CN109055265A - 一种生防菌及其在农作物蔓枯病防治方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生防菌及其在蔓枯病防治方面的应用。本发明的生防菌CGMCC NO.15764，可以有效防治农作物蔓枯病，特别是对于西甜瓜蔓枯病的防治效果显著，对于西甜瓜还有促进生长的作用，可以应用于农作物蔓枯病的防治和西甜瓜的种植；再者，本发明的生防菌与现有技术的化学药剂相比，对人畜无毒，不污染环境，无残留，有利于生态环境的可持续发展。

Description

一种生防菌及其在农作物蔓枯病防治方面的应用

技术领域

本发明涉及一种生防菌及其在蔓枯病防治方面的应用，属于农作物生物防治技术领域。

背景技术

西甜瓜在全球范围内的农业作物产量中占有举足轻重的地位，具有一定的经济价值和经济效益。但每年因为各种病害造成的西甜瓜大量减产带来了不少经济损失，其中蔓枯病是影响西甜瓜产量和品质的主要病害之一。

西甜瓜蔓枯病是由瓜类球腔菌(Mycosphaerlla melonis)引起一种毁灭性病害，又称“黑腐病”，危害西瓜和甜瓜的叶片、茎蔓、果实等，其中以茎蔓受害最重。瓜类球腔菌属子囊菌亚门真菌，分生孢子呈短圆形或圆柱形，无色透明，两端较圆，初为单孢，后产生1～2个隔膜，分隔处略缢缩。西甜瓜蔓枯病在其各个时期都可发生，其中结果期发病最重。西甜瓜蔓枯病原菌适宜在25－30℃下生长，其中在露地雨季，土壤含水量到的时候发病严重，而土温低于23℃，高于34℃，发病则轻。蔓枯病是一种土传性病害，病菌数量可以在土壤中常年不断积累，通过含菌土壤传播，重茬种植的土地发病更为严重，并且种子亦可传病。

目前，防治蔓枯病的主要措施还是使用化学药剂。化学药剂虽然可以在一定程度上防治西甜瓜蔓枯病，但也会导致土壤中化学药剂残留超标，西甜瓜上含有的化学药剂也会威胁人类的健康，带来很多负面效应。抗病品种的选育也是防治西甜瓜蔓枯病的方法之一，但抗病品种的选育往往需要长时间的消耗。在农业防治中常常采用轮作的方法防治蔓枯病，但在实际中存在一定困难，一是西甜瓜属于高经济值作物；二是由于蔓枯病原菌能够在土壤中存活积累，短期轮作达不到预期目的；三是种植大多数非寄主植物不能减少蔓枯病原菌在土壤中的数量，而且非寄主的根分泌物仍能为蔓枯病原菌存活提供营养。

生物防治与其他方法相比，具有安全、有效、持久的特点，特别是避免了化学防治带来的一系列问题。生防制剂对病害防治效果好，对人畜无毒，不污染环境，无残留；对病虫害的杀伤特异性强，不伤害天敌，有益生物，能保持生态平衡；生产原料和有效成分为天然产物易降解，可回归大自然，保证可持续发展；可用生物技术和基因工程的方法对微生物进行改造；多种因素和成分发挥作用，病原菌难以产生抗药性。

因此，本领域希望能够筛选出防治蔓枯病的生防菌，尤其是能够在西甜瓜生长所处环境中进行很好地生长繁殖的生防菌，在应用中更具有实际意义。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种生防菌，其中，所述生防菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为 CGMCC NO.15764。

本发明另一方面提供了一种采用上述生防菌的菌药组合物，其中，所述菌药组合物包含杀菌剂和上述的生防菌的菌粉，所述杀菌剂为三唑类杀菌剂、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、烟酰胺类杀菌剂或二羧酰亚胺类杀菌剂中任意一种或几种的混合物。

本发明再一方面提供了一种菌药制剂，其中，所述菌药制剂包含上述的生防菌和农药学上可接受的助剂。

本发明再一方面提供了一种菌药制剂，其中，所述菌药制剂包含上述的菌药组合物和农药学上可接受的助剂。

本发明还一方面提供了上述的生防菌在防治农作物蔓枯病方面的应用或者在西甜瓜种植方面的应用。

本发明还一方面提供了上述的菌药组合物在防治农作物蔓枯病方面的应用。

本发明还一方面提供了上述的菌药制剂(包含上述的生防菌和农药学上可接受的助剂)在防治农作物蔓枯病方面的应用或者在西甜瓜种植方面的应用。

本发明还一方面提供了上述的菌药制剂(包含上述的菌药组合物和农药学上可接受的助剂)在防治农作物蔓枯病方面的应用。

本发明提供的生防菌CGMCC NO.15764，可以有效防治农作物蔓枯病，特别是对于西甜瓜蔓枯病的防治效果显著，对于西甜瓜还有促进生长的作用，可以应用于农作物蔓枯病的防治和西甜瓜的种植；再者，本发明的生防菌与现有技术的化学药剂相比，对人畜无毒，不污染环境，无残留，有利于生态环境的可持续发展。

附图说明

图1为针对蔓枯病真菌的平板拮抗试验结果的照片。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

下面具体实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。

一、下面介绍本申请发明人从自然环境中分离筛选获得本发明的生防菌 (解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC NO.15764的操作过程。

(1)初筛：分离潜在的生防菌

从常年发生西瓜蔓枯病的田间选取长势良好的西瓜植株，取其根围土(采自上海阿林果蔬园的西瓜根围土壤)。将根围土风干，取风干过筛(2mm 筛目)土10g，放入含有90mL灭菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡20-30 min，将稀释10⁴和10⁵倍的悬浮液0.2mL分别加入已备好的LB培养基表面，涂布平板，28℃恒温培养，挑取不同菌落形态菌落备用。

(2)复筛：平板对峙培养法筛选拮抗细菌

用直径为0.8cm的打孔器将西瓜蔓枯病菌菌丝块接种于PDA培养基中心，同时将初筛中筛选到的菌株接种到PDA平板上，每皿点接4个菌株，4 点位置成十字。以只接西瓜蔓枯病菌菌丝块的平板作为对照。25℃下培养，对照长满全皿时，记录抑菌圈大小。选取有抑菌作用的菌株进行进一步筛选，同上述方法将西瓜蔓枯病菌菌丝块接种在PDA培养基的中心，然后再距离该中心等距离相对的两处接种上具有抑菌作用的菌株，另外两个相对的角接上无菌水作为对照。25℃培养，每隔两天观察真菌的生长情况。

通过平板拮抗实验，筛选出了具有潜在可防治西瓜蔓枯病的生防菌株 HSSN09。

二、关于本发明的生防菌HSSN09的鉴定过程如下：

分子生物学鉴定

取上述筛选获得的生防菌HSSN09菌体，采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组DNA。

再采用天根生化科技有限公司的PCR扩增试剂盒扩增该生防菌的gyrB 基因片段，以上述提取的基因组DNA产物为模板；扩增采用的正向引物序列为：5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA -3’；扩增采用的反向引物序列为：5’-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCR TCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3”；这两条引物序列中的“N”表示A/G/C/ T中的任意一种碱基，“R”表示A/G的中的任意一种碱基，Y代表C/T中的任意一种碱基；引物合成公司在合成引物时会随机组合，获得的合成引物为这些随机组合的混合物。具体PCR扩增操作按照试剂盒说明书进行。

用水平电泳检测PCR产物，扩增条带使用天根生化科技有限公司的DNA 纯化回收试剂盒进行切胶回收。回收的样品送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

将测序结果通过NCBI BLAST软件进行同源性比较(与已知细菌的gyrB 基因片段序列进行相似性比对)，最终鉴定本发明的生防菌HSSN09为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

三、关于菌株的保藏

本发明的生防菌HSSN09，属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏日期为2018年05月15日，其保藏编号为CGMCC No.15764。

四、本发明生防菌HSSN09的培养方法以及应用

将本发明的生防菌HSSN09在LB平板(LB配方：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2)上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑单菌落接入含有5ml LB培养液的试管中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，作种子液。按照1:100的比例将种子液接于500mL的LB培养液中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，至其活菌总浓度为5×10⁹CFU/ml。

关于本发明生防菌HSSN09的应用，一般来说，在农作物移栽后，立刻用上述培养获得的菌液稀释100～200倍对移栽的农作物进行灌根，同时进行叶面喷施。

五、本发明生防菌HSSN09对蔓枯病真菌的平板拮抗试验结果

具体的试验方法为：将保存于4℃中的蔓枯病真菌接种到PDA平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为8mm 的圆形菌块，再将该圆形菌块接种在新的PDA平板的中心。然后在距离该中心等距离的相对两处用无菌牙签点接种本发明的生防菌HSSN09的菌液(菌液的活菌浓度为5×10⁵CFU/ml)，另外两个相对角接种灭菌水作为对照，再将平板倒置，放置于25℃培养箱中培养，每隔两天观察真菌生长情况；上述处理同时做3组平行实验。

参见图1，为对蔓枯病真菌的平板拮抗试验的照片，其中左右两侧的的菌斑为接种了生防菌HSSN09的菌斑，上下两侧为对照。

经测量，左右两侧的生防菌HSSN09的菌斑的半径为0.60cm(以生防菌接种点为圆心的半径)，生防菌HSSN09的菌斑的边缘到蔓枯病真菌的边缘的距离为0.83cm，上下两侧(对照处)的蔓枯病真菌的菌斑半径为3.89cm (以上述圆形菌块的中心点为圆心的半径)，由这些数据可以看出生防细菌 HSSN09具有良好的抑菌效果。

因此，从上述平板拮抗试验结果可知：生防菌HSSN09对蔓枯病真菌具有明显的拮抗活性。

六、本发明生防菌HSSN09对西瓜蔓枯病和甜瓜蔓枯病的温室防病试验结果

待西瓜苗3-4叶期后，挑选长势一致的西瓜苗移栽到含有营养土的盆钵中，每个盆钵中移栽一颗西瓜苗，一次移栽10颗西瓜苗。

移栽完当天，用生防菌HSSN09的菌液(活菌浓度为1×10⁷CFU/ml)对西瓜苗进行灌根法处理，每颗苗灌20ml；此为实验组(西瓜蔓枯病试验的实验组)。

同时，同样的移栽方式，采用灌根法、每颗苗浇灌20ml清水作为对照组(西瓜蔓枯病试验的对照组)。

随即，再采用灌根法对上述实验组和对照组浇灌20mL孢子悬浮液(西瓜蔓枯病的孢子悬浮液，孢子浓度为5×10⁶个/mL)。

20-25℃保湿，每天观察各组情况，待对照组出现发病情况后(大约28 天左右)，开始统计发病情况，对照组发病率达95％以上后停止观察。

关于发病情况的统计，下面介绍蔓枯病病害分级标准：

0级：无病症；

1级：叶片感病而茎蔓不感病；

3级：叶片感病严重而茎蔓不感病；

5级：茎蔓轻微感病；

7级：茎蔓严重感病；

9级：整株死亡。

关于“病害严重程度”和“防治效果”的计算公式：

病害严重度(％)＝100％×Σ(病植株数×病级数)/(总植株数×最高病级数)；

防病效果(％)＝100％×(对照病害严重度-处理病害严重度)/对照病害严重度；

西瓜蔓枯病的温室防病试验结果如下表1。

表1

表格中的数值为平均值±标准误差，以下表格皆同。

按照上述同样的方法，获得了甜瓜蔓枯病的温室防病试验结果如下表2。

表2

	病害严重度(％)	防治效果(％)
			实验组	8.36±0.67	90.35
对照组	86.67±0.87	—

从上述表1和表2的针对蔓枯病的温室防病试验结果显示，本发明的生防菌HSSN09对西瓜蔓枯病和甜瓜蔓枯病具有显著的防治效果，防治效果均达到85％以上。

七、本发明生防菌HSSN09对西瓜和甜瓜促生的温室试验结果

待西瓜苗3-4叶期后，挑选长势一致的西瓜苗移栽到含有营养土的盆钵中，每个盆钵中移栽一颗西瓜苗，一次移栽10颗西瓜苗。

移栽完当天，用生防菌HSSN09的菌液(活菌浓度为1×10⁷CFU/ml)对西瓜苗进行灌根法处理，每颗苗灌20ml；移栽后的30天再补浇一次20ml 的生防菌HSSN09的菌液。此为实验组(西瓜蔓枯病试验的实验组)。

同时，同样的移栽方式，采用灌根法、每颗苗浇灌20ml清水，移栽后的30天再补浇一次20ml的清水。此为对照组。(西瓜蔓枯病试验的对照组)。

每天观察各组促生情况；在移栽的第20天记录每颗西瓜苗的茎粗、株高、鲜重以及生物量的增加情况。

关于生物量的增加情况和促生效果的计算公式如下：

总鲜重＝地下部鲜重+地上部鲜重；

促生效果(％)＝[(实验组的总鲜重的平均值-对照组的总鲜重的平均值) /对照组的总鲜重的平均值]×100％；

西瓜促生的温室试验结果参见表3。

表3

甜瓜温室促生实验方法与上述西瓜的相同，具体不再赘述。甜瓜促生的温室试验结果参见表4。

表4

从上述表3和表4的结果可以看出，与对照组相比，经生防菌HSSN09 处理的西瓜和甜瓜的各项生物量(茎粗、株高、鲜重)均有显著增加，且总生物量分别高出60.87％、57.69％。结果表明，本发明的生防菌HSSN09对于西瓜和甜瓜的种植有促生作用。

八、本发明的生防菌HSSN09对西瓜和甜瓜的蔓枯病防治的大田试验结果

本次大田试验在南京农业大学的牌楼实验基地进行，每个处理区域面积 24m²(长6m、宽4m)，每个处理区域种植60棵西瓜，株距约为40cm；相邻的处理区域之间设立1m宽的保护行。按常规栽培管理技术进行田间管理，每个处理区域的四周均开好排灌沟，做到能排能灌，排灌方便。

在西瓜幼苗移栽当天、第15天、第30天以及第35天，分别用生防菌 HSSN09的菌液(活菌浓度为1×10⁷CFU/ml)进行灌根处理，每株苗灌200ml；此为实验组(西瓜蔓枯病大田防治的实验组)。

同时，同样的移栽方式，在幼苗移栽当天、第15天、第30天以及第35 天，分别用清水进行灌根处理，每株苗灌溉200ml清水；此为对照组(西瓜蔓枯病大田防治的对照组)。

等对照组发病后，观察发病情况。

参见下表5，为西瓜蔓枯病防治的大田试验结果(移栽后第35天的结果)。

表5

	病害严重度(％)	防治效果(％)
			实验组	18.12±0.03	78.08
对照组	82.68±0.21	—

西瓜与甜瓜的蔓枯病防治的大田试验的操作过程完全相同。参见下表6，为西瓜蔓枯病防治的大田试验结果(移栽后第35天的结果)。

表6

	病害严重度(％)	防治效果(％)
			实验组	17.26±0.12	82.33
对照组	97.70±0.33	—

从上述表5和表6的结果可以看出，本发明的生防菌HSSN09对于西瓜和甜瓜的蔓枯病的防治效果均达到80％左右，防治效果显著。

九、本发明的生防菌HSSN09对西瓜和甜瓜促生作用的大田试验结果

本次大田试验在南京农业大学的牌楼实验基地进行，每个处理区域面积 24m²(长6m、宽4m)，每个处理区域种植60棵西瓜，株距约为4.0cm；相邻的处理区域之间设立1m宽的保护行。按常规栽培管理技术进行田间管理，每个处理区域的四周均开好排灌沟，做到能排能灌，排灌方便。

在西瓜幼苗移栽当天、第15天、第30天以及第35天，分别用生防菌 HSSN09的菌液(活菌浓度为1×10⁷CFU/ml)进行灌根处理，每株苗灌200ml；此为实验组(西瓜促生作用的实验组)。

同时，同样的移栽方式，在幼苗移栽当天、第15天、第30天以及第35 天，分别用清水进行灌根处理，每株苗灌溉200ml清水；此为对照组(西瓜促生作用的对照组)。

观察西瓜苗的变化，统计每颗西瓜苗的茎粗、株高、鲜重以及生物量的增加情况。

参见下表7，对西瓜促生作用的大田试验结果(移栽第35天的结果)。

表7

对西瓜与甜瓜的促生作用的大田试验的操作过程完全相同。参见下表8，为对西瓜促生作用的大田试验结果(移栽后第35天的结果)。

表8

从上述表7和表8的结果可以看出，本发明的生防菌HSSN09对于西瓜和甜瓜都具有显著的促生作用，各项生物量(茎粗、株高、鲜重)相比对照组均有显著增加，且总生物量均高出各自对照组的52％以上。结果表明，本发明的生防菌HSSN09对于西瓜和甜瓜的种植有促生作用。

综上所述，本发明的生防菌HSSN09，可以有效防治农作物蔓枯病，特别是可以有效防治西瓜和甜瓜的蔓枯病，并且对于西瓜和甜瓜具有促生作用；本发明的生防菌HSSN09可以应用于农作物蔓枯病的防治以及应用于西瓜和甜瓜的种植。

在获知本发明的生防菌HSSN09具有农作物蔓枯病的防治效果后，可以将常规的防治蔓枯病的杀菌剂(化学药剂)与本发明的生防菌HSSN09的菌粉进行复配获得菌药组合物。

常规的防治蔓枯病的杀菌剂有三唑类杀菌剂、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、烟酰胺类杀菌剂或二羧酰亚胺类杀菌剂。

因此，可以将上述常规的杀菌剂中的任意一种或几种的组合物与本发明的生防菌HSSN09的菌粉进行复配获得菌药组合物，本领域技术人员可以根据具体的需求和药效来进行比例的调配，经过有限次试验就可以验证。杀菌剂与本发明的生防菌HSSN09的菌粉复配的菌药组合物可以用于农作物蔓枯病的防治。

此外，在获知本发明的生防菌HSSN09具有农作物蔓枯病防治作用以及对西甜瓜的促生作用后，可以将本发明的生防菌HSSN09与农药上可接受的助剂组合获得菌药制剂，该菌药制剂可以应用于农作物蔓枯病防治或者应用于西甜瓜的种植方面。

同样的，可以将上述的菌药组合物(杀菌剂与本发明HSSN09的菌粉的组合物)与农药上可接受的助剂组合获得防治农作物蔓枯病的菌药制剂。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种生防菌，其特征在于：所述生防菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.15764。

2.一种采用如上述权利要求1的生防菌的菌药组合物，其特征在于：所述菌药组合物包含杀菌剂和权利要求1所述的生防菌的菌粉，所述杀菌剂为三唑类杀菌剂、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、烟酰胺类杀菌剂或二羧酰亚胺类杀菌剂中任意一种或几种的混合物。

3.一种菌药制剂，其特征在于：所述菌药制剂包含如权利要求1所述的生防菌和农药学上可接受的助剂。

4.一种菌药制剂，其特征在于：所述菌药制剂包含如权利要求2所述的菌药组合物和农药学上可接受的助剂。

5.如权利要求1所述的生防菌在防治农作物蔓枯病方面的应用或者在西甜瓜种植方面的应用。

6.如权利要求2所述的菌药组合物在防治农作物蔓枯病方面的应用。

7.如权利要求3所述的菌药制剂在防治农作物蔓枯病方面的应用或者在西甜瓜种植方面的应用。

8.如权利要求4所述的菌药制剂在防治农作物蔓枯病方面的应用。