CN102154193B - 一种诱导辣椒疫霉菌产生大量孢子囊的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导辣椒疫霉菌产生大量孢子囊的方法,其特征在于：先将辣椒疫霉菌用固体培养基25℃-28℃培养4-5天,菌丝生长旺盛时用灭菌的打孔器制备成直径3mm-5mm的菌块,将菌丝块接种于丝瓜表皮的接种孔5mm-15mm内，在相对湿度大于90%的条件下，保湿培养3-4天。应用范围为由辣椒疫霉菌引起的作物病害接种，辣椒疫病或甜椒疫病的抗病性鉴定，防治辣椒疫病的杀菌剂药效试验，杀菌剂对孢子囊萌发的抑制试验等。本发明的方法操作简便，产孢时间短，产孢量大，致病力强，应用于与疫霉菌的研究有实际的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于农业植物保护技术领域，涉及一种辣椒疫霉孢子囊大量产生的方法，更具体的说涉及诱发孢子囊形成的材料及产孢条件以便孢子囊产生快、数量多、致病力强。
背景技术
辣椒疫霉菌( phytophthora capsici Leonian)是引起辣椒疫病的一种世界性病害，除危害辣椒外，还侵染番茄、茄子、黄瓜、西瓜、南瓜等作物。该病1918年在美国首次被发现，现已遍及世界各地的辣椒种植区，我国于1950年首次在江苏发现此病，现该病已蔓及全国各地。近年来随着保护地栽培面积的扩大，该病有逐年不断加重发生的趋势。一般死株率15％～30％，严重的高达50％～60％，造成了严重经济损失。气候适宜的条件下，疫病短期即可爆发，使辣椒生产遭受严重的损失。近几年疫霉根腐病又是辣椒疫霉菌引起的另一种症状的重要病害，对辣椒等寄主作物同样可以造成毁灭性损失。辣椒疫病的病原菌是辣椒疫霉菌, 是危害辣椒生产的一种毁灭性的病害。该病原菌潜育期短, 传播快, 侵染力强, 对植物破坏性大。
辣椒疫病的再侵染源是辣椒疫霉菌的孢子囊。辣椒疫病病原菌主要以卵孢子和厚垣孢子在病株残体上、土壤中和种子上越冬，成为来年病害发生的初侵染源。卵孢子在土壤中可以存活2～3年。土壤中的卵孢子可萌发直接侵染辣椒根颈和茎基部，也可被滴溅传至植株近地面的茎、叶、果上侵染发病。重茬年限越长，病菌积累越多，发病越重。P．capsici菌丝生长和孢子囊的形成都要求较高的温度、湿度，当温度高于25℃，相对湿度大于90%时，最利于该菌的侵染。引起流行再侵染的接种体是孢子囊和游动孢子，它们借气流或流水传播或接触传播。发病后病部产生的孢子囊，借风、雨传播进行重复侵染，造成田间病害的蔓延和危害。疫霉菌在多种培养基上均能正常生长发育并能产孢，只是有产孢量差异。长期以来疫霉菌产孢量低，产孢时间长是制约辣椒疫病研究的瓶颈。为了顺利进行辣椒疫病人工接种抗病性鉴定，关键是在短期内繁殖大量的辣椒疫霉孢子囊，因此，掌握辣椒疫霉的孢子囊产生最佳条件是进行辣椒疫病菌研究的先决条件。
由于辣椒疫霉不易保存,一般通过频繁转接来保存较长时间,试验结果表明,长时期在同一培养基中培养,对其致病性有影响。辣椒疫霉菌常规培养保存均以菌丝形式，不断用菌丝繁殖菌丝连续培养多代，会造成菌株生活力退化，营养条件是致病力分化的重要因子，辣椒疫霉长时间在同一环境条件下生长, 其致病性会逐渐发生变异,从而导致致病力的分化。进行抗病性鉴定前，有必要进行复壮，以消除因生活力衰退造成的试验误差。很多的研究利用固体培养基如马铃薯琼脂培养基、玉米粉培养基、胡萝卜培养基、燕麦培养基、V8培养基等通过一定时间的光照培养，或菌丝块加入到无菌水内诱发孢子囊，这样得到的孢子囊数量少，没有进行复壮，致病力一般较弱。本发明得到的孢子囊不仅数量多，时间短，且致病力得到加强。
发明内容
本发明的目的是为解决辣椒疫霉菌快速形成大量孢子囊的问题，为此，本发明提供一种诱发辣椒疫霉菌产生大量孢子囊的方法。它是先将辣椒疫霉菌用培养基25-28℃培养4-5天,菌丝生长旺盛时用灭菌的打孔器制备成直径3-5mm的菌块, 将菌丝块接种于丝瓜表皮的接种孔5-15mm内，用透明的胶带包裹，室温，置于流动水下3-4天，或置于托盘内透明薄膜保湿3-4天。在相对湿度大于90%的条件下，保湿培养3-4天。
本发明所述的一定时间的光照指的是：室内自然光，或培养箱内具有光照即可。
本发明所述的诱导方法，其中的马铃薯琼脂培养基为普遍公开使用的培养基。
本发明所述的诱导方法，其中的丝瓜表皮指的是新鲜丝瓜。
本发明所述的诱导方法，其中菌丝块接种于丝瓜孔5-15mm内，用透明的胶带包裹，室温，置于流动水下3-4天，或置于托盘内透明薄膜保湿3-4天。
本发明所述的诱导方法，其中先将丝瓜用清水冲洗干净,采用75%乙醇表面消毒后，用15mm灭菌打孔器在丝瓜表面每隔5cm均匀打孔，孔在一条直线上，将准备好的菌丝块接种于丝瓜孔内，接种孔周围丝瓜的表面已附满匍匐的白色菌丝及大量孢子囊即可。
本发明所述诱导辣椒疫霉菌产生大量孢子囊的方法在制备辣椒品种抗病性鉴定或杀菌剂对辣椒疫病药效测定方面的应用。
本发明的诱导方法是先将辣椒疫霉菌（参考徐作珽, 李林, 魏道君, 等. 大棚辣椒疫病菌的分离培养及药剂防治[ J] . 植物保护, 1999, 2: 29- 31.）的方法进行病株分离培养得到。培养于适宜菌丝生长的培养基内如马铃薯琼脂培养基（PDA），25-18℃下培养4-5天,菌丝生长旺盛时用5mm的打孔器准备菌块。利用新鲜丝瓜，先将丝瓜用清水冲洗干净,75%酒精表面消毒后，用灭菌的打孔器(15 mm)在丝瓜表面每隔5cm左右均匀打孔，孔最好在一条直线上，将准备好的菌丝块接种于丝瓜孔内，用透明的胶带包裹，室温，置于流动水下3-4天，或置于托盘内透明薄膜保湿3-4天，接种孔周围丝瓜的表面已附满匍匐的白色菌丝及大量孢子囊。新方法诱发形成的孢子囊数量多，时间短，且致病力强。
本发明采用的丝瓜诱导方法中非常重要的步骤在于使用材料为新鲜丝瓜，接种菌块后的保湿及一定时间的光照这是因为：
（1）离体植株组织在室温条件下很容易感染杂菌腐烂。
（2）辣椒疫霉菌菌丝侵染丝瓜需要较高的温、湿度，当温度高于25℃，相对湿度大于90%时，最利于该菌的侵染。
（3）辣椒疫霉菌孢子囊的形成需要一定时间的间歇光照及大于80%的相对湿度。
本发明人对诱发辣椒疫霉菌孢子囊的形成进行了多次试验，试验结果显示，固体培养基上诱发形成的孢子囊数量少，形成时间长，释放游动孢子接种6叶-7叶的辣椒苗，致病力弱，需要大量的孢子悬浮液，发病时间长，而经过丝瓜诱发的孢子囊，释放游动孢子接种6叶-7叶的同一品种辣椒苗，致病力强，需要的孢子悬浮液量少，发病时间短。
本发明提供的诱导方法应用范围为辣椒品种的抗病性鉴定、杀菌剂对辣椒疫病的药效测定等。本发明提供的方法不仅可以形成大量孢子囊，而且对菌株具有复壮作用。本发明的方法操作简便，形成大量孢子囊的时间短，可用于大批量接种使用。
具体实施方式
为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合试验实例对本发明做进一步的说明。其中丝瓜为市售。
实施例1
将保存的辣椒疫霉菌活化（将保存的状态转到马铃薯蔗糖琼脂培养基）培养至马铃薯蔗糖琼脂培养基,25 ℃下培养5天,菌丝生长旺盛时用5mm的打孔器准备菌块。将丝瓜用清水冲洗干净,75%酒精表面消毒后，用灭菌的打孔器(15mm)在丝瓜表面每隔5cm左右均匀打孔，孔最好在一条直线上，将准备好的菌丝块接种于丝瓜孔内，用透明的胶带包裹，室温，置于托盘内透明薄膜保湿3-4天。
马铃薯蔗糖琼脂培养基（PDA）的成分及组成如下：
马铃薯块200g;葡萄糖20g;琼脂条20g；蒸馏水1000ml
将洗净去皮的马铃薯切碎，加1000ml蒸馏水煮沸30min，双层纱布滤掉薯块并在滤液,中加入琼脂条溶化，过滤后加葡萄糖，混合均匀定容1000mI，15磅高压蒸汽灭菌25min。
实施例2
将保存的辣椒疫霉菌活化（见实例1）培养至V8培养基, 28 ℃下培养4天,菌丝生长旺盛时用5mm的打孔器准备菌块。将丝瓜用清水冲洗干净,75%酒精表面消毒后，用灭菌的打孔器(15 mm)在丝瓜表面每隔5 cm左右均匀打孔，孔最好在一条直线上，将准备好的菌丝块接种于丝瓜孔内，用透明的胶带包裹，室温，置于托盘内透明薄膜保湿3-4天。
V8培养基的成分及组成如下：
白芸豆60g,V8蔬菜汁100ml;1.4g碳酸钙，18g琼脂粉，蒸馏水1000ml
白芸豆60g粉碎后，50-60℃水浴1小时，过滤后加入V8蔬菜汁100ml，再加入1.4g碳酸钙,混合均匀后加入琼脂粉，定容至1000mI，15磅高压蒸汽灭菌20min。
实施例3
（1）将保存的辣椒疫霉菌活化（见实例1）培养至马铃薯蔗糖琼脂培养基, 28℃下培养5天,菌丝生长旺盛时用5mm的打孔器准备菌块。将丝瓜用清水冲洗干净,75%酒精表面消毒后，用灭菌的打孔器(15mm)在丝瓜表面每隔5cm左右均匀打孔，孔最好在一条直线上，将准备好的菌丝块接种于丝瓜孔内，用透明的胶带包裹，室温，置于托盘内透明薄膜保湿3-4天。用无菌水洗下丝瓜表面的白色菌丝，双层纱布过滤后，置于4℃下静置30分钟 ,诱发游动孢子的释放。利用血球计数板于显微镜下镜检孢子浓度。
（2）每个处理准备10株甜椒苗，重复三次，6-7叶灌根接种。用玻璃棒在根附近扎3cm 左右孔，每株接种5ml菌液，清水对照不灌菌液。置于25℃左右，保持一定湿度。3天后开始调查发病情况。
接种浓度为105个/ml,由于接种浓度大，5天后植株全部发病；浓度为104个/ml，接种3天后，大部分植株已发病，且病指较高；浓度为103个/ml，为此方法的适宜接种浓度。
表1 不同接种量对辣椒疫病发病的影响
实施例4
比较试验：
常规方法：将活化后的同一辣椒疫霉菌株（见实例1）分别培养在马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA、V8培养基、燕麦培养基、玉米培养基及胡萝卜培养基上27℃暗培养5d后，用灭菌毛笔在菌丝上刷上无菌水，持续光照24小时诱导产孢（40瓦日光灯下相距30～35cm），用10ml无菌水刮去表面的菌丝。镜检记录孢子囊个数。
本发明的方法：将保存的辣椒疫霉菌活化培养至马铃薯蔗糖琼脂培养基, 27℃下培养4-5天,菌丝生长旺盛时用5mm的打孔器准备菌块。将丝瓜用清水冲洗干净,75%酒精表面消毒后，用灭菌的打孔器(15 mm)在丝瓜表面每隔5cm左右均匀打孔，孔最好在一条直线上，将准备好的菌丝块接种于丝瓜孔内，用透明的胶带包裹，室温，置于托盘内透明薄膜保湿3-4天。切取0.1cm3丝瓜表面，用无菌水洗下的白色菌丝，镜检每个视野（10×10）孢子囊数量。
表2 不同的培养基对辣椒疫霉菌孢子囊形成的影响
| 不同方法 | 产孢量（个） | 产孢天数（天） |
| PDA | 25 | 6 |
| V8 | 32 | 6 |
| 燕麦 | 19 | 6 |
| 玉米 | 20 | 6 |
| 胡萝卜 | 29 | 6 |
| 丝瓜 | 145.2 | 3 |
结论：几种培养基上培养辣椒疫霉菌，经过诱导后均可以形成孢子囊，比较不同的培养基固体培养基菌丝长好后再诱发孢子囊，共需6天左右，且产孢数量少；丝瓜法产孢仅需3天即可获得大量孢子囊。
实施例5
菌株致病性退化的比较试验：
同一菌株活化后培养，分别转接5代、10代后在胡萝卜培养基上光照诱发孢子囊，在胡萝卜培养基上培养5天后，用灭菌毛笔在菌丝上刷上无菌水，持续光照24小时诱导产孢（40瓦日光灯下相距30～35cm）；取转接10代后的菌丝，利用本发明的丝瓜培养法诱发孢子囊。用无菌水洗下孢子囊，4℃诱发游动孢子的释放。接种用孢子浓度为104个/ml。
致病性鉴定：利用6叶左右的甜椒苗，用玻璃棒在甜椒根附近扎3cm 左右孔，每株接种5ml菌液，置于25℃左右，保持一定湿度。3天后开始调查发病情况。
表3 不同的转接代数对辣椒疫霉菌致病力的影响
| 不同代数 | 发病率% |
| 1代 | 25 |
| 5代 | 10 |
| 10代 | 5 |
| 10代后丝瓜培养 | 75 |
由此可知，在固体培养基上随着转接代数的增加同一菌株致病力减弱。在经过本发明的方法诱发后致病力增强。
实施例6
方法：丝瓜培养法
步骤：采用实施例3的步骤，接种浓度为103个/ml。对几个不同的辣椒品种进行鉴定，辣椒苗为6-7叶期。
表4 不同的辣椒品种的抗性
| 不同品种 | 发病率% | 病情指数 | 抗性评价 |
| 天鹰椒3号 | 10 | 4.78 | HR |
| 特大牛角椒 | 33.3 | 27.5 | R |
| 超大甜椒 | 75 | 65.2 | S |
| 黄太极 | 63.3 | 56.7 | S |
接种后5天调查，即可鉴定出几个品种的抗病情况，天鹰椒3号高抗疫病，特大牛角椒为中抗品种，超大甜椒及黄太极为感病品种。
实施例7
方法：先喷药后接菌
步骤：甜椒苗7-8叶期，喷淋几种杀菌剂，24h后接种采用本发明诱发的辣椒疫霉菌孢子囊，用玻璃棒在甜椒根附近扎3cm 左右孔，每株接种5ml菌液，接种浓度为103个/ml ，空白对照仅接菌液，8天后调查药效。
表5 几种杀菌剂对甜椒疫病的防效
| 不同处理 | 发病率% | 病情指数 | 防效% |
| 70%丙森锌WP400倍 | 5 | 8.2 | 84.6 |
| 50%烯酰吗啉WP1200倍 | 25 | 12.6 | 76.4 |
| 68%金雷WP1000倍 | 7.8 | 10.5 | 80.3 |
| 空白对照 | 80 | 53.4 |
8天后调查，几种杀菌剂对甜椒疫病的防效不同。此接种方法可以用于药效测定。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
Claims (4)
1. 一种诱导辣椒疫霉菌产生大量孢子囊的方法, 其特征在于：先将辣椒疫霉菌用马铃薯琼脂培养基25-28℃培养4-5天,菌丝生长旺盛时用灭菌的打孔器制备成直径3mm-5mm的菌块, 将菌丝块接种于直径5-15mm的丝瓜表皮接种孔内，用透明的胶带包裹，室温，置于流动水下3-4天，或置于托盘内透明薄膜保湿3-4天。
2.权利要求1所述的方法，其中的丝瓜表皮指的是新鲜丝瓜的表皮。
3.权利要求1所述的方法，其中先将丝瓜用清水冲洗干净,采用75%乙醇表面消毒后，用15mm灭菌打孔器在丝瓜表面每隔5cm均匀打孔，孔在一条直线上，将准备好的菌丝块接种于丝瓜孔内，接种孔周围丝瓜的表面已附满匍匐的白色菌丝及大量孢子囊即可。
4.权利要求1所述诱导辣椒疫霉菌产生大量孢子囊的方法在辣椒品种抗病性鉴定或杀菌剂对辣椒疫病药效测定方面的应用。
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