CN103642704B - 棉花内生真菌cef-714及其在棉花黄萎病防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物病理学，具体地涉及棉花的内生真菌CEF-714及其在棉花黄萎病防治中的应用，其保藏编号为：CGMCC？No.8304。CEF-714能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，以利于工厂化生产和推广应用。室内抑菌试验表明，CEF-714的代谢产物对棉花黄萎病菌的抑制效果达100%，其产生的挥发性代谢物对棉花黄萎病菌的抑制效果为77.5%。温室试验结果表明，25%的CEF-714培养滤液浸种对棉花黄萎病的防治效果为60.6%，对黄萎病有显著的控制作用，与生产上应用较多的枯草芽孢杆菌相比，防治效果提高34.7%左右，对作物生长无毒负作用，对人畜、昆虫和作物安全，环境友好。

Description

棉花内生真菌CEF-714及其在棉花黄萎病防治中的应用

技术领域

本发明涉及植物病理学，具体地涉及棉花的内生真菌CEF-714及其在棉花黄萎病防治中的应用。

背景技术

由大丽轮枝菌引起的黄萎病是世界性的棉花重要病害之一，自20世纪30年代传入我国以来，发生危害日趋严重，90年代以来，该病在我国各大棉区爆发成灾，年发生面积为300万公顷左右，产量损失约1亿公斤皮棉，已成为发展棉花生产的主要限制因子之一。分析病害发生危害的原因主要为，轮作倒茬难，缺乏抗病品种，缺乏具有较好防治效果的农药等。

利用有益微生物控制植物病害的发生危害具有经济、环境友好的特点。目前利用拮抗微生物防治棉花黄萎病研究较多的是枯草芽孢杆菌，作用机理是产生杆菌肽等多种抗菌物质来抑制病原菌，对黄萎病的防治具有一定的效果，但是在生产应用中存在不少问题，其中最主要的问题是防治效果较低，国内登记的枯草芽孢杆菌剂型对棉花黄萎病的防治效果在45%左右，且在不同年份效果不稳定。例如2008年和2009年，由中国农业科学院棉花研究所承担国家农药登记试验中（任务来源于农业部农药鉴定所），黑龙江强尔生化技术开发区有限公司生产的1000亿活芽孢/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对棉花黄萎病的防治效果为46.0%-52.9%，但在2010年大面积试验中防治效果只有32.7%。

生防菌通常可利用竞争、抗生、寄生和交叉保护等直接的拮抗机制抑制植物病害；同时某些生防菌还能促进植物生长,诱导植物对真菌、细菌和病毒引起的病害乃至对线虫和昆虫为害的抗性,称为诱导系统抗性(ISR)，又称获得性抗病性，是植物在一定的生物或非生物因子的刺激或作用下，产生对随后病原物侵染的抗性。诱导的系统抗病性(或免疫作用)优于化学防治和抗病育种，其优点如下:(l)免疫作用能有效地防治病毒、细菌和真菌病害。(2)免疫作用是稳定的，它决定几种不同的机制，而内吸杀菌剂往往具有单一的作用位点，容易产生新的抗药小种，因而是不稳定的。(3)免疫作用是系统的、持久的，瓜类中的免疫作用可通过嫁接，从砧木传导到接穗。(4)在感病植物中亦具有免疫能力，说明潜在的抗病基因存在于所有的植物中。(5)免疫物质，可从免疫植株的化学提取物中获得，可在田间喷施或种子处理。

植物内生真菌资源是个巨大的宝库，目前对内生真菌的研究还处于早期阶段，所研究的植物类群不过数百种，仅涉及到很小的一部分。近年来,由于内生真菌在病虫害的生物防治、医药工业上的用途和范围逐渐增大，因此有关内生真菌的研究逐渐受到重视。从棉花的内生真菌入手，分离筛选对黄萎病菌具有抑制活性的菌株，获得对该病控制效果好的生防菌株，是值得探讨的棉花黄萎病防治的新途径。

本发明的发明人经多年的研究，从健康棉花的茎杆中获得一株内生真菌，经温室苗期试验对棉花黄萎病的防治效果达60.6%，对棉花黄萎病的防治具有巨大的潜能。

发明内容

本发明的发明人为解决现有的拮抗微生物防治棉花黄萎病效果较差的问题，提出并完成本发明。

本发明从棉花的内生真菌入手，通过分离、筛选、鉴定、温室的生物测定，获得对棉花黄萎病具有显著控制作用的菌株CEF-714（Leptosphaeriasp.），其保藏编号为：CGMCCNo.8304。

该菌株是一株棉花的内生真菌，由于其对棉花不致病、无毒害作用。因此在分离时，首先要选择健康的棉株，最重要的是，在分离过程中，一定要保证样品的表面消毒彻底，确保分离到的是棉花的内生真菌。

本发明获得的生防菌株CEF-714来自棉株体内，通过用生防菌株的培养滤液来浸泡棉花种子，使棉花获得对黄萎病的抗病性。使用方法简单，适宜生产上推广应用。

该菌株经鉴定是一株小球腔菌属真菌。从棉花中可以分离到丰富的内生真菌。由于微生物的培养性状容易受培养条件的影响，传统的以形态学为基础的分类鉴定有时候会受到限制。分子生物学的发展给微生物的分类鉴定提供了新的有效措施，因此，以传统的形态学鉴定为基础，结合分子生物学的手段，对筛选到的菌株进行鉴定，最后获得目的菌株。

利用棉花的内生真菌CEF-714来控制棉花黄萎病在以下三方面产生有益效果。

1、CEF-714能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，用于生物防治的菌株必须能够在人工培养基上培养，以利于工厂化生产和推广应用。CEF-714是一株棉花的内生真菌，在土壤中广泛存在。该菌株在PDA、查氏及玉米沙粒培养基上生长良好，有利于大量繁殖和推广应用。

2、CEF-714对棉花黄萎病菌具有较好的抑制效果。在PDA培养基上，CEF-714和棉花黄萎病菌Verticilliumdahliae对扣培养时，产生的挥发性代谢物对黄萎病菌抑菌效果达到77.1%；在同样条件下采用圆盘滤膜法培养时，CEF-714产生的非挥发性代谢物对黄萎病菌抑菌效果为100%。

3、CEF-714对黄萎病控制效果好。将25%的CEF-714查彼克培养发酵液浸泡感病棉花品种冀棉11的种子（光子）12小时，将棉花种子播种于蛭石沙土制作的无底纸钵中，于棉苗一片真叶平展时接种棉花黄萎病强致病力菌株Vd080，棉苗2-3片真叶期调查黄萎病的发病情况。用25%的CEF-714发酵液处理的棉花病情指数为26.3，未经CEF-714发酵液处理的棉花病情指数为67.5，CEF-714对棉花黄萎病的控制效果为60.6%，与生产上应用较多的枯草芽孢杆菌相比，防治效果提高34.7%左右。

4、CEF-714为环境友好型生防菌株。CEF-714是一株分离自健康棉株的内生真菌，经鉴定为小球腔菌属,该属约有1351种，大部分是植物腐生菌。也有报道，小球腔菌属为银杏根部内生真菌的优势种。另有报道从药用蕨类植物蛇足石杉分离到的小球腔菌能产生石杉碱甲，是目前治疗阿尔茨海默症最具前景的生物碱类药物。本研究获得的小球腔菌属菌株CEF-714分离自棉花，土壤中广泛存在，对多数的作物不致病，解决了具有生防潜力的微生物可能转变为致病菌的问题，因此对人畜、昆虫和作物安全，环境友好。

附图说明

图1为CEF-714在PDA上的菌落形态，其中a为正面，b为反面，c为显微镜下观察到的菌丝及分生孢子；

图2CEF-714对棉花黄萎病的控制作用。a,清水浸种，播种后18天接种大丽轮枝菌强致病力菌株Vd080；b，25%的CEF-818培养滤液浸种，播种后18天接种大丽轮枝菌强致病力菌株Vd080；c，清水浸种，播种后18天用灭菌蒸馏水蘸根。

内生真菌（Leptosphaeriasp.）CEF-714，于2013年10月10日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101），其保藏编号是：CGMCCNo.8304。

具体实施方式

实施例1菌株的分离

（一）样品采集

于6-8月份，选择健康棉株，取主茎的中上部及果枝15cm。

（二）菌株的分离

先将采集到的样品（棉花茎杆）用清水洗净，去皮，置于直径为9cm的灭菌的培养皿中，用75%的酒精消毒1min。再用5.0%的次氯酸钠进行消毒60s，用灭菌水洗3次，每次时间不少于3min。然后用灭菌的吸水纸沾干表面的水分，用消毒的剪刀剪成0.4cm长的小段，置于9cm的培养皿中，25℃培养。用最后一遍清洗液为对照，检查消毒是否彻底。每天检查内生真菌的生长情况，发现有菌落长出，及时转移至直径为6cm的培养皿中培养，然后观察其菌落大小、颜色、表面特征、质

（三）CEF08111的特征

1、形态特征在PDA平板上，菌丝密集短绒毛状，菌落为正面为淡黄色，边缘不整齐，齿轮状，背面深黄色，显微镜下观察，在PDA培养基上和查比克液体培养基中，菌丝为无色透明状，锐角分支，未见分生孢子（图1）。

2、生理特征CEF-714在5-30℃条件下均能生长，最适生长温度是25℃。

依据CEF-714形态特征、生理特征和分子鉴定结果，将CEF-714归属为Leptosphaeria。

（四）培养基及培养条件

1.PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水1000ml，自然pH。称取削皮的200g马铃薯，切成小块置于锅中加水煮烂（煮沸20-30min），用纱布过滤后，滤液中加入葡萄糖和琼脂继续加热搅匀，稍冷却后再补水至1000ml，分装到锥形瓶，加塞包扎后120℃灭菌20min。25℃，黑暗培养7d。

2.查彼克（Czapek）液体培养基KNO₃，2.00g；K₂HPO₄，1.00g；KCI，0.50g；MgSO₄.7H₂O，0.50g；FeSO₄.7H₂O,0.01g；蔗糖，30.00g；加水至1000ml，分装到锥形瓶，加塞包扎后120℃灭菌20min。置摇床150rpm，25℃，黑暗条件震荡培养7d。

3.玉米粉沙土培养基将2份玉米粉和1份沙土加适量水（将培养基捏在手中不滴水）混匀，闷半小时后，放入克氏瓶中，120℃灭菌30min。25℃，黑暗培养14d。

实施例2CEF-714对棉花黄萎病菌的抑制作用

1、试验方法

对扣培养法。在直径90mm培养皿的皿盖和皿底分别倒入一定量的PDA培养基,皿盖培养基稍少些。凝固后，在皿盖中心接入5μl的青霉CEF-714菌液（查彼克液体培养7d），在皿底中心接种5μl的黄萎病病原菌菌液（查彼克液体培养7d）。放入25℃恒温培养箱中，倒置培养，以仅接种病原菌的培养皿为对照，每个处理重复4次。每天观察病原菌及青霉菌丝的生长状况，接入黄萎病菌7d后采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算青霉CEF-714挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制率。圆盘滤膜法。在直径为9cm的PDA平板上，平铺上直径略大于9cm的双层玻璃纸(硝酸纤维素膜)，在平板中央接种5μl的青霉CEF-714菌液（查彼克液体培养7d）,25℃恒温培养箱内培养7d后去玻璃纸，再在平板中央接种5μl的黄萎病菌Vd080菌液（查彼克液体培养7d）,25℃恒温培养箱内培养7d。以不含CEF-714代谢产物的PDA平板接种棉花黄萎病菌Vd080为对照。每个处理重复4次,用十字法测定菌落直径，计算抑制率。

2、试验结果

对扣培养结果表明，经CEF-714处理的棉花黄萎病菌菌落直径为1.4cm，未经CEF-714处理的菌落直径为6.1cm，CEF-714挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制率为77.1%。

圆盘滤膜法培养结果表明，经CEF-714处理的棉花黄萎病菌停止生长，菌落直径为0.0cm，未经CEF-714处理的菌落直径为6.1cm，CEF-714分泌的代谢产物对病原菌生长的抑制率为100%。

表1CEF-714对棉花黄萎病菌的抑制作用

实施例3CEF-714对棉花黄萎病的控制作用

1、试验方法

CEF-714经查彼克液体培养基25℃，黑暗条件震荡培养7d，经滤纸过滤后，获得培养滤液用以浸种。对照菌株Vd080（棉花黄萎病菌强致病力菌株）经查彼克液体培养基25℃，黑暗条件震荡培养7d，经3层纱布过滤后，获得孢子悬浮液用以接种。试验设置4个处理，分别为25%、50%和100%的CEF-714培养滤液及清水浸种。

将灭菌后的蛭石和沙子按6：4混合，做直径6cm的无底纸钵，放置45cm×35cm的塑料盘内。以感病品种冀棉11为供试品种，将经脱绒棉籽在CEF-818的培养滤液中浸泡12h后，淋干备播。每钵播种棉花种子8粒，出苗后留苗5株，每处理15个钵，每5个钵为一个重复，3次重复，随机排列。棉花播种后，将塑料盘置温室中，待棉苗长一片真叶，接种Vd080孢子悬浮液10ml，孢子浓度为1×10⁷个孢子/ml。接种方法为，将10ml孢子悬浮液倒入直径10cm的培养皿中，将纸钵从塑料盘中取出放置在培养皿中40s，待孢子悬浮液被吸干后，将纸钵放回塑料盘中。棉苗置18℃-28℃的温室中，按5级分级标准进行病害的分级调查。计算病株率、病情指数和防治效果。

2、试验结果

2012年和2013的结果表明，用25%、50%和100%的CEF-714培养滤液浸种处理的棉苗黄萎病的病情指数分别28.2和24.3，38.6和33.2、36.0和36.7，均显著低于清水对照处理（66.6和68.4），其防治效果分别为57.7%和63.5%、42.0%和51.5%、46.0%和46.3%，以25%浸种处理的防治效果最好，显著高于50%和100%浸种处理（图2，表2）。

表2CEF-714对棉花黄萎病的控制作用

注：病情指数和防治效果后面的不同字母，表示不同处理之间差异达显著水平（LSD，P＜0.05）

实施例4CEF-714对棉苗生长的影响

1、试验方法

CEF-714查彼克液体发酵液的获得及棉苗培育同实施例3。试验设置4个处理，分别为25%、50%和100%的CEF-714培养滤液及清水浸种，4个处理均不再接种棉花黄萎病菌，播种后50天，每处理随机选取25棵棉苗，测量株高、根长、棉苗鲜重和根鲜重。

2、试验结果

结果表明，除100%CEF-714浸种处理的棉苗鲜重显著低于空白对照和其他2个处理外，不同浓度的CEF-714滤液浸种处理棉苗的株高、根长、棉苗鲜重和根鲜重都与清水浸种没有显著差异，表明25%-50%的CEF-714滤液浸种对棉苗的生长发育没有负作用（表3）。

表3：CEF-714对棉苗生长的影响

注：各项测量值后面的不同字母，表示不同处理之间差异达显著水平（LSD，P＜0.05）

Claims (4)

1.内生真菌(Leptosphaeriasp.)CEF-714，其特征在于，其保藏编号为：CGMCCNo.8304。

2.权利要求1所述内生真菌CEF-714用于抑制棉花黄萎病菌的应用。

3.权利要求1所述内生真菌CEF-714用于控制棉花黄萎病的应用。

4.权利要求1所述内生真菌CEF-714的培养方法，其特征在于，在PDA培养基、查彼克液体培养基或玉米粉沙土培养基上25℃黑暗培养7天,

其中，所述玉米粉沙土培养基通过将2份玉米粉和1份沙土加水混匀至培养基捏在手中不滴水、在120℃灭菌30min制成。