较，对其耐盐性进行初步评价。结果表明，大麦“花30”经单株来源的小孢子连续2个世代的胁迫培养，其耐盐性明显强于原始供体对照材料：在300mM NaCl盐胁迫营养液水培30天，存活率比对照原始供体材料提高25.7％，平均单株干重比对照原始供体材料提高15.4％。
实施例6 大麦单株来源幼穗或小孢子诱变获得再生突变体植株
大麦单株来源幼穗采用辐照处理获得小孢子再生突变体植株，具体为选取人工气候室种植的大麦单株供体植株中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，剪去叶片，保留上部两片叶子基部约1.5cm，采用钴60γ射线10Gy进行辐照后，用干净的湿纱布包好幼穗，放入保鲜袋中保湿，标明取材日期和数量等，放入4℃冰箱中进行2～4周低温预处理，通过幼穗辐照诱变处理结合游离小孢子培养获得再生植株(实施方法参见实例3-4)，目前再生植株种植大田后表型观察到株高发生变异材料12份、成熟期发生变化材料2份。
大麦单株来源幼穗采用化学诱变剂处理获得小孢子再生突变体植株，具体为以人工气候室种植的大麦单株供体植株为对象取幼穗游离小孢子(游离方法同前述实施例3)后，采用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)(3mg/L)于提取液(甘露醇60g/L，添加1.1g/LCaCl2、0.976g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)和20mg/L秋水仙碱，pH 5.8)中处理2天后离心收集小孢子转入前述诱导培养基中培养，通过小孢子培养获得再生突变体植株(实施方法参见实施例3-4)，目前再生植株种植大田后表型观察到叶色发生变异材料2份，株高发生变异材料4份、发育迟缓材料2份，分蘖数发生变化材料2份。

Claims (26)

1.一种大麦小孢子培养方法，包括从大麦的单株幼穗中分离出小孢子，并对分离出的小孢子进行愈伤诱导和分化的步骤；
其中，所述从大麦的单株幼穗中分离出小孢子的步骤包括不断地从室内种植的、不断分蘖孕穗的同一株大麦获取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，以对每次获取的幼穗实施所述分离、愈伤诱导和分化步骤；所述获取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗包括：选取所述大麦中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，剪去叶片，保留上部两片叶子基部1～2.0cm，保湿条件下于0～8℃放置10～30天，然后将幼穗的花苞加到提取液中，超速旋切，过滤分离得到小孢子，之后将分离到的小孢子加到提取液中，于室温、黑暗中放置18～28小时后纯化小孢子；其中，所述提取液为55～65g/L甘露醇，添加了1.0～1.2g/L CaCl2、0.960～0.985g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸和15～30mg/L秋水仙碱，pH5.6～6.0；
其中，在以下条件进行室内种植：光照强度1500～2500lx，光照时间10～16h/天，湿度60％～80％，光照时室温20～22℃，黑暗时室温16～18℃；
其中，所述愈伤诱导包括：将纯化的小孢子加到愈伤诱导培养基中，室温、黑暗条件下进行愈伤诱导15～25天；其中，所述愈伤诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/L KT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、300～500mg/L水解干酪素和1400～1800mg/L谷氨酰胺，pH为5.6～6.0；和
其中，所述分化包括：愈伤诱导结束后，将获得的愈伤组织转移到分化培养基，诱导分化形成长至2～4cm的再生苗；其中，所述分化培养基为2/3MS，添加20～40g/L的麦芽糖、0.3～0.7mg/L的6-BA、1.3～1.7mg/L的KT、0.03～0.07mg/L的NAA和4.5～6.5g/L的琼脂，pH为5.6～6.0。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在以下条件进行室内种植：光照2000lx，光照时间12h/天，湿度70％，光照时室温22℃，黑暗时室温18℃。
3.如权利要求1－2中任一项所述的方法，其特征在于，
对幼穗采用5～15Gy的钴60γ射线进行辐照后，再分离小孢子；和/或
所述提取液还含有1～5mg/L的甲基磺酸乙酯。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，愈伤诱导时间为18～21天。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取液为60g/L的甘露醇，1.1g/L CaCl2、0.976g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸和20mg/L秋水仙碱，pH 5.8。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化培养基为2/3MS，添加30g/L的麦芽糖、0.5mg/L的6-BA、1.5mg/L的KT、0.05mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂，pH 5.8。
8.如权利要求1－2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
待分化的再生苗长至2～4cm时将其转移至壮苗培养基；其中，所述壮苗培养基为1/2MS，添加20～40g/L的麦芽糖、0.03～0.07mg/L的NAA、3.0～5.0mg/L的多效唑和4.5～6.5g/L的琼脂，pH为5.6～6.0；
再生苗转至壮苗培养基后，至再生苗长3～5cm时，取出洗净根部培养基，然后置于清水中漂苗2～3天；
漂苗结束后，加入Hoagland溶液，水培5～15天，至根长5～10cm；其中，所述Hoagland溶液的配方如下：0.1～0.3mM NH4NO3，4～6mM KNO3，1～3mM Ca(NO3)2，1～3mM MgSO4，0.05～0.15mM KH2PO4，0.3～0.07mM Na2SiO3，0.03～0.07mM NaFe(III)–EDTA，0.008～0.012mMH3BO3，0.003～0.007mM MnCl2，0.003～0.007mM ZnSO4，0.0003～0.0007mM CuSO4，0.00008～0.00015mM Na2MoO3，使用前将其pH值调节至5.8～6.2。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述壮苗培养基为1/2MS，添加30g/L的麦芽糖、0.05mg/L的NAA、4.0mg/L的多效唑和5.5g/L的琼脂，pH为5.8。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述Hoagland溶液的配方如下：0.2mMNH4NO3，5mM KNO3，2mM Ca(NO3)2，2mM MgSO4，0.1mM KH2PO4，0.5mM Na2SiO3，0.05mM NaFe(III)–EDTA，0.01mM H3BO3，0.005mM MnCl2，0.005mM ZnSO4，0.0005mM CuSO4，0.0001mMNa2MoO3，使用前溶液pH值用稀盐酸调节至6.0左右。
11.如权利要求1－2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
在所述愈伤诱导培养基中添加400～800mg/L的NaCl或将所述愈伤诱导培养基的N6基本培养基中的氮含量降低为0.5～1.5mM，对小孢子形成愈伤组织过程中进行盐胁迫或低氮营养胁迫；和
任选的，盐胁迫或低氮营养胁迫后，将所得愈伤组织在所述分化培养基中分化成苗，将所得再生苗经倍性鉴定后实施所述壮苗，然后转移到盆钵，在人工气候室种植获得幼穗，不经种子再生阶段，直接作为下一代小孢子培养供体植株。
12.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述提取液为甘露醇60g/L，添加1.1g/LCaCl2、0.976g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸和20mg/L秋水仙碱，pH 5.8，加入3mg/L甲基磺酸乙酯作为化学诱变剂。
13.一种由大麦单株来源小孢子培养获得再生植株的方法，包括从大麦的单株幼穗中分离出小孢子，并对分离出的小孢子进行愈伤诱导和分化，以及将分化获得的再生苗培养成再生植株的步骤；
其中，所述从大麦的单株幼穗中分离出小孢子的步骤包括不断地从室内种植的、不断分蘖孕穗的同一株大麦获取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，以对每次获取的幼穗实施所述分离、愈伤诱导、分化和培养步骤；所述获取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗包括：选取所述大麦中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，剪去叶片，保留上部两片叶子基部1～2.0cm，保湿条件下于0～8℃放置10～30天，然后将幼穗的花苞加到提取液中，超速旋切，过滤分离得到小孢子，之后将分离到的小孢子加到提取液中，于室温、黑暗中放置18～28小时后纯化小孢子；其中，所述提取液为55～65g/L甘露醇，添加了1.0～1.2g/L CaCl2、0.960～0.985g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸和15～30mg/L秋水仙碱，pH5.6～6.0；
其中，在以下条件进行室内种植：光照强度1500～2500lx，光照时间10～16h/天，湿度60％～80％，光照时室温20～22℃，黑暗时室温16～18℃；
其中，所述愈伤诱导包括：将纯化的小孢子加到愈伤诱导培养基中，室温、黑暗条件下进行愈伤诱导15～25天；其中，所述愈伤诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/L KT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、300～500mg/L水解干酪素和1400～1800mg/L谷氨酰胺，pH为5.6～6.0；和
其中，所述分化包括：愈伤诱导结束后，将获得的愈伤组织转移到分化培养基，诱导分化形成长至2～4cm的再生苗；其中，所述分化培养基为2/3MS，添加20～40g/L的麦芽糖、0.3～0.7mg/L的6-BA、1.3～1.7mg/L的KT、0.03～0.07mg/L的NAA和4.5～6.5g/L的琼脂，pH为5.6～6.0。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所获得的再生植株室内种植，并从其不断分蘖孕穗的同一株大麦获取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的幼穗，对每次获取的幼穗实施所述分离、愈伤诱导、分化和培养，以获得下一代植株。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在以下条件进行室内种植：光照2000lx，光照时间12h/天，湿度70％，光照时室温22℃，黑暗时室温18℃。
16.如权利要求13－15中任一项所述的方法，其特征在于，
对幼穗采用5～15Gy的钴60γ射线进行辐照后，再分离小孢子；和/或
所述提取液还含有1～5mg/L的甲基磺酸乙酯。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述提取液为60g/L的甘露醇，1.1g/LCaCl2、0.976g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸和20mg/L秋水仙碱，pH 5.8。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导进行18～21天。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述分化培养基为2/3MS，添加30g/L的麦芽糖、0.5mg/L的6-BA、1.5mg/L的KT、0.05mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂，pH 5.8。
21.如权利要求13－15中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
待分化的再生苗长至2～4cm时将其转移至壮苗培养基；其中，所述壮苗培养基为1/2MS，添加20～40g/L的麦芽糖、0.03～0.07mg/L的NAA、3.0～5.0mg/L的多效唑和4.5～6.5g/L的琼脂，pH为5.6～6.0；
再生苗转至壮苗培养基后，至再生苗长3～5cm时，取出洗净根部培养基，然后置于清水中漂苗2～3天；
漂苗结束后，加入Hoagland溶液，水培5～15天，至根长5～10cm；其中，所述Hoagland溶液的配方如下：0.1～0.3mM NH4NO3，4～6mM KNO3，1～3mM Ca(NO3)2，1～3mM MgSO4，0.05～0.15mM KH2PO4，0.3～0.07mM Na2SiO3，0.03～0.07mM NaFe(III)–EDTA，0.008～0.012mMH3BO3，0.003～0.007mM MnCl2，0.003～0.007mM ZnSO4，0.0003～0.0007mM CuSO4，0.00008～0.00015mM Na2MoO3，使用前将其pH值调节至5.8～6.2。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述壮苗培养基为1/2MS，添加30g/L的麦芽糖、0.05mg/L的NAA、4.0mg/L的多效唑和5.5g/L的琼脂，pH为5.8。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述Hoagland溶液的配方如下：0.2mMNH4NO3，5mM KNO3，2mM Ca(NO3)2，2mM MgSO4，0.1mM KH2PO4，0.5mM Na2SiO3，0.05mM NaFe(III)–EDTA，0.01mM H3BO3，0.005mM MnCl2，0.005mM ZnSO4，0.0005mM CuSO4，0.0001mMNa2MoO3，使用前溶液pH值用稀盐酸调节至6.0左右。
24.如权利要求13－15中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
在所述愈伤诱导培养基中添加400～800mg/L的NaCl或将所述愈伤诱导培养基的N6基本培养基中的氮含量降低为0.5～1.5mM，对小孢子形成愈伤组织过程中进行盐胁迫或低氮营养胁迫；和
任选的，盐胁迫或低氮营养胁迫后，将所得愈伤组织在所述分化培养基中分化成苗，将所得再生苗经倍性鉴定后实施所述壮苗，然后转移到盆钵，在人工气候室种植获得幼穗，不经种子再生阶段，直接作为下一代小孢子培养供体植株。
25.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述提取液为甘露醇60g/L，添加1.1g/LCaCl2、0.976g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸和20mg/L秋水仙碱，pH 5.8，加入3mg/L甲基磺酸乙酯作为化学诱变剂。
26.权利要求1－25中任一项所述的方法在突变群体创制、遗传分析、作物新品种的创制和品种选育中的应用。
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源于大麦小孢子诱变-氮胁迫培养的DH株系田间耐低氮性表现;陆瑞菊等;《核农学报》;20141231;第28卷(第3期);第0412-0417页 *
源于小孢子培养的大麦耐盐变异体获取;陆瑞菊等;《植物生理学报》;20121231;第48卷(第11期);第1069-1078页 *
秋水仙碱对大麦离体培养小孢子存活与成苗的影响;陆瑞菊等;《植物生理学报》;20011231;第27卷(第02期);第135-140页，尤其是摘要以及第139页左栏第一段。 *

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