CN108377909A - 一种渗透胁迫处理提高大花萱草ems离体诱变率的方法 - Google Patents

Abstract

一种渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，目的是提高EMS对大花萱草离体诱变效率；本发明以生长发育正常的1‑2cm的大花萱草花蕾为材料，以子房为外植体诱导的愈伤组织接入分化培养基,分化出绿色小芽，成为带芽愈伤组织；带芽愈伤组织分化培养10天后、EMS诱变前用高渗透T固体培养基胁迫处理愈伤组织30‑60分钟；取出愈伤组织后直接用浓度为0.75‑1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理该愈伤组织块60分钟；处理后的愈伤组织接种于分化培养基进行分化培养，获得再生植株；待再生植株长至1‑2cm高时，从愈伤组织上切下转接进入继代培养基继代培养15天；以浓度为40%（v/v）的萱草叶枯病菌毒素半致死剂量为定向选择压进行胁迫筛选，获得抗病突变体植株。

Description

一种渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法

技术领域

本发明涉及一种花木——大花萱草EMS（甲基磺酸乙酯）离体诱导突变体发生的方法，具体为一种利用高渗透固体培养基胁迫处理愈伤组织，提高EMS离体诱变效率的技术方法。

萱草(Hemerocallis hybrida)是百合科(Liliaceae)萱草属多年生宿根草本。是集食、药和观赏为一体的植物品种。近年来国内陆续引进了一些观赏性大花萱草新品种，其叶似兰，花如百合。有淡黄、金黄、鹅黄、大红、粉红、复色等十几种花色，艳丽缤纷；花型多姿，有单瓣、重瓣、花瓣反卷，婀娜多姿，具有极高的园林观赏价值。大花萱草在北方干燥寒冷地区表现出极好的栽培特性：它具有短根状茎和肉质肥厚的纺锤状块根，耐旱性、耐寒性极强，大量用做地被植物，部分替代草坪；它管理粗放，养护成本是草坪草的1/5，是优秀的园林绿地花卉，其优良的耐旱耐寒性和高雅多色的观赏性受到广泛的认可。萱草的育种研究十九世纪就在欧美兴起。二十世纪以来采用传统的杂交育种方式，培育出了很多优秀的萱草园艺新品种。至今，园艺品种已多达6万余种。上世纪50年代到80年代，人们通过杂交育种的方法培育出多花色、皱褶和重瓣的萱草品种。随后，育种方向开始转向多倍体育种。随着四倍体萱草的培育成功，萱草品种得到了极大的丰富，成为品种最丰富的宿根花卉之一。国内萱草育种研究主要集中在杂交亲和性、生殖隔离和野生资源的开发利用方面。育种目标重点集中在花色、花型、花香和花期变化方面。育种方式多采用杂交育种和倍性育种方法。随着植物组织培养技术的不断完善，利用萱草组织或器官离体培养法结合秋水仙素诱导多倍体的方法使育种效率大大提高。

化学诱变育种是一种人为的利用化学诱变剂诱发植物的遗传变异，可以有效克服杂交不亲和性和生殖隔离的现象，在短时间内获得有利用价值的突变体材料，再根据育种目标的需要定向筛选获得新品种并稳定遗传后用于生产应用。随着细胞工程技术的快速发展，化学诱变和离体组织培养技术相结合，具有不受大田环境影响周年进行，缩短育种时间、扩大变异谱和提高变异率的优点。甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulfonate，EMS）作为化学诱变剂是通过与核苷酸中的磷酸、嘧啶和嘌呤直接反应来诱发点突变，在很多植物上都获得了不同类型的突变体，在很多农作物和园林植物的改良上得以应用。罗静采用0.2%EMS浸泡处理1hrs草莓三种愈伤组织块，其中以直接产生的愈伤组织诱导效果最佳，产生抗灰霉病突变体。杨媚以香蕉愈伤组织和分化芽为受体，0.5%EMS处理40min，获得“半致死剂量效应”，通过香蕉枯萎病菌梯度胁迫选择获得抗香蕉枯萎病菌毒素的愈伤组织块和分化芽。蔡海燕等利用EMS的诱变作用处理菊花茎尖，突变群体的表型变异率达到6.31%，诱变效果十分明显。通过EMS离体诱变的方法诱导突变体的产生是一种育种新途径。该方法的应用，首先要建立一个高效的组织培养体系，提高EMS的诱变效率。影响愈伤组织培养的因素有很多，在愈伤组织诱导和基因的遗传转化方面的研究有报道。刘燕蓉在农杆菌介导柳枝稷遗传转化体系中采用了“渗透冷处理+真空+干燥”的处理方法使农杆菌转化效率提高了约15-20%。陈军营、廖祥儒采用PEG对小麦预处理对小麦成熟胚愈伤组织的形成具有显著的促进作用。大花萱草的离体诱变育种及如何采用预处理的方法提高诱变效率的研究均未见报道。本研究是以大花萱草愈伤组织为受体材料，通过在固体培养基中添加渗透调节物甘露醇、山梨醇和高浓度蔗糖进行渗透胁迫预处理的方法，提高EMS诱变率。

发明内容

本发明目的是克服上述已有技术的不足，提供一种可提高EMS对大花萱草离体诱变效率、为大花萱草育种提供新的技术方法和技术体系的高渗透固体培养基胁迫处理带芽愈伤组织提高EMS离体诱变率的方法。

本发明利用渗透胁迫处理提高大花萱草EMS（甲基磺酸乙酯）离体诱变率的方法的具体步骤是：

（1）以生长发育正常的1-2cm的大花萱草花蕾为材料，以子房为外植体诱导的愈伤组织接入分化培养基,分化出绿色小芽，成为带芽愈伤组织；

（2）带芽愈伤组织分化培养10天后、EMS诱变前用高渗透T固体培养基：MS全量+6BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+甘露醇36g/L+山梨醇36g/L+蔗糖50g/L+琼脂粉8g/L，胁迫处理愈伤组织30-60分钟；

（3）取出愈伤组织后直接用浓度为0.75-1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理该愈伤组织块60分钟；

（4）处理后的愈伤组织接种于分化培养基进行分化培养，获得再生植株；待再生植株长至1-2cm高时，从愈伤组织上切下转接进入继代培养基继代培养15天；

（5）以浓度为40%（v/v）的萱草叶枯病菌毒素半致死剂量为定向选择压进行胁迫筛选，获得抗病突变体植株。

以生长发育正常的1-2cm大花萱草花蕾为材料，无菌条件下用0.1%浓度的HgCl₂消毒灭菌，无菌水冲洗3-4次；无菌条件下剥离花瓣，露出子房，横切成薄片，接种于愈伤组织诱导培养基；25℃，暗培养条件下26-28天，诱导愈伤组织产生；愈伤组织诱导培养基为：MS全量+2mg/L2,4-D+1mg/L6BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；pH5.8。

将子房诱导出的愈伤组织接种于分化培养基上，25℃，光照培养，光照强度2000Lux，待愈伤组织分化出绿色小芽；将已分化出绿色芽点的愈伤组织切割为0.3-0.5cm³大小，继续分化培养10天的带芽愈伤组织作为高渗透处理和EMS诱变的受体材料；愈伤组织分化培养基为：MS全量+0.5mg/L6BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；pH5.8。

已分化出绿色小芽、分割成0.3-0.5cm³并继代培养10天的愈伤组织接入含有渗透调节剂甘露醇、山梨醇和蔗糖的高渗透T固体培养基静置培养30-60分钟；而后，将经过高渗透培养的愈伤组织直接进行EMS诱变处理；高渗透T固体培养基：MS全量+0.5mg/L 6BA +0.2mg/IBAL+36g/L甘露醇+36g/L山梨醇+50g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；pH5.8。

0.75—1.0%（w/v）浓度的EMS半致死剂量是用0.05M的pH7.0的磷酸缓冲液配置成EMS浓度为0.75—1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理液。

是无菌条件下，将经过高渗透T固体培养基培养30-60分钟的愈伤组织转接进浓度为0.75—1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理液中，以28℃、150转/分，振荡培养1小时为EMS诱变处理方法。诱变处理后的带芽愈伤组织在无菌条件下用无菌蒸馏水冲洗3-4次，滤纸吸干水分，接入愈伤组织分化培养基，25℃、光照分化培养；淘汰死亡的愈伤组织，成活的愈伤组织继续分化培养，获得突变体再生植株。

待突变体再生植株长至1-2cm高时，从愈伤组织上切下在继代培养基上培养15天。转接进经过毒性检测的40%（v/v）浓度的粗萱草叶枯病菌毒素的继代培养基，25±1℃，16 h光/8 h暗，光照强度2800 lx培养21天，进行选择压胁迫筛选；淘汰死亡植株，成活植株转入生根培养基，生根培养成为完整的抗病突变体材料。

继代培养基：MS全量+1.0mg/L6BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉pH5.8；选择压筛选培养基：继代培养基+40%（400ml/L）萱草叶枯病粗菌毒素液pH5.8；生根培养基：1/2MS+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L琼脂粉 pH5.8。

本发明采用渗透胁迫处理愈伤组织的方法可提高EMS对大花萱草离体诱变的效率10-16%，为大花萱草育种提供新的技术方法和技术体系，提高育种技术水平。EMS离体诱变大花萱草的受体材料选择上以带芽愈伤组织为首选，可有效提高诱变后突变体的成苗效率。诱变前用高渗透培养基胁迫处理带芽愈伤组织30-60分钟，使细胞失水，有利于EMS渗透进入细胞内，引发更多诱变反应。EMS诱变带芽愈伤组织的半致死剂量为0.75—1.0%，25℃振荡处理1hrs。以添加了40%（v/v）具有致病活性的粗萱草叶枯病菌毒素液的选择压筛选培养基，进行选择压胁迫筛选，获得抗病突变体植株，证明了该方法的可行性和高效性。

本发明为萱草属植物的品种改良和新种质资源创制提供一种提高EMS离体诱变率的新技术方法和技术体系，可以获得更多目标变异株；以正在推广应用的“红运”萱草为材料，“以子房为外植体诱导愈伤组织”为离体培养方法；以切割成0.3-0.4cm³、预培养10d的大花萱草具分化芽的愈伤组织块为受体材料；以添加了渗透调节剂甘露醇、山梨醇和蔗糖的固体培养基为高渗透胁迫处理基质，静置培养30-60分钟；以液体振荡培养为EMS诱变处理方法；以0.75—1.0%的EMS浓度为半致死剂量，150r/min、25℃振荡诱变处理1hrs，在分子水平上诱发DNA突变。以高渗透胁迫和EMS诱变后不同生长时期的细胞膜透性（电导率）和保护酶（SOD、POD和CAT）活性为检测指标，验证高渗透胁迫+EMS诱变的有效性和可行性；以病菌粗毒液为选择压定向胁迫筛选大花萱草抗叶枯病突变体为检测方法，验证该EMS诱变体系的有效性和可行性。

在诱变剂量的确定上采取0.75—1.0%的范围较单一剂量更实际、更科学。在受体材料的选择上以带芽愈伤组织为受体材料提高了诱变后的成苗率，诱变效率显著提高。以30-60分钟高渗透胁迫预处理愈伤组织可有效提高突变体的发生率10-16%。EMS诱变技术及以甘露醇、山梨醇和高浓度蔗糖为渗透剂的渗透胁迫的处理方法在大花萱草上的应用研究未见报道。该项技术不仅仅适用于抗病育种，也适用于大花萱草在生物学性状方面产生花型花色、叶型叶色以及花期等性状改变的突变体类型，对于筛选具有更高观赏价值的新品种具有十分普遍的意义。

附图说明

图1是“不同浓度、不同时间EMS诱变处理对一类愈伤组织存活率的影响”的折线图；

图2是“同浓度、不同时间EMS诱变处理对二类愈伤组织存活率的影响”的折线图；

图3是“不同浓度EMS诱变处理一类、二类愈伤组织成苗率的影响”的折线图；

图4是“不同浓度毒素胁迫对分化芽生长量的影响”的折线图；

图5是“不同浓度枯叶病毒菌素对大花萱草再生植株的致死效应”的折线图；

图6是“渗透+EMS处理与愈伤组织生长量的关系”的折线图；

图7是“不同渗透+EMS处理对不同生长时期愈伤组织成活率（%）的影响”的折线图；

图8是“不同渗透+EMS处理后愈伤组织细胞质膜透性的变化”的折线图；

图9是“渗透处理后不同培养时间愈伤组织SOD酶活性的变化”的折线图；

图10是“渗透处理后不同培养时间愈伤组织POD酶活性的变化”的折线图；

图11是“渗透处理后不同培养时间愈伤组织CAT酶活性的变化”的折线图。

具体实施方式

大花萱草子房愈伤组织的获得

1.1实验方法

实验用萱草来源于山西省农业科学院旱地农业研究中心东阳示范基地试验田。2-3年生的大花萱草“金娃娃”和“红运”。

采用本申请人单位的专利技术“以子房为外植体的大花萱草组织培养技术方法”【中国专利号2011100940526】进行外植体接种诱导愈伤组织。盛花期取大田发育正常的花蕾，用自来水加洗涤剂冲洗干净外部的灰尘。用75％（v/v）的乙醇浸泡3-5min，蒸馏水冲洗1-2次，再用0.1％（w/v）HgCl₂灭菌8-10min，无菌水浸泡、冲洗4-5次，然后剥离外部花瓣，露出子房，横切成片状接种在诱导培养基上。每皿30块以上（切块太小，不好统计），25±1℃，暗培养。诱导26-28天的愈伤组织转入分化培养基进行25±1℃光培养15-26天。将带有绿色芽点的愈伤组织分切成约0.2-0.3cm³的小块继续接种于分化培养基，预培养一段时间，进行EMS处理。

诱导培养基：MS全量+6BA2mg/L+IBA0.5mg/L+2.4-D1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8.6g/L；Ph5.8

分化培养基：MS全量+6BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8.6g/L；Ph5.8；

1.2 结果与分析

本方法是采用本单位的专利技术“以子房为外植体的大花萱草组织培养技术方法【中国专利号2011100940526】”进行外植体的接种和诱导愈伤组织。

选择长度1－2cｍ正常发育的大花萱草花蕾，用70％的乙醇浸泡1-3min，0.1%HgCl₂高强度灭菌花蕾10－15min，无菌剥离子房为外植体，然后切片分别接种在诱导培养基上， 25±1℃、黑暗培养26-28天，诱导产生愈伤组织；将愈伤组织转入继代分化培养基进行25±1℃、光照培养15天，愈伤组织分化出绿色芽点，记作一类（或Ⅰ类）愈伤组织；分化培养20-26天愈伤组织产生分化芽，记作二类（或Ⅱ类）愈伤组织；

2.诱变方法研究和半致死剂量参数的获得

2.1试验方法

根据愈伤组织的不同生长状态分为刚进入分化期出现绿色芽点的愈伤组织（记作：一类愈伤组织）和已分化出绿色小芽的愈伤组织（记作：二类愈伤组织）2种，大小约为0.3-0.5cm³。

EMS诱变的半致死剂量确定：诱变处理采用液体振荡培养法；EMS处理剂量设定为0.25%（W/V）、0.5%、0.75%和1.0%，用pH7.0、0.05M的磷酸缓冲液配制，以不加EMS的为CK。振荡培养150转/分，28℃，时间设定为30min、60min和90min。处理后的愈伤组织用无菌水冲洗3次，吸干水分，接种于继代培养基，光照培养26d，统计存活数，计算存活率，凡是能在继代培养基上继续生长或在褐化组织上长出新愈伤组织的一类愈伤组织记为成活。凡是能在继代培养基上继续生长或在褐化组织的分化芽能继续存活的二类愈伤组织都记为成活。本实验对一类愈伤组织、二类愈伤组织两种愈伤组织分别进行，每个处理3个重复，每个重复20块材料。通过存活率的计算，确定EMS半致死剂量（50%）。

存活率（%）=（存活数/接种数）×100% 式(1)

继代培养基：MS全量+6BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+琼脂粉8g/L+蔗糖30g/L；pH 5.8

EMS诱变不同类型愈伤组织的成苗率：EMS诱变处理后的两种愈伤组织经26天分化培养后统计成活率。将成活的愈伤组织继代到分化培养基继续培养26天，切取长度为1-2cm的有效再生苗，接种于生根培养基，进行生根培养。统计成活数【式(2)】、计算成苗率。

成苗率（%）=分化的有效苗数/成活的愈伤组织数×100% 式(2)

生根培养基：1/2MS +NAA0.2mg/L+琼脂粉0.8g/L+蔗糖20g/L； pH 5.8

通过最终统计分化苗数确定EMS最佳处理效果系统；

2.2结果与分析

愈伤组织的预培养：两类愈伤组织在切割成0.2-0.3 cm³的小块后都要在继代培养基上进行10d的预培养，而后才能进行EMS处理。目的是愈合切割后的伤口组织，以避免EMS直接侵害受损细胞，造成创伤面的损伤，进而引发愈伤组织的褐化、死亡，造成统计结果的不准确。

EMS半致死剂量效应：从表1和图1 可以看出，4种浓度（0.25%、0.50%、0.75%和1.0%）的EMS溶液对大花萱草愈伤组织均有不同程度的伤害作用。随着处理液浓度的增大和处理时间的延长，一类愈伤组织的成活率均出现逐渐降低的趋势。当处理时间达到30min时，EMS剂量为1.0%时，一类愈伤组织存活率仍达到60.0%，对EMS的耐受性达到1.0%以上。当处理时间达到60min时，一类愈伤组织对EMS的耐受浓度降低到了0.50-0.75%，成活率在51.6%-47.5%。当处理时间延长至90min时，部分愈伤组织表面会出现水渍样透明状态，无论是高浓度还是低浓度，都会导致一类愈伤组织大量死亡，成活率都在40%以下。

表1 EMS诱变处理的两类愈伤组织的存活率

从表1、图2还可以看出，带有分化芽的二类愈伤组织在进行EMS诱变处理的过程中表现出与一类愈伤组织类似的变化趋势。不同的是二类愈伤组织在处理时间为60min时，对EMS的耐受浓度为0.75-1.00%。同样观察发现，当处理时间延长到90min时，部分分化芽的叶片也会出现水渍样浸润状态，并且这部分叶片很快会软化黄化。

诱变不同类型愈伤组织的成苗率：EMS半致死剂量考察的是受体材料处理一定时间后的成活率，而成活后是否可以再生有效植株是关系到诱变效率的重要因素。因此，在半致死剂量率的前提下研究EMS处理不同受体材料的成苗率问题显得十分重要。

表2 EMS处理大花萱草两类愈伤组织的成苗率

从表2、图3可以看出：二类愈伤组织随着EMS诱变浓度的增加，成活率呈下降的趋势。存活下来的愈伤组织再经过一代的分化培养，即便是部分愈伤组织出现浅褐色趋于死亡的状态，但其上的分化苗依然存活并再生成苗。成苗率均达到250%以上，不同EMS处理剂量对成苗率的影响不大，在254.2—280.9%之间。也就是说二类愈伤组织后期生长受EMS的持续影响较小。而一类愈伤组织在EMS半致死剂量处理后继一代存活下来的愈伤组织继续接种于分化培养基，大部分材料仍继续死亡，只有少数包裹在组织中的绿色芽点成活，并继代分化出再生植株。表现出对EMS敏感性的持续反应，分化能力明显减弱，最高只有0.25%剂量时的138.5%，分化的有效苗数较二类愈伤组织明显减少150%。

本实验针对一类愈伤组织和二类愈伤组织筛选出不同的EMS半致死剂量。一类愈伤组织的EMS诱变体系为0.50-0.75%EMS处理60min；二类愈伤组织的EMS诱变体系为0.75-1.00%EMS处理60min。综合评价EMS诱变受体、诱变体系和成苗率认为：二类愈伤组织更适合作为EMS诱变的受体材料，EMS诱变体系为0.75-1.00%EMS处理60min；

3.抗病突变体选择压定向筛选体系的建立

3.1 试验方法

以EMS半致死剂量处理后存活的类愈伤组织和二类愈伤组织的分化芽。

供试大花萱草叶枯病菌株：大花萱草叶枯病菌（Kabatiella microsticta）由吉林农业大学农学院白庆荣教授分离、保存，并友情惠赠。

大花萱草叶枯病菌粗毒素的制备及活性鉴定：无菌条件下切取培养于PDA培养基上的菌落1*1cm的3块接种于无菌的500mlPS培养液中，置于25℃、暗培养条件下，150r/min振荡培养20—24天。用分光光度计在600nm的波长下测定OD值在1.40-1.60之间。菌液用 8层纱布过滤菌丝体，滤液经3500r/min离心30min，取上清液即得病原菌粗毒液。以PS培养液为对照，高压灭菌过的粗毒素液为A，未经高压灭菌的为B，分别以100%(A1、B1)和50%(A2、B2)浸泡子房愈伤组织5 h（，用）后0.1%台盼蓝染色。用莱卡M1650型体视显微镜观察细胞活力，确定粗毒素液对愈伤组织的毒力。

PS培养基：100g去皮马铃薯切块煮沸30min，4层纱布过滤。滤液加10g蔗糖，定容至500ml，高压灭菌后备用。

抗病选择压半致死剂量筛选：

（1）一步筛选法。受体类型为EMS半致死剂量处理后的类愈伤组织经继代培养后分化出的1~2 cm高的分化苗。继代培养基中分别添加浓度20%、40%、60%的病菌毒素液，以不添加毒素液为对照，高压灭菌后备用。选取经EMS半致死剂量处理后继代培养21天、成活且大小一致的分化苗，每瓶8株，每处理3瓶，3次重复。25±1℃，16 h光/8 h暗，光照强度2800 lx。分别在0、7、14、21、28天称其鲜重，绘制生长曲线。以分化苗生长量达到CK生长量的50%时的毒素浓度和培养时间为标准，结合成活率，确定筛选抗病突变体的选择压。

（2）逐步筛选法。受体类型为EMS半致死剂量处理后的类愈伤组织。继代培养基中分别添加10%、20%、30%粗毒素作为毒素胁迫培养基，以未经EMS处理的类愈伤组织为对照。选取经EMS半致死剂量处理后成活的、大小均匀的类愈伤组织和CK分别接种到不同毒素浓度的培养基上，在一个浓度梯度的培养基上继代2次，每个继代周期为15天。挑选成活的愈伤组织转入毒素浓度高一梯度的培养基上继续继代2次。即10%（2代）→20%（2代）→30%（2代）。选取成活的愈伤组织转入不加毒素的继代培养基进行恢复。EMS处理的材料每个浓度接种6个培养皿，每培养皿20块愈伤组织。CK每个浓度接种3个培养皿，每培养皿20块愈伤组织。观察愈伤组织存活状况，计算存活率；

3.2 结果和分析

叶枯病菌毒素液毒力检测：经高温灭菌A和未经高温灭菌B的毒素液浸泡处理愈伤组织经台盼蓝染色观察发现，用PS培养液浸泡的愈伤组织(CK)只有表面个别细胞被染成蓝色。用毒素液浸泡的愈伤组织60%~90%以上都被染成了蓝色，毒素浓度越大，着色越深。只有死亡的细胞才会被染成蓝色，说明粗毒素液在细胞水平上对萱草愈伤组织有致死效应。不论是经高温灭菌的毒素液A，还是未经高温灭菌的毒素液B，愈伤组织均被染成蓝色，说明高温灭菌不会破坏叶枯病菌毒素液毒性。

一步法筛选萱草二类愈伤组织分化苗抗病菌毒素突变体：对EMS处理后的大量再生植株进行抗病检测需要很大的种植空间，花费很长的时间和很长的时间。利用离体胁迫筛选抗病变异株，可以在有限的空间和时间内以及稳定的环境条件对大批材料完成快速、高效地筛选，获得抗病株。

从接种到含不同粗毒素液的继代培养基上的再生苗光照培养第5天开始出现叶尖变黄，随着培养时间的延长黄色逐渐向下延伸，并且逐渐出现多叶片同时发生病害症状，直至部分植株整体死亡。从分化芽生长量曲线（图4）可以看出，毒素液对分化苗的生长存在明显的抑制作用。随着粗毒素液浓度的升高和胁迫时间的增长，对生长抑制作用越明显。各处理中，前21天分化芽的生长均有不同程度增长，增长幅度随毒素液浓度的升高而降低。胁迫21天后各处理分化芽生长缓慢，抑制效果显著。21-28天，20%浓度时生长量增加了9.6%；浓度达到40%时分化芽生长缓慢，只增加了3.95%；浓度达到60%时，分化芽基本处于停止生长状态，生长量只有0.68%。可以看出，各处理中，21天是分化芽快速生长到停滞生长的一个节点。

表3 枯叶病毒菌素对大花萱草分化苗的致死效应

毒菌素浓度/%	接种数/株	成活数/株	成活率/%
				Ck	64	64	100.0
20	56	50	89.3
				40	64	31	48.4
60	64	25	39.1

从图5可以看出：随着病菌毒素浓度的升高，再生植株的成活率呈下降的趋势。20%毒素处理的苗生长基本正常，个别植株的个别叶片出现黄叶病害现象，成活率89.3%；40%毒素胁迫的材料个别植株生长比较健壮，部分植株生长基本停止，大部分叶片出现病害状况，成活率下降到48.4%。60%毒素处理的材料可以明显看到全部植株停止生长并表现为叶片发黄、整株发病的严重病害胁迫，成活率只有39.1%。同样，从表3的统计数据也可以看出：40%毒素剂量，培养21天时，成活率达到48.4%，接近50%，所以，确定40%毒素的添加量为半致死胁迫剂量率。

将EMS半致死剂量处理和40%毒素胁迫21天的愈伤组织和CK分别进行继代培养。CK愈伤组织获得分化苗178株，经过EMS处理和毒素筛选的二类愈伤组织分化芽获得抗叶枯病突变体再生植株103株。

逐步法筛选萱草一类愈伤组织抗病菌毒素突变体：经EMS半致死剂量处理成活的一类愈伤组织和CK愈伤组织同时接入第一梯度3个不同浓度的毒素培养基中，继代2次后愈伤组织的成活率见表4。结果显示，CK随着毒素浓度的升高，成活率呈下降的趋势。经EMS处理后的愈伤组织成活率没有规律性。

表4 第一梯度不同毒素浓度一类愈伤组织继代2次的成活率

将第一梯度筛选成活的愈伤组织转入第二梯度的毒素培养基继续胁迫筛选2代（30天），统计结果见表5。CK全部死亡。经10%毒素筛选的愈伤组织转入20%浓度筛选后，存活36块，成活率81.8%；经20%毒素筛选的愈伤组织转入30%浓度筛选后存活51块，成活率48.1%；继续在30%毒素筛选的愈伤组织成活3块，成活率5.2%，愈伤组织的成活率随浓度的升高呈下降的趋势，具有一定的规律性。但是，从逐代毒素筛选的整个过程看EMS处理的材料成活率变化没有规律性，抗毒素突变体的选择以10%毒素胁迫筛选2代（30天），进入20%毒素胁迫筛选2代（30天）比较合适，最终成活率达到48.1%；

表5 第二梯度不同毒素浓度一类愈伤组织继代2次的成活率

将EMS半致死剂量处理和上述毒素胁迫筛选的愈伤组织和CK在分化培养基上进行植株再生。CK新鲜、黄绿色，生长状态好，分化大量再生植株，分化率达96.7%。而经过EMS处理和毒素胁迫的愈伤组织继代培养过程中大部分表现出水渍、松软和褐化状态，其上虽然还有绿色芽点组织存活，但是随着培养时间的增长，绝大多数不能分化出再生植株。

本实验通过对病菌毒素液活性的鉴定、针对不同受体材料（愈伤组织和分化芽）采取不同选择压定向筛选方法的研究，综合性状观察、生长量和成活率三项指标得出：（1）高温灭菌对毒素液的毒力没有影响；毒素液的浓度越高对细胞的致死力越强。因此，通过培养基中添加毒素液的方法进行抗性筛选是可行的。（2）以二类愈伤组织的分化芽为受体材料，以40%毒素为半致死胁迫剂量，胁迫筛选21天为适宜的突变体选择压筛选体系；

4.渗透胁迫处理愈伤组织方法的建立

4.1 试验方法

受体材料采用本文试验2的结果。在继代培养基上进行10天预培养的类愈伤组织。

不同渗透培养基的筛选：渗透预处理采用固体和液体培养基室温下静置培养。在EMS诱变之前将愈伤组织接入渗透培养基，样品号分别标记为T、a、b和c（见下表）。渗透处理时间分别设定为30、60、90min，以不做渗透处理的为ck。20块为1个处理，每处理3次重复。

渗透培养的基本培养基：MS全量+ 6BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L；pH5.8 在此基础上按下表添加渗透调节物。

EMS诱变处理采用本文试验2中得出的半致死剂量率和方法。剂量为1.00%。28℃，振荡培养150转/分处理60min。将渗透处理后的愈伤组织按材料T、a、b和c分别接入EMS处理液，以未经渗透和EMS处理的为CK。观察记录愈伤组织的存活状况，计算存活率【式(1)】。凡是能在继代培养基上继续生长或在褐化组织上长出新鲜幼嫩愈伤组织记为成活。以3个重复的平均值为统计结果。以愈伤组织成活率为标准，确定适宜的渗透培养基类型。

存活率（%）=（存活数/接种数）×100% 式(1)

渗透胁迫+EMS半致死剂量诱变体系的建立：渗透培养采用T固体培养基，渗透处理时间分别设定为0、30、60、90min，标记为0、1、2和3号样品。处理后的材料直接进入EMS诱变液中，20块为1个处理，每处理3次重复。

T固体渗透培养基：MS全量+ 6BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+甘露醇36g/L+山梨醇36g/L+蔗糖50g/L+琼脂粉8.5g/L；pH5.8

EMS诱变处理采用4.1.2.1的方法。将渗透处理后的愈伤组织按材料0、1、2和3号分别接入EMS处理液，以未经渗透和EMS处理的为CK。处理后的愈伤组织用无菌水冲洗3次，吸干水分，接种于分化培养基。光照培养20d后，观察记录愈伤组织的存活状况，计算存活率【式(1)】。以3个重复的平均值为统计结果。

式(1)

分别在第0、7、14、21和28d称其鲜重，绘制生长曲线，确定生长量的变化趋势。

将以上成活的愈伤组织分别继代到分化培养基培养21天，观察愈伤组织分化状态，统计分化的愈伤数，计算分化率【式(2)】。

分化率=（分化的愈伤组织数/接种数）×100% 式(2)

切取长度为0.5~1.0 cm的有效再生苗接种于生根培养基，进行生根培养，计算成苗率【式(3)】。生根培养基为1/2MS+ NAA 0.2 mg/L+琼脂粉8.5g/L+蔗糖20 g/L，pH 5.8。

式(3)

叶枯病菌毒素对“渗透+EMS诱变”材料的选择压定向筛选：以渗透+EMS半致死剂量处理后存活的再生植株为材料，分别进行抗病毒素突变体的筛选。

大花萱草叶枯病菌粗毒素的制备采用本文试验3的制备方法。

抗病突变体筛选采用本文试验3的一步筛选法。将渗透+EMS半致死剂量处理后存活的1~2 cm再生植株接种于添加了40%的病菌毒素液（病菌毒素半致死剂量）的继代培养基中。 (25±1)℃光照培养。）25±1℃，16 h光/8 h暗，光照强度2800 lx，培养21天。统计成活率；

4.2结果与分析

渗透培养基的筛选：愈伤组织是植物细胞脱分化后形成的一种无固定形态的薄壁细胞，非常幼嫩。在受到外界环境胁迫时会产生大量的酚类物质，导致褐化以至于死亡。从本实验的结果可以看出（表 6）：所有培养基中的愈伤组织随着渗透处理时间的增长，成活率均呈下降的趋势。尤其以渗透液体培养基a、b和c下降趋势明显且下降幅度大；渗透调节物浓度越高，愈伤组织的死亡率越高，均在43%以下。固体T培养基对愈伤组织的渗透调节比较柔和，在30-60分钟时，成活率达50-44%。说明：T培养基在30-60分钟对二类愈伤组织进行渗透处理是合适的剂量范围。所以，选择T培养基和30-60分钟作为二类愈伤组织的渗透处理体系。

表6 不同渗透处理与二类愈伤组织成活率的关系

渗透+EMS处理对愈伤组织生长量的影响：渗透培养是通过培养基和细胞质膜之间产生的渗透势，使愈伤组织表层细胞失水，造成细胞内外一定的压差，更有利于诱变剂EMS渗入细胞质膜，作用于染色体，提高突变率。

从图6可以看出：10天后1、2号材料生长量的增幅逐渐加大，3号材料几乎没有增长。说明：处理后愈伤组织处于受伤害并进行自我修复阶段。10天后随着愈伤组织自我修复功能的启动，逐渐恢复正常生长。3号材料处理时间过长，渗透和EMS造成的伤害严重，丧失自我修复能力。0号材料未经渗透处理，受伤害程度明显比渗透处理的材料弱，修复期过后进入正常生长期。

经数据分析（见表7），随着渗透时间的增长，抑制更强烈。经渗透处理的1、2和3号材料与未经渗透处理的0号材料相比，生长量均存在显著差异。处理时间在30-60min时，该抑制作用在后期的继代培养中可通过细胞的自我修复得到缓解，是个可逆的过程；超出60min后，渗透+EMS会对细胞造成永久伤害，是不可恢复的。1和2号材料间差异不显著。说明：渗透处理对愈伤组织生长有抑制作用，渗透处理时间在30-60min时，抑制作用不显著；超过60min，抑制作用显著差异。

表7 渗透+EMS处理后愈伤组织不同生长时期生长量表

渗透+EMS处理对愈伤组织成活率的影响：经渗透+EMS处理的愈伤组织前10天生长十分缓慢。愈伤组织表面出现灰褐色，逐渐死亡。20天时，50%的愈伤组织已不存在鲜活的细胞。继代一次后，死亡的愈伤组织逐渐减少（见表8、图7）。40天时，所有经EMS处理的0、1、2和3号处理与ck成活率呈显著差异。随着渗透处理时间的延长，1、2和3号材料的成活率呈下降的趋势。1和2号材料与0号材料相比，成活率差异不显著；3号与0号材料相比，成活率差异显著。因此，渗透处理在30-60min时对EMS半致死剂量的影响差异不显著；超过60min差异显著。

表8 不同渗透+EMS处理与不同生长时期愈伤组织成活率（%）的关系

渗透+EMS处理对愈伤组织成苗率的影响：渗透处理是否对EMS半致死剂量有显著影响的一个衡量指标就是成活后的愈伤组织是否可以再生有效植株。

经不同渗透+EMS处理后，经40天的分化培养，各处理的愈伤组织的成活率、分化率显著下降。虽然在褐化的愈伤组织表面仍有新鲜的愈伤组织细胞，但是大多数失去了分化能力。从表9可以看出：0号材料的愈伤组织成活率为46.67%，分化率只有31.67%；1号材料愈伤组织成活率为41.67%，分化率只有26.67%；2号材料愈伤组织成活率为45.00%，分化率只有25.00%；3号材料的愈伤组织和分化率均低于20%。虽然2和3号材料的愈伤组织成活率和分化率均略低于0号，但是，最终的成苗率与0号材料相差仅3%，均达到70%以上。表明：渗透处理30-60min可有效提高愈伤组织的成苗率。

表9 不同渗透+EMS处理与愈伤组织成苗率（%）的关系

叶枯病菌毒素对“渗透+EMS诱变”材料定向筛选结果：将各处理成活的1-2cm的再生植株接种到含40%粗毒素液的继代培养基上光照培养。第5天开始出现叶尖变黄，随着培养时间的延长黄色逐渐向下延伸，并且逐渐出现多叶片同时发生病害症状，直至部分植株整体死亡。

表10 叶枯病菌粗毒素半致死剂量（40%）筛选抗病突变体植株

样品号	处理方法	再生植株/株	抗病阳性植株/株	突变体率%
					ck	未处理	103	9	8.70
0	EMS半致死剂量	21	12	57.14
					1	30min渗透+ EMS半致死剂量	19	14	73.68
2	60min渗透+ EMS半致死剂量	18	12	66.67
					3	90min渗透+ EMS半致死剂量	2	2	100.00

从表10可以看出：未经渗透处理的0号材料，突变体植株率为57.14%；经渗透处理30-60min的1和2号材料，突变体率最高达到73.68%，提高了10%-16%左右。渗透处理90min的3号材料，虽然成苗率只有16.67%，只有2株苗，但是经病菌毒素筛选后均成活，突变体率100%。结果表明：渗透处理有利于提高突变体率10-16%，以30-60min适宜。

本实验（1）通过不同渗透培养基的研究，综合愈伤组织生长状态和成活率等指标的得出：T固体培养基适宜对类愈伤组织进行胁迫处理。（2）通过对T渗透培养基胁迫愈伤组织不同时间的研究，综合愈伤组织的生长量、成活率、分化率和成苗率等指标的分析得出：渗透胁迫对愈伤组织的生长有抑制作用，并且与EMS的伤害作用是叠加的。30-60min影响不显著，90min影响显著。渗透处理30-60min可有效提高愈伤组织的成苗率。（3）通过叶枯病菌毒素液对阳性植株的定向筛选研究得出渗透处理30-60min有利于提高突变体率10-16%；

5. 通过对愈伤组织生理生化状态研究验证“渗透+EMS处理”方法的可行性

5.1 材料与方法

渗透+EMS处理前和处理后不同培养时间的愈伤组织

试验方法：细胞质膜透性采用电导法分别在处理前和处理后第2、4、8和12天对样品进行相对透性测定。选取合适的愈伤组织，用重蒸水冲洗三次，滤纸吸干后，称取0.5g放入干净试管中，加重蒸水10ml。真空泵抽气10min，摇匀，室温放置1hr后，用DDS-307⁺电导率仪测定电导度S₁之后，加热煮沸5min，静置冷却到室温，再测定电导度S₂。计算细胞质膜相对透性【式(4)】

细胞质膜相对透性%= （S₁/ S₂）×100% 式(4)

保护酶活性的测定SOD、POD和CAT的测定采用南京建成生物工程研究所试剂盒法。SOD试剂盒（测总），羟胺法，货号：A001-1。POD试剂盒（植物），货号：A084-3。CAT可见光试剂盒，货号：A007-1。

（1）SOD酶提取液制备和测定：称取0.1g的愈伤组织，加0.9ml匀浆介质，冰水浴下研磨，3500转/分，离心10min，取上清液20ul，加提取液180ul稀释，制成1%浓度组织液取50ul组织液，按试剂盒操作标准加各种试剂，于550nm处，1cm光径比色杯，测样品OD值。以双蒸水为对照，三次重复。计算总SOD活力【式（5）】

总活力SOD（U/克组织鲜重）={（对照OD值-测定OD值）/对照OD值}÷50%×{反应液总体积（ml）/取样量（ml）}÷匀浆液浓度（g/ml） 式（5）

（2）POD酶提取液制备和测定：称取0.1g的愈伤组织，加0.9ml匀浆介质，冰水浴条件下制备成10%组织匀浆液，3500转/分，离心10min。取上清液100ul，按试剂盒标准操作，于420nm处，1cm光径比色杯，测样品OD值。以双蒸水为对照，三次重复。计算总POD活力【式（6）】

POD活力（U/mgprot）={（测定OD值-对照OD值）/（12×比色光径1cm）}×{反应液总体积（ml）/取样量（ml）}÷反应时间（30分钟）÷匀浆蛋白浓度（mgprot/ml）×1000 式（6）

（3）CAT酶提取液制备和测定：称取0.1g的愈伤组织，加0.9ml匀浆介质，冰水浴条件下制备成10%组织匀浆液，2500转/分，离心10min。取上清液50ul，按试剂盒标准操作，于405nm处，0.5cm光径比色杯，测样品OD值。以双蒸水为对照，三次重复。计算总CAT活力【式（7）】

CAT活力（U/mgprot）={（对照OD值-测定OD值）×271^*×{1/（60×样品量）}÷匀浆蛋白浓度（mgprot/ml） 式（7）

注：*271为斜率的倒数。*匀浆蛋白浓度以1mgprot/ml计；

5.2结果与分析

渗透+EMS处理对愈伤组织细胞质膜透性的影响：低浓度、短时间的渗透胁迫对细胞造成的胁变是弹性的，可恢复的；高浓度、长时间对渗透胁迫对细胞膜的损伤是塑性的、是不可修复的，直接造成细胞膜受害，导致透性改变，造成原初直接伤害。继而导致细胞生理生化代谢的失调。

细胞膜的透性对渗透胁迫是非常敏感的。当遇到高渗透环境和化学诱变剂时，质膜透性都会增大，表现为电导率的增大。

如图8可以看出：各处理从第2天开始电导率呈持续升高状态。3号材料电导率升高的幅度最大。0号材料的升高幅度界于ck和3号材料之间一半的位置。1和2号材料电导率的升高幅度界于0号和3号材料之间。说明：渗透处理和EMS处理均可导致愈伤组织表面细胞膜的透性增加。渗透处理和EMS处理对细胞膜的伤害有叠加效应。这种叠加效应随着渗透处理时间的延长而加剧。渗透处理时间在30-60分钟时，细胞膜的透性增加；90分钟时已表现为极显著增加。也就是说：30-60分钟的渗透处理对细胞膜的透性有一定的伤害，90分钟时这种伤害就及显著了。从细胞膜的透性来看，渗透处理的时间不宜超过60分钟。

渗透处理对愈伤组织保护酶活性的影响：保护酶的保护作用与处理时间有关。处理时间（强度）在较短的时间酶，细胞保护酶产生较强的防御系统，解除胁迫后，在没有造成膜系统完全破坏的前提下，通过保护酶系统的修复，细胞逐渐恢复正常生长。保护酶表现为前期升高，后期下降。

从图9可以看出：渗透+EMS处理前到处理后第1天，除ck外，SOD酶（超氧化物歧化酶）活性均显著升高。0号材料酶活性升高的幅度较1、2和3号材料。处理后第2~7d，酶活性急剧下降，下降幅度依次为3＞1＞2＞0，ck略有升高。第7-17d，1/2和3号材料酶活性逐渐升高；在第12d时，0/1和2号材料升高到处理前酶活性水平。而3号材料在第17天时仍处于较低酶活性水平。说明：渗透和EMS协同作用对愈伤组织SOD酶活性水平有很大影响。未经渗透处理的0号材料在第7天SOD酶系统就得到了修复；经渗透处理30-60min的1和2号材料在12d，酶系统得以恢复；90min的3号材料酶系统的损伤最严重。

与SOD酶表现不同的是POD酶（过氧化物酶）先下降后升高，各处理的变化趋势与SOD酶相似。

CAT酶（过氧化氢酶）活性处理后第2天达到最高，而后呈下降的趋势，下降的趋势很大。在第7天时0号材料已下降到处理前的水平；1、2和3号材料的酶活性下降的比处理前还低。而且，与SOD酶不同的是：随着培养时间的延长，CAT酶活性处于缓慢下降状态。下降的幅度为3＞2＞1＞0。

综合以上三种保护酶在处理前后不同生长期内的表现可以看出：T固体渗透培养基对愈伤组织存在一定的伤害作用，并与EMS的伤害存在叠加效应；在处理时间为30-60分钟时伤害是不显著的，且有利于提高突变体的发生率；超过60分达到90分钟时，伤害是显著的、不可逆的。

随着国外萱草新品种的引种驯化栽培和繁殖应用的广泛进行，除国内本土萱草易感的炭疽病、锈病外，近几年又发现一种新的病害——萱草叶枯病。在美国不同年份均有该病害严重发生的报道。主要危害引进的大花萱草品种，在不同的萱草品种上均有不同程度的感染，尤其是‘红运’最易感病。国内外对多种杀菌剂进行了研究，找到了病菌敏感的杀菌剂。但是，园林绿化大面积喷施杀菌剂势必会对环境造成污染，同时加大了园林的管理难度。最持久而有效的办法就是改良和选育抗病新品种。大花萱草也称为多倍体萱草。一般情况下多数品种结实率低，品种之间存在着不亲和性，很难通过人工杂交的方式培育抗病新品种。通过化学诱变的方法诱导突变体的产生是一种育种新途径。本研究以‘红运’萱草子房诱导的愈伤组织和分化芽为受体材料，以EMS半致死剂量效应诱导产生突变体，再以萱草叶枯病粗毒素胁迫下定向筛选抗病突变体，获得了抗毒素分化芽突变体植株。这些阳性突变体植株的抗病性和田间表现有待进一步研究。

在化学诱变中，EMS是应用广泛、效果较好的诱变剂，诱变频率高、范围广，在植物诱变育种中广泛应用。同时，EMS对植物的生长的损害作用是十分明显的。低浓度EMS可刺激愈伤组织生长，高浓度抑制生长。因此，筛选出适宜的EMs诱变半致死剂量是本项发明的技术关键，它直接关系到愈伤组织的成活率、分化率及最终的分化苗的存活率和分化苗是否能正常生长。林丛发、徐美隆通过对EMS诱变后的丽格海棠愈伤组织DNA进行随机引物多态性扩增研究发现，随着EMS浓度的升高，变异率增加。在达到半致死剂量时，变异谱达到最大。所以，EMS半致死剂量的确定是变异最大化的关键。影响萱草离体诱变的因素很多，外植体的类型和生长状态、诱变剂的浓度及处理的时间等，需要针对不同的受体材料设置不同的诱变剂浓度和处理时间梯度，以达到最佳处理效果^[28]。本研究中根据萱草不同的受体材料得出了适宜的EMS半致死剂量浓度范围。经过多次的反复试验发现，接受EMS诱变处理的受体材料是活体组织或器官，对EMS可耐受的半致死剂量是一个有效的剂量范围，而非一个剂量点。对愈伤组织半致死剂量为0.50—0.75%，对带芽的愈伤组织则是0.75—1.0%。在这一范围内致死率基本保持在50%左右。这样的剂量范围更具科学性。

由于EMS离体诱变的是活体组织，个体之间、批次之间生长状态存在很大的差异。尽管我们在试验中尽量挑选一致的材料，但很难做到完全的统一。每批次处理后的存活率存在一定的高低变化。但从多批次的整体结果看，平均成活率在50%左右，说明该技术方法的准确性和可行性。

从实验结果看，带芽愈伤组织作为受体材料比愈伤组织更具有成苗的高效性。EMS侵害愈伤组织后即便是存活下来的材料后期培养过程中依然会继续死亡，且分化率很低，表现为EMS的持续伤害作用。而带芽的愈伤组织受EMS的侵害也会褐化、死亡。包裹在其上的分化芽仍能利用周边组织细胞提供的营养生长。虽然叶片发黄，但切割下来在继代培养基上能很快恢复正常生长，长出新叶。所以，以带芽愈伤组织作为EMS诱变的受体材料可有效提高诱变效率。

一类愈伤组织在EMS半致死诱变处理和逐步法毒素胁迫筛选过程中，除完全死亡的材料外，成活的材料都表现为无光泽的松散状态，其上生长的绿色芽点组织也随着后期的继代、分化培养而失去了再生能力，最终没有获得一类愈伤组织的突变体再生植株。二类愈伤组织在EMS半致死诱变处理后成活的材料虽然愈伤组织和小叶片有褐化、松散的状态，但是分化芽具有较强的生长势，经一代的继代培养就可长出新叶。经毒素胁迫筛选后，成活的分化芽经过继代培养很快恢复生长能力，获得抗病突变体再生植株。这一结果与杨媚等^[4]在香蕉抗枯萎病突变体筛选获得的突变体再生植株均来自分化芽一致。证明了萱草EMS诱导抗病突变体产生可用带芽愈伤组织作为受体材料。

EMS是通过与核苷酸中的磷酸、嘧啶和嘌呤直接反应来诱发点突变的，是随机发生的，具有突变方向的不确定性。因此，利用化学诱变剂诱发突变体产生，再通过病原菌毒素的选择压进行抗病突变体的筛选，可对目标性状实现定向选择。本研究利用萱草叶枯病菌毒素液对诱变材料进行了定向选择，取得了良好的效果。

如何提高EMS的诱变育种效率是每个育种人重点关注的课题。我们在研究EMS诱变的基础参数和方法的同时，针对这一问题进行了深入的思考。借鉴以往玉米幼胚愈伤组织基因转化研究的工作经验，结合细胞膜内外水分和物质运输的膜结构理论，提出并研究了渗透胁迫的方法。渗透作用是指溶液中的溶剂分子通过半透膜扩散的作用。对于水溶液而言，就是指水分子从水势高处通过半透膜向水势低处扩散的现象。利用渗透培养基认为造成细胞膜内外渗透压的变化，在愈伤组织表面细胞与渗透溶液之间形成水势差，使细胞内的自由水由细胞内向细胞外扩散，细胞处于失水状态，细胞溶质势降低。在进入低浓度EMS诱变液时，细胞迅速吸水，有利于EMS由细胞外向内扩散，目的是增加EMS的进入量和与染色体的作用机会。从研究结果和应用效果来看，T培养基渗透预处理二类愈伤组织30-60分钟，再进行EMS半致死剂量诱变，对愈伤组织的伤害作用不显著，但是可以有效提高抗病突变体的诱导率10-16%。这一结果通过愈伤组织处理后期的细胞膜透性和保护酶活性的测定得到证实。

利用研究结果对红运大花萱草不同类型的愈伤组织（带芽点的、带分化芽的）进行了5次重复实验。每次实验不同愈伤组织类型180-200块材料，并进行了实验观察和数据统计及分析，得出以带芽愈伤组织为适宜的受体材料。

由于受体材料个体和不同批次之间生理生化状态的差异性，为了数据的更加准确，我们针对EMS的半致死剂量中的处理液浓度和处理时间共进行了10多次重复实验，每次每个处理约100—120块愈伤组织（5-6个培养皿，每皿约20块）。经试验观察，数据统计和分析得出在常规状态下EMS对大花萱草带芽愈伤组织的半致死剂量率。

用上述技术方法共诱变处理了“红运（H）”7个批次，共1939 块愈伤组织，成活 935块愈伤，平均成活率49.0 %。再生植株806株。40%粗毒液筛胁迫筛选处理再生植株760株，获得突变体阳性植株297株，突变体发生率15.3%。

我们用上述技术方法共诱变处理了“金娃娃（J）”5个批次，共1446块愈伤组织，成活 530块愈伤，平均成活率46.8 %，再生植株543株。40%粗毒液筛胁迫筛选处理再生植株491株，获得突变体阳性植株184株，突变体率12.7%。

初步确定其中部分材料为抗大花萱草叶枯病突变体材料。抗病性，抗病级别有待进一步鉴定。除此之外还发现部分生物性状的变异株3株，如叶片出现条斑和叶型变短变宽的类型。以上技术结果“一种甲基磺酸乙酯离体诱变大花萱草产生突变体的方法”已申请国家技术发明专利（申请号：201710218831.X），获得受理并公开。在利用以上技术结果的基础上，对“不同的渗透培养基+EMS对红运萱草二类愈伤组织成活率的影响”进行了3次重复实验，对材料进行了实验观察和成活率的数据统计和分析，以及对实验的可操作性进行了综合评价，得出：T固体渗透培养基适宜于二类愈伤组织渗透胁迫。

由于受体材料个体和不同批次之间生理生化状态的差异性，为了数据的更加准确，我们对T固体渗透培养基的处理时间进行了7次重复实验，每个处理约80-100块愈伤组织（4-5个培养皿，每皿约20块），经试验观察、对愈伤组织生长量、成活率、分化率和成苗率以及病菌毒素定向筛选后的突变体率的数据统计和分析得出30-60分钟的渗透处理可有效提高突变体率10-16%的结论，并且对愈伤组织的不产生致命的伤害。

为了验证不同渗透处理时间对愈伤组织的损伤程度，我们进行了“渗透+EMS处理”后不同生长时间的愈伤组织细胞膜透性和保护酶（SOD、POD、CAT）活性的测定，进一步证明了：T固体渗透培养基对愈伤组织存在一定的伤害作用，并与EMS的伤害存在叠加效应；在处理时间为30-60分钟时伤害是不显著的，且有利于提高突变体的发生率；超过60分钟达到90分钟时，伤害是显著的、不可逆的。

用上述T固体渗透培养基处理的技术方法共诱变处理了“红运（H）”萱草6个批次，共1436 块愈伤组织，成活641块愈伤，平均成活率44.6%。再生植株共806株。40%粗毒液筛胁迫筛选处理后共分化获得抗病突变体阳性植株345株，突变体发生率24.0%，比原技术方法平均提高了10.5%。

初步确定其中部分材料为抗大花萱草叶枯病突变体材料。抗病性，抗病级别有待进一步鉴定。除此之外还发现部分生物性状和花期的变异株，如叶片出现条斑、叶型变短变宽、叶色变淡和花期提前的类型。

Claims (7)

1.一种渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其特征是：

（1）以生长发育正常的1-2cm的大花萱草花蕾为材料，以子房为外植体诱导的愈伤组织接入分化培养基,分化出绿色小芽，成为带芽愈伤组织；

（2）带芽愈伤组织分化培养10天后、EMS诱变前用高渗透T固体培养基：MS全量+6BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+甘露醇36g/L+山梨醇36g/L+蔗糖50g/L+琼脂粉8g/L，胁迫处理愈伤组织30-60分钟；

（3）取出愈伤组织后直接用浓度为0.75-1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理该愈伤组织块60分钟；

（4）处理后的愈伤组织接种于分化培养基进行分化培养，获得再生植株；待再生植株长至1-2cm高时，从愈伤组织上切下转接进入继代培养基继代培养15天；

（5）以浓度为40%（v/v）的萱草叶枯病菌毒素半致死剂量为定向选择压进行胁迫筛选，获得抗病突变体植株。

2.如权利要求1所述的渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其特征是以生长发育正常的1-2cm大花萱草花蕾为材料，无菌条件下用0.1%浓度的HgCl₂消毒灭菌，无菌水冲洗3-4次；无菌条件下剥离花瓣，露出子房，横切成薄片，接种于愈伤组织诱导培养基；25℃，暗培养条件下26-28天，诱导愈伤组织产生；愈伤组织诱导培养基为：MS全量+2mg/L2,4-D+1mg/L6BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；pH5.8。

3.如权利要求1或2所述的渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其特征是将子房诱导出的愈伤组织接种于分化培养基上，25℃，光照培养，光照强度2000Lux，待愈伤组织分化出绿色小芽；将已分化出绿色芽点的愈伤组织切割为0.3-0.5cm³大小，继续分化培养10天的带芽愈伤组织作为高渗透处理和EMS诱变的受体材料；愈伤组织分化培养基为：MS全量+0.5mg/L6BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；pH5.8。

4.如权利要求1或2所述的渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其特征是已分化出绿色小芽、分割成0.3-0.5cm³并继代培养10天的愈伤组织接入含有渗透调节剂甘露醇、山梨醇和蔗糖的高渗透T固体培养基静置培养30-60分钟；而后，将经过高渗透培养的愈伤组织直接进行EMS诱变处理；高渗透T固体培养基：MS全量+0.5mg/L 6BA +0.2mg/IBAL+36g/L甘露醇+36g/L山梨醇+50g/L蔗糖+8g/L琼脂粉；pH5.8。

5.如权利要求1或2所述的渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其特征是 0.75—1.0%（w/v）浓度的EMS半致死剂量是用0.05M的pH7.0的磷酸缓冲液配置成EMS浓度为0.75—1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理液。

6.如权利要求1或2所述的渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其特征是无菌条件下，将经过高渗透T固体培养基培养30-60分钟的愈伤组织转接进浓度为0.75—1.0%（w/v）的EMS半致死剂量处理液中，以28℃、150转/分，振荡培养1小时为EMS诱变处理方法；诱变处理后的带芽愈伤组织在无菌条件下用无菌蒸馏水冲洗3-4次，滤纸吸干水分，接入愈伤组织分化培养基，25℃、光照分化培养；淘汰死亡的愈伤组织，成活的愈伤组织继续分化培养，获得突变体再生植株。

7.如权利要求1或2所述的渗透胁迫处理提高大花萱草EMS离体诱变率的方法，其特征是待突变体再生植株长至1-2cm高时，从愈伤组织上切下在继代培养基上培养15天；转接进经过毒性检测的40%（v/v）浓度的粗萱草叶枯病菌毒素的继代培养基，25±1℃，16 h光/8 h暗，光照强度2800 lx培养21天，进行选择压胁迫筛选；淘汰死亡植株，成活植株转入生根培养基，生根培养成为完整的抗病突变体材料；继代培养基：MS全量+1.0mg/L6BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉pH5.8；选择压筛选培养基：继代培养基+40%（400ml/L）萱草叶枯病粗菌毒素液pH5.8；生根培养基：1/2MS+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+8g/L琼脂粉 pH5.8。