CN114606292B - 一种辣椒炭疽病抗性活体鉴定方法及应用 - Google Patents

一种辣椒炭疽病抗性活体鉴定方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种辣椒炭疽病抗性活体鉴定方法及应用，具体方法包括培育辣椒苗、制备辣椒炭疽菌孢子悬浮、辣椒炭疽菌活体接种及接种后管理、病情调查和品种抗性评价等步骤。即在辣椒苗生长至4~6片真叶时，采用炭疽菌孢子悬浮液喷雾接种辣椒幼苗，接种后第5‑7 d，根据建立的辣椒炭疽病苗期病情分级标准调查各植株病情指数，评价不同辣椒品种的抗感特性。本发明提供的方法是一种辣椒炭疽病活体接种鉴定方法，操作步骤简单、高效，鉴定周期短、结果可靠稳定、可重复性高，可准确的反应鉴定材料的抗性水平，为辣椒炭疽病抗性资源筛选及抗病品种选育、评价提供技术支持。

Description

一种辣椒炭疽病抗性活体鉴定方法及应用
技术领域
本发明属于农作物抗病性鉴定领域，具体涉及一种辣椒对炭疽病抗性活体鉴定方法及其应用。
背景技术
辣椒炭疽病是由炭疽菌属（Colletotrichum sp.）真菌引起的全球性病害，是危害辣椒生产的主要病害之一。辣椒炭疽病主要危害辣椒的叶片和果实。叶片上主要表现为灰褐色、有同心轮纹的近圆形病斑。果实上侵染初期形成水浸状黄褐色病斑，后期病斑凹陷，近圆形或不规则轮纹状，病斑上着生黑色小点，潮湿时有淡红色黏质物溢出。辣椒炭疽病原种类丰富，国内外已报道的引起辣椒炭疽病的病原至少有24种。在我国，辣椒炭疽病的病原主要为平头炭疽菌(C.trnucatum)、黑点炭疽菌（C.capsici）、胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）。
目前，生产上对辣椒炭疽病的防治主要以化学药剂为主，代森锰锌、咪鲜胺、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑等均对辣椒炭疽菌具有一定的抑制作用。但化学药剂的长期使用，极易使病原菌产生抗药性，从而降低了药剂的防治效果。近年来，辣椒炭疽病的生物防治研究较多，但由于生防菌剂见效慢、效果不稳定、难于保存等因素，从而大大限制了其应用前景。推广应用抗病品种是控制辣椒炭疽病危害，减少辣椒损失的最经济有效的方法。但目前商业化的辣椒炭疽病抗病品种极度缺乏，抗病资源材料还不丰富，亟需开展抗炭疽病辣椒种质资源的筛选和评价。准确有效的抗病性鉴定方法的建立是辣椒炭疽病抗性种质资源筛选的技术基础。
抗病品种培育是辣椒炭疽病防治的主要手段。抗病性鉴定贯穿于抗病育种的整个过程，是抗病资源挖掘利用、品种选育、抗性监测等研究中的基础。目前，对于辣椒炭疽病的抗性鉴定主要以辣椒果实离体接种方法为主,而对辣椒活体植株的抗性鉴定方法尚未见报道。研究显示辣椒对炭疽病的抗性是由几个相互独立的抗性基因控制，因此不同辣椒品种、不同时期果实等均会对品种的抗性水平存在影响。另外，以离体果实作为材料进行鉴定，忽略了植物体本身的系统抗性反应。因此,建立准确性高、可重复性强、鉴定周期短、操作简单、可大规模操作的活体辣椒炭疽病抗病性鉴定方法是本领域函待解决的技术难题。
发明内容
针对目前辣椒炭疽病抗性鉴定方法中存在的技术问题，本发明提够一种活体辣椒炭疽病苗期抗病性鉴定方法，实现准确、快速的评价辣椒品种对炭疽病的抗性水平。
本发明所解决的技术问题是通过以下技术方案实现的：
一种辣椒炭疽病抗性活体鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培育辣椒苗。将待评价的辣椒品种播种于无菌育苗基质中育苗。育苗基质成分为草炭和蛭石（体积份数比为2:1），将其混匀后，121℃蒸汽灭菌30min。辣椒种子催芽，种子露白后播种于灭菌的育苗基质中育苗，辣椒苗培养条件温度为23~28℃，光照12h，湿度不超过70%。
（2）制备辣椒炭疽菌孢子悬浮液。辣椒炭疽菌转接于PDA培养基上，28℃培养箱中黑暗培养7~10d，然后用无菌水刷下培养皿上的病原孢子，双层纱布过滤除去菌丝后，配置成浓度为1×105~1×106个孢子/mL的孢子悬浮液。
（3）辣椒炭疽菌活体接种及接种后管理。待辣椒苗长至4~6片真叶期，将配置好的辣椒炭疽菌孢子悬浮液喷雾接种于辣椒苗上，接种后使辣椒植株湿润，特别是保证辣椒茎部完全湿润。将接种后的辣椒苗放于温室或人工气候培养箱中保湿培养，培养温度为25±5℃，光照不少于12h/天，相对湿度为90-95%。
（4）病情调查和品种抗性评价。病原接种5~7d后进行，调查不同品种各个处理植株的发病病级，按辣椒炭疽病病情分级标准计算病情指数，评价品种抗性。所述的苗期辣椒炭疽病病情分级标准为：0级，无症状；1级，幼苗叶片从叶柄处开始萎蔫；2级，叶片萎蔫，茎基部水浸状坏死；3级，整株萎蔫，茎部明显缢缩；4级，整株坏死，茎缢缩干枯，其上着生致密小黑点。病情指数计算公式为：
所述的辣椒炭疽病抗性评价标准为：免疫，病情指数＝0；高抗，0<病情指数≤3；抗病，3<病情指数≤10；中抗，10<病情指数≤30；感病，病情指数>30。
本发明进一步公开了辣椒炭疽病抗性活体的鉴定方法在用于辣椒品种对主要致病病原黑点炭疽、平头炭疽、胶孢炭疽和尖孢炭疽抗性水平鉴定方面的应用。实验结果显示：本发明建立的辣椒炭疽病活体抗性检测方法，可以准确、简便、快速的反应不同辣椒品种对炭疽病的抗性水平。
本发明所涉及的辣椒炭疽病抗性活体鉴定方法及应用和现有技术相比具有如下优点：
（1）本发明建立了辣椒炭疽病活体抗性评价方法，相比目前的果实离体抗病性鉴定方法，可以更准确、可靠的反应辣椒品种的真实抗性水平。
（2）本发明的方法可在温室或人工气候培养箱中进行，环境条件可控，可避免外界气候条件和土壤环境的影响，常年均可进行试验。
（3）本发明建立的抗性鉴定方法操作简便、鉴定时间短、鉴定结果准确稳定，可重复性高，适用于大规模品系、品种的辣椒炭疽病抗性鉴定。
附图说明
图1 辣椒炭疽病发病植株不同病情分级症状；
其中，辣0级，植株正常生长，无病症；1级，幼苗叶片从叶柄处开始萎蔫；2级，叶片萎蔫，茎基部水浸状坏死；3级，整株萎蔫，茎部明显缢缩；4级，整株坏死，茎缢缩干枯，其上着生致密小黑点；
图2 实施例2中不同辣椒品种炭疽病发病症状；
A为抗病品种富贵红，B为感病品种茄门甜椒。
具体实施方式
以下实施例是对本发明实施的具体方法进行详细描述，以便于更好的理解本发明的相关技术。所述的实施例只是本发明的部分实施例，但不用以限制本发明的应用范围。在不脱离本发明实质技术范围内，做出的简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
实施例1
一种辣椒炭疽病抗性活体的鉴定方法按如下步骤进行：
（1）培育辣椒苗：选用的育苗基质成分为草炭和蛭石的体积份数比为2:1，将其混匀后，121℃蒸汽灭菌30min；辣椒种子催芽，种子露白后播种于灭菌的育苗基质中育苗，辣椒苗培养条件为温度为25℃，光照12h，湿度不超过70%；
（2）制备辣椒炭疽菌孢子悬浮液：将辣椒炭疽菌转接于PDA培养基上，28℃培养箱中黑暗培养8d，然后用无菌水刷下培养皿上的病原孢子，双层纱布过滤除去菌丝后，配置成浓度为1×105个孢子/mL的孢子悬浮液；
（3）辣椒炭疽菌活体接种及接种后管理：待辣椒苗长至4片真叶期，将配置好的辣椒炭疽菌孢子悬浮液喷雾接种于辣椒苗上，接种后使辣椒整株湿润，将接种后的辣椒苗放于温室或人工气候培养箱中保湿培养，培养温度为25±5℃，光照12h/天，相对湿度为94%；
（4）病情调查和品种抗性评价：病原接种5d后进行，调查不同品种各个处理植株的发病病级，按辣椒炭疽病病情分级标准计算病情指数，评价品种抗性。辣椒炭疽病病情分级标准为：0级，无症状；1级，幼苗叶片从叶柄处开始萎蔫；2级，叶片萎蔫，茎基部水浸状坏死；3级，整株萎蔫，茎部明显缢缩；4级，整株坏死，茎缢缩干枯，其上着生致密小黑点；
病情指数计算公式为：
辣椒炭疽病抗性评价标准为：免疫，病情指数＝0；高抗，0<病情指数≤3；抗病，3<病情指数≤10；中抗，10<病情指数≤30；感病，病情指数>30。
实施例2
不同辣椒品种对平头炭疽菌(C.trnucatum)的抗性鉴定
1.供试辣椒品种与病原
供试辣椒品种为商品化辣椒种子天宇三号AF1（河北神禾种业有限公司），京线1629（京研益农（北京）种业科技有限公司），中椒6号（中蔬种业（北京）科技有限公司），富贵红（新疆天椒红安农业科技有限责任公司），绿冠甜椒（天津市蓟农种子有限公司），感病对照品种为茄门甜椒（中蔬种业（北京）科技有限公司）。
供试辣椒炭疽菌为从辣椒果实上分离到的平头炭疽菌(C.trnucatum)，由天津市农业科学院植物保护研究所菜病室保存。
（1）将5个待评价的辣椒品种与感病对照品种茄门辣椒播种于无菌育苗基质中育苗。育苗基质成分为草炭和蛭石（体积份数比为2:1），将其混匀后，121℃蒸汽灭菌30min。辣椒种子55℃温汤浸种30min，然后浸泡6h后，在27℃培养箱中催芽4d。将催芽后，露白的辣椒种子播种于灭菌的基质中育苗，置于光照培养室中培养，培养室温度为白天25±5℃，光照12h，湿度60%。
（2）制备辣椒炭疽菌孢子悬浮液。本试验采用的辣椒炭疽菌为平头炭疽菌(C.trnucatum)。将病原菌转接于PDA培养基上，28℃培养箱中黑暗培养7d，然后用无菌水刷下培养皿的孢子，双层纱布过滤除去菌丝后，配置成浓度为1.2×105个孢子/mL的孢子悬浮液，用于接种。
（3）辣椒炭疽菌活体接种及接种后管理。辣椒苗长至5片叶时，将浓度为1.2×105个孢子/mL的平头炭疽菌孢子悬浮液喷雾接种于试验辣椒苗上，使辣椒整株湿润。将接种后的辣椒苗放于人工气候培养箱中保湿培养，培养温度为26℃，光照14h/天，相对湿度为90%。
（4）病情调查和品种抗性评价。接种7d后，调查不同品种辣椒苗发病情况，按辣椒炭疽病病情分级标准进行病情指数调查，并进行品种抗病性评价。
辣椒炭疽病病情分级标准为：0级，无症状；1级，幼苗叶片从叶柄处开始萎蔫；2级，叶片萎蔫，茎基部水浸状坏死；3级，整株萎蔫，茎部明显缢缩；4级，整株坏死，茎缢缩干枯，其上着生致密小黑点；
病情指数计算公式为：
辣椒炭疽病抗性评价标准为：免疫，病情指数＝0；高抗，0<病情指数≤3；抗病，3<病情指数≤10；中抗，10<病情指数≤30；感病，病情指数>30。
表1.不同辣椒品种炭疽病（C.trnucatum）发病情况及抗性评价
从表1结果中可以看出，对照感病品种茄门甜椒的病情指数为65.63，鉴定为感病品种，说明此鉴定方法的鉴定结果准确、可靠。试验的5个商品种，富贵红病情指数最低为9.38，表现为抗病；绿冠甜椒病情指数最高为57.29，表现为感病；其它3个品种的病情指数在13.54～27.08之间，均表现为中抗。
实施例3
不同辣椒品种对黑点炭疽菌（C.capsici）的抗性鉴定
1.供试辣椒品种与病原
供试辣椒品种同实施例2中的试验品种。
供试辣椒炭疽菌为从辣椒果实上分离到的黑点炭疽菌（C.capsici），由天津市农业科学院植物保护研究所菜病室保存。
（1）培育辣椒苗，同实施例1中的方法。
（2）制备接种用辣椒炭疽菌孢子悬浮液。本试验采用辣椒炭疽菌为黑点炭疽菌（C.capsici）。将病原菌转接于PDA培养基上，28℃培养箱中黑暗培养7d，然后用无菌水刷下培养皿的孢子，双层纱布过滤除去菌丝后，配置成浓度为6.5×105个孢子/mL的孢子悬浮液，用于接种。
（3）辣椒炭疽菌活体接种及接种后管理，同实施例1中的方法。
（4）病情调查和品种抗性评价，同实施例1中的方法。
表2.不同辣椒品种炭疽病（C.capsici）发病情况及抗性评价：
从表2结果中可以看出，对照感病品种茄门甜椒的病情指数为54.38，鉴定为感病品种，说明此鉴定方法的鉴定结果准确、可靠。鉴定的5个品种中，富贵红病情指数最低为6.88，表现为抗病；绿冠甜椒病情指数最高为36.25，表现为感病；其它3个品种的病情指数在11.88～27.50之间，均表现为中抗。
通过实施例2和和实施例3的试验结果中可以看出，不同炭疽病原对相同辣椒品种的侵染力存在一定的差异，如平头炭疽对绿冠甜椒的侵染力比黑点炭疽高，而二者对京线1629品种的侵染力差异不大。因此，鉴于辣椒炭疽菌的病原丰富，对其抗性水平的鉴定应采取多病原结合鉴定的方法。本发明建立的辣椒炭疽病苗期活体抗性鉴定方法适用于辣椒品种对病原黑点炭疽和平头炭疽的抗性水平鉴定。
实施例4
辣椒炭疽不同病原对茄门甜椒活体致病力鉴定
1.供试辣椒品种与病原
供试辣椒品种茄门甜椒（中蔬种业（北京）科技有限公司）。
供试辣椒炭疽菌为辣椒果实及种子上分离到的4种病原菌，其中平头炭疽菌(C.trnucatum)和黑点炭疽菌（C.capsici），由天津市农业科学院植物保护研究所菜病室保存；胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C.acutatum），由天津市农业科学院植物保护研究所种苗病害室保存。
（1）培育辣椒苗，同实施例1中的方法。
（2）制备接种用辣椒炭疽菌孢子悬浮液。本试验采用4种辣椒炭疽菌，分别为平头炭疽菌(C.trnucatum)、黑点炭疽菌（C.capsici）、胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）。将病原菌转接于PDA培养基上，28℃培养箱中黑暗培养7d，然后用无菌水刷下培养皿的孢子，双层纱布过滤除去菌丝后，分别配置成浓度为2.5×105个孢子/mL的孢子悬浮液，用于接种。
（3）辣椒炭疽菌活体接种及接种后管理。辣椒苗长至5片叶时，4种炭疽病原孢子悬浮液分别喷雾接种于试验辣椒苗上，使辣椒整株湿润。将接种后的辣椒苗放于人工气候培养箱中保湿培养，培养温度为27℃，光照14h/天，相对湿度为95%。
（4）病情调查和品种抗性评价，同实施例1中的方法：
表3.辣椒炭疽不同病原对茄门甜椒活体致病力鉴定
从表3结果中可以看出，将4种主要的辣椒炭疽菌接种于辣椒炭疽病感病品种茄门甜椒上，对其均具有较强的致病力，根据辣椒炭疽病抗性评价标准，均可将茄门辣椒划定为感病品种，说明本发明建立的方法也适用于辣椒品种对4种主要的炭疽病病原平头炭疽菌(C.trnucatum)、黑点炭疽菌（C.capsici）、胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）的抗性鉴定。

Claims (1)

1.一种辣椒炭疽病抗性活体的鉴定方法在用于辣椒品种对主要致病病原黑点炭疽、平头炭疽、胶孢炭疽和尖孢炭疽抗性水平鉴定方面的应用，其特征在于，所述鉴定方法按如下步骤进行：
（1）培育辣椒苗：选用的育苗基质成分为草炭和蛭石的体积份数比为2:1，将其混匀后，121℃蒸汽灭菌30min；辣椒种子催芽，种子露白后播种于灭菌的育苗基质中育苗，辣椒苗培养条件为温度为23~28℃，光照12h，湿度不超过70%；
（2）制备辣椒炭疽菌孢子悬浮液：将辣椒炭疽菌转接于PDA培养基上，28℃培养箱中黑暗培养7~10d，然后用无菌水刷下培养皿上的病原孢子，双层纱布过滤除去菌丝后，配置成浓度为1×105~1×106个孢子/mL的孢子悬浮液；
（3）辣椒炭疽菌活体接种及接种后管理：待辣椒苗长至4~6片真叶期，将配置好的辣椒炭疽菌孢子悬浮液喷雾接种于辣椒苗上，接种后使辣椒整株湿润，将接种后的辣椒苗放于温室或人工气候培养箱中保湿培养，培养温度为25±5℃，光照不少于12h/天，相对湿度为90-95%；
（4）病情调查和品种抗性评价：病原接种5~7d后进行，调查不同品种各个处理植株的发病病级，按辣椒炭疽病病情分级标准计算病情指数，评价品种抗性；
所述步骤（4）中，辣椒炭疽病病情分级标准为：0级，无症状；1级，幼苗叶片从叶柄处开始萎蔫；2级，叶片萎蔫，茎基部水浸状坏死；3级，整株萎蔫，茎部明显缢缩；4级，整株坏死，茎缢缩干枯，其上着生致密小黑点；
所述步骤(4)中，病情指数计算公式为：
病情指数=Σ（发病叶数×相应病级数）×100/（调查总叶数×4）；辣椒炭疽病抗性评价标准为：免疫，病情指数=0；高抗，0<病情指数≤3；抗病，3<病情指数≤10；中抗，10<病情指数≤30；感病，病情指数>30。
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