CN103289906A - 一株龙胆内生真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株龙胆（Gentiana manshurica Kitag）中分离得到的内生真菌（Metarrhizium）LD421，微生物保藏号为：CGMCC NO.6454；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2012年8月17日。本发明可用于防治龙胆叶枯病，且随菌液含量增加，对龙胆叶枯病病原菌的抑菌率升高。

Description

一株龙胆内生真菌及其应用

技术领域

本发明涉及植物内生真菌，特别涉及来源于龙胆植物的内生真菌，本发明还涉及该内生真菌在防治龙胆叶枯病方面的应用，属于植物内生真菌及其代谢产物生物防治的应用领域。

背景技术

龙胆为龙胆科植物龙胆（Gentiana scabra Bge.）、条叶龙胆（Gentiana manshuricaKitag.）、三花龙胆（Gentiana triflora pall.）或坚龙胆（Gentiana rigescens Franch.）的干燥根及根茎，为我国传统常用中药。在药材上，前三种习称“关龙胆”，后一种习称“滇龙胆”。龙胆味苦性寒，归肝、胆经，具有清热燥湿，泻肝胆火的功效，临床多用于治疗黄疸性肝炎、肝胆火逆、目赤肿痛、耳聋耳鸣、消化不良、胃炎、胆道炎、膀胱炎、尿道炎、湿热黄疸、阴部肿痛、带下、湿疹瘙痒等症。现代研究证明龙胆有保肝、健胃、抗炎、抗甲亢等多种药理作用。

随着龙胆药用价值研究的不断深入，药材使用量逐年增大，野生龙胆资源遭到不可逆的破坏，龙胆产量急剧下降。栽培龙胆病害严重，其中龙胆叶枯病是较为严重的病害之一，发病率高、损失大，可引起叶片枯死，发病后期龙胆的叶片几乎全部枯死，严重影响龙胆的产量和质量。目前在龙胆栽培生产中主要采用化学防治法，但农药残留影响药材的品质和安全。由于对龙胆病害的相关研究尚不完善，对其病害的发生规律等重要问题还不清楚，尚没有实际可行的生物防治方法。

在关龙胆中，龙胆根及根茎的栽培产量大于条叶龙胆和三花龙胆，但条叶龙胆的发病率及病情指数明显低于同生长期的龙胆，其发病时期也要晚于龙胆，因此，条叶龙胆被认为是关龙胆中的抗病品种。本研究从条叶龙胆中分离、筛选获得了抗龙胆叶枯病菌的内生菌LD421，并经温室和室外生物防治研究，证明其对龙胆叶枯病菌具有显著的防治效果。

发明内容

本发明目的之一是提供一株龙胆中分离得到的新的内生真菌；

本发明目的之二是将所分离到的内生真菌进行液体发酵，根据发酵物的抗菌活性；将其应用于防治龙胆叶枯病。

本发明的上述目的通过以下实验技术方案实现：

本发明从条叶龙胆（Gentiana manshurica Kitag.）根中分离得到一株内生真菌LD421，其微生物保藏号：CGMCC NO.6454；其分类命名是：半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、绿僵菌属（Metarrhizium）真菌；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2012年8月17日。

本发明内生真菌LD421的形态学特征：将内生真菌LD421接种到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，可见其生长缓慢，28℃，暗培养16天，菌落直径达到5-6cm，菌落正面白色毯状菌丝平伏，从中心向外3/4处环绕一圈白色绒毛，生长后期会在菌落表面出现绿色粒状孢子，反面淡黄色（图1）；分生孢子小梗单生，成对或环，分生孢子生成向基的链，紧密成柱，长卵圆形或倒棍棒形，单胞（图2）。

结合菌株LD421的形态特征与《半知菌属图解》进行相对比较，初步推断该菌为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、绿僵菌属（Metarrhizium）真菌。

本发明内生真菌LD421的分子生物学鉴定结果：提取菌株LD421的基因组DNA并进行测序，测序结果为SEQ ID No.1；将测序结果提交至GeneBank数据库，通过Blast搜索相关序列，选取相似性高（一般要求大于97%，个别种大于95%）、种属地位明确且有相关文献发表的ITS序列信息，结合各菌自身的ITS序列信息，先应用CLUSTAL X1.83软件进行多序列比对，再将计算结果导入PHYLIP软件，构建系统进化树（图3），LD421与EU307915.1（Metarhizium anisopliae var.anisopliae）聚类于同一末端分支，亲缘关系极近，两者序列对比分析，其相似度为98%，但未发现目前GeneBank中存在与其基因序列和形态特征完全相同的已知菌种。初步鉴定LD421为子囊菌亚门（Ascomycotina）、核菌纲（Pyrenomycetes）、球壳菌目（Sphaerosidales）、麦角菌科（Clavicipitaceae）、绿僵菌属真菌（Metarhizium），与形态学鉴定结果一致。

本发明的主要目的是应用分离到的内生真菌LD421的发酵液，拮抗龙胆叶枯病菌（Alternaria sp.），并应用于龙胆叶枯病的防治，包括：（1）制备内生真菌LD421的发酵液；（2）考察内生真菌LD421拮抗龙胆叶枯病菌的时效、量效关系；（3）在最佳发酵时间制备发酵液，灭活后，喷施在栽培龙胆的叶片上，考察并确定发酵液对龙胆叶枯病的生防效果。

附图说明

图1为菌株LD421正面菌落形态特征；

图2为菌株LD421孢子形态特征（×400）；

图3为菌株LD421的ITS序列系统进化树；

图4为菌株LD421发酵液拮抗龙胆叶枯病致病菌，其中A为叶枯病菌单独培养（5d），B为LD421发酵液拮抗叶枯病菌（5d）；

图5为菌株LD421发酵液拮抗龙胆叶枯病菌时效关系考察结果；

图6为菌株LD421发酵液拮抗龙胆叶枯病菌量效关系曲线；

图7为龙胆温室生物防治不同处理组植株发病情况图示；

图8为龙胆田间生物防治不同处理组植株染病情况图示。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1内生真菌LD421的分离纯化及保存

样本：人工种植龙胆的根，采自黑龙江中医药大学药园，其原植物经黑龙江中医药大学都晓伟教授鉴定为龙胆科植物条叶龙胆（Gentiana manshurica Kitag.）。

1.内生真菌的分离

1.1植物样本表面消毒

将采集的样本先在流水下冲洗，去除表面的泥土和灰尘，再放入无菌操作台。样本表面自然晾干后，将样本切成约5cm长的小段，按下列程序表面消毒：

75%乙醇漂洗l min→无菌水冲洗2min→3.33%的次氯酸钠溶液浸泡3-5min（或者0.1%升汞溶液消毒1-3min）→无菌水冲洗3次（每次2min），用无菌滤纸吸干。

1.2植物样本接种培养

将1.1中处理过的样本在无菌条件下切去两端，剩余部分横切及纵切成小段，随机将小段分别种植于各种平板培养基上，每皿4-7段，置于28℃恒温培养箱中暗培养7～15天，每天观察记录。

1.3表面消毒的效果检测

1.3.1无菌水悬浮液法

将1.1中样本表面消毒的最后一次无菌水0.l mL涂于PDA平板培养基表面，置于28℃恒温培养箱暗培养7～15天，观察记录是否有真菌生长。

1.3.2组织块印迹法

随机取1.1中消毒完毕的一段样本材料，在PDA平板培养基表面滚动两圈后取出，将该培养皿置于28℃恒温培养箱暗培养7～15天，观察记录是否有真菌生长。

2.内生真菌的纯化

待各平板培养基上的样本切割边缘长出新菌丝，根据颜色、形态的差异，用三点法将不同的菌丝及时转入新配制的同种平板培养基上培养，待菌落长成后，如菌落的颜色、形态仍有不同，继续用三点法纯化，培养数日后，观察菌落的颜色、形态是否均匀，边缘是否整齐，直至得到单一的菌株。

3.内生真菌菌种保存

3.1斜面PDA培养基的制备

马铃薯（去皮）20%，葡萄糖1.5%，琼脂2%。

将马铃薯去皮，称重，切成约0.5cm³的小块，放入锅中，加入5倍量蒸馏水煮沸30min。冷却后经八层纱布过滤，滤液加水补足至原先加入量，放入葡萄糖、琼脂，搅拌煮沸，趁热过滤，滤液分装于各试管，121℃、0.1MPa、湿热灭菌30min后取出，放入操作台，倾斜放置，待其冷却后即成斜面培养基，备用。

3.2无菌液体石蜡的制备

将液体石蜡油装入三角瓶中，装量达瓶体积的1/3，塞好棉塞，外包牛皮纸，121℃、0.1MPa、湿热灭菌30min，连续灭菌2次。置105℃烘箱2小时，以除去石蜡油中的水分，使石蜡油变为透明状。置操作台，冷却至室温，备用。

3.3接种培养

将生长良好的单一菌株编号，转移到相应的斜面培养基，置于28℃恒温培养箱中暗培养5～10天，观察没有杂菌生长后，置4℃冰箱冷藏，以备后期筛选活性菌株时活化培养用。

3.4封存

将3.3中未被冷藏的菌种试管用无菌石蜡油封藏。将3.2中制备的石蜡油小心倒于菌种试管内，加入量以直立试管时高出斜面顶端约1cm为宜，试管口用橡胶塞外加封口膜密封，放入4℃冰箱保存。

实施例2龙胆内生真菌LD421的鉴定

1.菌株LD421的形态学鉴定

主要根据分离得到的内生真菌菌落特征，观察真菌的孢子及产孢结构，进行菌种的经典分类鉴定。

1.1菌落形态观察

将活化好的菌株接种于PDA平板，28℃恒温培养，记录菌株生长速度，观察菌落的特征。

1.2真菌形态观察

采用挑片观察法：在载玻片上加一滴乳酸-棉兰染液，用接种针从生长有真菌的平板中挑取带有孢子的真菌菌丝，放入载玻片上的液滴中，并且用针尖将其分散开，盖好盖玻片即得载片标本，置显微镜下观察。

乳酸-棉兰染液的制备：苯酚10g，乳酸10g，甘油20mL，甲基兰0.02g，蒸馏水10mL，将蒸馏水与苯酚混合直至溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入甲基兰，溶解即得。

1.3菌株LD421的形态学鉴定结果

真菌生长缓慢，28℃在PDA平板上培养16d，菌落直径达5-6cm，菌落正面白色毯状菌丝平伏，从中心向外3/4处环绕一圈白色绒毛，生长后期会在菌落表面出现绿色粒状孢子，反面淡黄色；分生孢子小梗单生，成对或环，分生孢子生成向基的链，紧密成柱，长卵圆形或倒棍棒形，单胞（见图1、图2）。初步确定该菌为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、绿僵菌属（Metarrhizium）真菌。

2．菌株LD421的分子生物学鉴定

2.1菌株LD421基因组DNA的提取

（1）在PDA平板上打取内生真菌菌饼，接入300mL液体培养基，28℃、120r/min摇床培养4～7天，无菌纱布过滤得菌丝，无菌水清洗2次，无菌滤纸吸干水分后置-20℃冰箱保存；

（2）取一定量菌体放入研钵，加液氮研磨至粉末状，取100～200mg粉末于1.5mL离心管；加入700μl DNA提取缓冲液，用微量移液器混匀，37℃水浴30min；

（3）11000r/min离心5min，将上清移入新的离心管中；

（4）加等体积酚-氯仿（1：1），混匀，11000r/min离心5min，将上清移入新的离心管；

（5）加等体积氯仿，混匀，11000r/min离心2min，将上清移入新的离心管；

（6）加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置2h；

（7）取放置2h的DNA提取缓冲液，11000r/min离心5min，去上清，加入70%乙醇，清洗沉淀2次，11000r/min离心2min；

（8）去上清，挥干溶剂，加入50μl TE溶液溶解沉淀即为DNA模板；

（9）DNA模板置于-20℃保存备用。

2.2菌株LD421基因组DNA的检测

2.2.1琼脂糖凝胶的制备

（1）用白胶布封住电泳槽两端作为挡板；

（2）称取1.5g琼脂糖于250mL锥形瓶中，加入100mL TAE缓冲液，置微波炉中，摇匀煮沸至澄清透明，冷却至约60℃，加入1μl浓度为10mg/mL的EB溶液，摇匀后倒于已插好梳子的电泳槽中。

（3）凝胶完全凝固后（30min以上），小心取出挡板与梳子。

（4）将凝胶放入电泳槽内，加样孔一侧靠近负极，加入适量的TAE缓冲液，使其液面恰好没过胶面约1mm深。

2.2.2电泳

取真菌DNA模板与Marker（250bp-15000bp）5μl，加入1μl LoadingBuffer溶液混合后上样于琼脂糖凝胶，恒压120V电泳30min，关闭电源。取出凝胶后，置紫外分析仪中，检测真菌DNA提取结果。

2.3菌株LD421基因组ITS序列的扩增

50μl反应体系见表1：

表1

PCR反应程序如下：

反应结束后，取扩增产物与Marker（100bp-1500bp）各5μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳，记录扩增片段长度，若片段长度在500bp-700bp，则为所需ITS目的片段。否则，调整PCR体系，重新扩增。

2.4扩增产物的序列测定与数据处理

PCR扩增产物由上海生物工程技术服务有限公司测序，测序结果为SEQ IDNo.1。将测序结果提交至GeneBank数据库，通过Blast搜索相关序列，选取相似性高、种属地位明确且有相关文献发表的ITS序列信息，结合真菌自身的ITS序列信息，先应用CLUSTAL X1.83软件进行多序列比对，再将计算结果导入PHYLIP软件，构建系统进化树，从生物进化的亲缘关系层面进一步确定内生真菌的种类。2.5菌株LD421的分子生物学鉴定结果

将测序结果与GeneBank中已知序列进行比较分析，从GeneBank数据库中获得相关种属的ITS序列信息，应用CLUSTAL X1.83软件进行多序列比对，将计算结果导入PHYLIP软件，构建系统进化树（图3）。

可看出LD421与EU307915.1（Metarhizium anisopliae var.anisopliae）聚类于同一末端分支，亲缘关系极近，将两者的序列对比分析，其相似度为98%，鉴定LD421为绿僵菌属真菌（Metarhizium），与形态学鉴定结果一致。

试验例1LD421拮抗叶枯病菌抑菌活性的时效以及量效关系考察

1.菌株LD421发酵液的制备

1.1培养基的制备：

真菌培养基：PDA固体培养基

马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

将马铃薯去皮，称重，切成约0.5cm³的小块，放入洁净的锅中，加入5倍量蒸馏水煮沸30min。冷却后经八层纱布过滤，滤液加水补足至原加入量，放入称好的葡萄糖和琼脂，煮沸同时不断搅拌，趁热过滤，滤液分装，0.1MPa、121℃条件下湿热灭菌30min。灭菌后趁热取出，在无菌操作台中，将培养基倒入直径为90mm的培养皿中，每皿大约20mL，以紫外灭菌30min，冷却凝固后即可使用。

种子培养基和发酵培养基：PD培养基

马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。

将马铃薯去皮，称重，切成约0.5cm³的小块，放入洁净的锅中，加入5倍量蒸馏水煮沸30min。冷却后经八层纱布过滤，滤液加水补足至原加入量，放入称好的葡萄糖，煮沸同时不断搅拌直至葡萄糖全部溶解，分装，0.1MPa、121℃条件下湿热灭菌30min。取出，置于无菌操作台中，待其冷却后，紫外灭菌30min，即可使用。

1.2菌株LD421的活化培养：

在无菌条件下，将4℃冰箱内石蜡油封存的龙胆内生真菌LD421接种到新制备的PDA培养基中，置于28℃恒温恒湿箱中培养5～7天。

1.3菌株LD421液体发酵液的制备：

以下步骤均在无菌操作台中进行。

待LD421菌落长到培养皿的2/3时，用无菌打孔器（直径5mm）打取菌饼接种到含100mLPD培养基的250mL锥形瓶（种子培养基）中，封好，置于恒温振荡培养箱中，28℃、120r/min摇床培养2～7天，得到种子液。

取1mL种子液接种于装有200mLPD液体培养基的500mL锥形瓶（发酵培养基）中，置于恒温振荡培养箱中，28℃、120r/min培养3～6天，所得发酵液经8层纱布过滤，滤液在0.1MPa、121℃条件下湿热灭菌30min，冷却后置于4℃冰箱中保存备用。

2.菌株LD421发酵液抗龙胆叶枯病致病菌的活性检测

本实验所用供试病原菌为龙胆叶枯病致病菌，是由黑龙江中医药大学中药资源学教研室孙海峰等从黑龙江北安栽培的龙胆（Gentiana scabra Bge.）病组织中分离纯化得到的菌株，应用柯赫氏证病法则（Koch’s postulate）证明其为龙胆叶枯病病原菌，通过对其分生孢子梗、分生孢子等的观察鉴定为Alternaria sp.。

采用生长速率法，将菌株LD421发酵液与灭菌熔化的PDA培养基混合均匀（发酵液含量为50%），制成含药平板，并用无菌水代替发酵液作为对照，每组三个平行样。待培养基凝固后，在每个培养皿中分别接入相同大小的叶枯病菌菌饼（直径为0.5cm），置于黑暗培养箱中，28℃下培养5天后，观察对照组和含药组病菌生长情况见图4。测量各含药平板中病原菌菌落的直径，计算抑菌率。

3.菌株LD421发酵液抑菌活性的时效、量效关系考察

3.1菌株LD421发酵液抑菌活性时效关系考察

3.1.1实验方法

在无菌条件下，取1mL种子液接种于装有200mL PD液体培养基的500mL锥形瓶中，共30瓶，置于恒温振荡培养箱，120r/min、28℃培养10天，每天取出3瓶，抽滤，所得滤液121℃、0.1MPa、湿热灭菌30min，灭活的菌液冷却后置于4℃冰箱保存备用。

培养1-10天的发酵液制备完成，在无菌操作台中，待PDA培养基冷却到60℃左右时与各组灭菌的发酵液混合均匀（发酵液含量为50%），倒入平皿中制成含药平板，每组3个平行，无菌水为空白对照。待培养基凝固后，在各平皿中央接种大小一致的黑斑病菌菌块（直径0.5cm），置于黑暗培养箱培养5天后，用十字交叉法测量菌落直径，按上述抑制率的计算公式计算病原菌的被抑制率。用SPSS18.0软件进行数理统计，结合抑菌率和各组数据差异显著性情况，确定最佳发酵时间；同时将抑菌率与发酵时间的关系绘成曲线，进而得到趋势回归曲线和回归方程，描述菌株LD421发酵液抑菌活性的时效关系。

3.1.2实验结果与分析

由图5看出，抑菌率与发酵时间的关系呈抛物线趋势，表2的数理统计结果为4d、5d、6d、7d、8d之间的抑菌率没有显著性差异；同时在实验中发现，LD421液体发酵第5天开始，发酵液变得粘稠而过滤困难，发酵时间越长，发酵液越粘稠，确定LD421的最佳发酵时间为4天。

表2菌株LD421代谢液拮抗龙胆叶枯病菌时效关系考察结果

注：**与对照组有极显著性差异(p<0.01)；*与对照组有显著性差异（p<0.05）；A^X：X为相同字母者属同一等级，按字母顺序依次递减。

3.2菌株LD421发酵液抑菌活性量效关系的考察

3.2.1实验方法

按3.1方法得到最佳发酵时间扩大培养的发酵液，湿热灭菌后对半稀释，再与未凝固的PDA培养基混合，按方法2步骤制成含发酵液浓度为1.5%、3%、6%、12.5%、25%、50%、100%的PDA含药培养基，以不含发酵液的PDA培养基作为对照。在恒温恒湿培养箱中，28℃暗培养5天后，取出，十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，比较抑菌效果。

3.2.2实验结果与分析

采用对半稀释法，制备不同浓度的含药培养基，生长速率法检测抑菌率，所得量效实验结果见图6，随菌液含量增加，抑菌率升高，当浓度为100%时，抑菌率达到最高值为94.69%。表3结果显示，浓度在1.5%菌液，与对照组相比无显著性差异，P值为0.241，浓度3%的菌液与对照组相比有显著差异，P值为0.030，其他各组与对照均有极显著性差异，P<0.01。而浓度超过6%的菌液，各组之间存在极显著性差异，P<0.01。室内抑菌试验证明，100%浓度LD421发酵液对龙胆叶枯病致病菌抑菌效果最为显著。

表3菌株LD421代谢液拮抗龙胆叶枯病菌量效关系考察结果

注：**与对照组有极显著性差异(p<0.01)；*与对照组有显著性差异（p<0.05）；A^X：X为相同字母者属同一等级，按字母顺序依次递减。

实验例2菌株LD421发酵液的生物防治研究

1.实验方法

1.1菌株LD421发酵液的制备

将保存的菌种活化培养，待菌落长到平皿的2/3时，切取菌饼于PD液体培养基中，28℃，120r/min摇床培养4～8d。发酵产物经纱布过滤后，灭菌，冷藏备用，喷药前取出常温放置2h。

1.2种子的处理

播种前15d左右，取种子，用赤霉素0.15g兑1L清水配制成150ppm的溶液，将种子浸泡24h捞出，用清水冲洗数次，再浸在75％的乙醇中30s，取出清水冲洗4～5次。

1.3种子的催芽

取灭菌的洁净玻璃平皿，底部放一层脱脂棉，上面放平皿大小的滤纸，开水浸湿，5分钟后倒掉多余的水分，将处理好的种子均匀摆放在平皿中，以洁净湿润的纸巾覆盖，放于恒温箱中，温度稳定在25～28℃，每天取出给予6～8h的光照，并经常喷水保持足够湿度，3～5d种子表面刚露出白色小芽时即可播种。

1.4温室育苗

播种前，将土壤用70%甲基托布津1000倍液灭菌，装入育苗盘中刮平，用压板压实，浇透水，放置过夜。第二天将催好芽的种子均匀撒在育苗盘中，播后覆土（过60目筛）1mm。一周左右出苗，出苗后遮阴避免阳光直射，除草和间苗，待幼苗长出3～5对真叶时移至育苗钵中，以提供足够的营养。

1.5温室生物防治

温室栽培一年生龙胆，选取长势一致的植株，随机分成4组，分别为空白组、对照组、阳性对照组和实验组，每组8株，每处理3个平行。第一阶段，阳性对照组喷施70%甲基托布津1000倍液，实验组喷施灭活的LD421菌液，对照组以无菌水代替，施用量为50mL/株，空白组正常浇水，每隔6天喷施一次。四个周期后进行第二阶段，除空白组以外的其他各组，喷施龙胆叶枯病菌菌液50mL/株，早晚各喷施一次，间隔6天后再次喷施叶枯病菌菌液，早晚各喷施一次。第7天开始观察发病情况并进行记录，之后每隔一周检测各项指标，计算病情指数（病情分级标准见表4）和防效。

1.6田间生物防治

试验采用三次重复，每个试验区面积为10㎡。五月中旬开始对各实验区喷施相应药剂（空白组：正常浇水；阳性对照组：喷施70%甲基托布津1000倍液；实验组：喷施灭活的LD421发酵液），每周喷施1次，连续喷施9次。6月中旬空白组开始发病时调查病级，至7月下旬共调查4次，同时计算病情指数（病情分级标准见表4）和相对防效。

表4龙胆叶枯病病情分级标准

2.实验结果

2.1温室生物防治实验结果

温室防治效果见图7，实验数据列于表5-表7。通过温室防治试验，进一步验证，菌株LD421发酵液对龙胆叶枯病具有防治作用，接种叶枯病菌后15天，发酵液防治效果显著，防效最好可达到83.77%，与70%甲基托布津1000倍液无显著差异。一个月后，防治效果降低，表明LD421菌液对叶枯病菌防治的持续时间较甲基托布津短，需继续喷施，以加强防治。

表5温室龙胆接种叶枯病病原菌后第15天发病情况（温度20-25℃）

注：**与对照组有极显著性差异(p<0.01)；70%甲托1000倍液组与LD421菌液组之间无显著差异（p=0.522>0.05）。

表6温室龙胆接种叶枯病病原菌后第21天发病情况（温度20-25℃）

注：**与对照组有极显著性差异(p<0.01)；70%甲托1000倍液组与LD421菌液组之间无显著差异（p=0.111>0.05）。

表7温室接种龙胆叶枯病病原菌后一个月发病情况（温度20-25℃）

注：**与对照组有极显著性差异(p<0.01)；70%甲托1000倍液组与LD421菌液组之间有极显著差异(p<0.01)。

2.2田间生物防治实验结果

田间防治效果见图8，实验数据见表8-表11。田间防治试验证实，LD421发酵液在龙胆叶枯病发病期（6-7月间）具有极显著的防治效果，龙胆植株的病情指数与化学药剂（70%甲托1000倍液）无显著性差异，相对防效最高可达到88.95%。

表8龙胆田间六月中旬发病情况（温度16-26℃）

注：**与对照组有极显著性差异(p<0.01)；70%甲托1000倍液组与LD421菌液组之间无显著差异（p=0.631>0.05）。

表9龙胆田间七月初发病情况（温度18-27℃）

注：**与空白组有极显著性差异(p<0.01)；70%甲托1000倍液组与LD421菌液组之间无显著差异（p=0.446>0.05）。

表10龙胆田间七月中旬发病情况（温度22-33℃）

注：**与空白组有极显著性差异(p<0.01)；70%甲托1000倍液组与LD421菌液组之间无显著差异（p=0.316>0.05）。

表11田间七月下旬发病情况（温度17-28℃）

注：**与空白组有极显著性差异(p<0.01)；70%甲托1000倍液组与LD421菌液组之间有显著差异(p=0.002<0.01)。

Claims (3)

1.一株龙胆（Gentiana manshurica Kitag）中分离得到的内生真菌（Metarrhizium）LD421，其特征在于，所述内生真菌LD421的微生物保藏号为：CGMCC NO.6454；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2012年8月17日。

2.权利要求1所述的内生真菌LD421在防治龙胆叶枯病中的应用。

3.权利要求1所述的内生真菌LD421在制备防治龙胆叶枯病的药物中的应用。

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