CN108102929A

CN108102929A - 一种抗吡蚜酮的爪哇棒束孢及其应用

Info

Publication number: CN108102929A
Application number: CN201711431519.5A
Authority: CN
Inventors: 黄振
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN108102929B

Abstract

本发明公开了一种抗吡蚜酮的爪哇棒束孢IJNL‑N8菌株及其应用。所述菌株于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017709。本发明筛选获得了一株对稻飞虱具有高致病力的爪哇棒束孢IJNL‑N8菌株，经长期的侵染生物学和室内生物测定，结果表明该菌株对稻飞虱具有很强的杀虫效果。爪哇棒束孢IJNL‑N8是一种生防真菌，作为一种活体生物杀虫剂，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理，对环境无污染、无残留，能够解决稻飞虱防治过程中的抗药性问题与农药残留问题，适应有机食品生产的要求，在水稻害虫的生物防治中具有非常好的应用潜力。

Description

一种抗吡蚜酮的爪哇棒束孢及其应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，更具体地，涉及一种抗吡蚜酮的爪哇棒束孢及其应用。

背景技术

稻飞虱包括褐飞虱、白背飞虱等，是水稻上的重要害虫，在我国分布广泛，在南方的水稻产区褐飞虱、白背飞虱等害虫严重发生时可直接导致水稻大面积减产。在防治上多采用噻虫嗪、吡虫啉、吡蚜酮等传统的化学农药进行防治，长期大量地使用化学杀虫剂导致褐飞虱、白背飞虱等水稻害虫产生了不同程度的抗药性，同时化学农药杀死了天敌、破坏了稻田的生态环境，削弱了稻田生态环境的自我调节能力。因此，研发安全、高效、可持续控制稻飞虱的微生物农药替代化学农药具有重要的社会经济效益与生态效益。

昆虫病原真菌是一类重要的杀虫微生物，在合适的条件下可在害虫种群中大量发生、流行引起害虫的大量死亡。研究表明昆虫病原真菌对害虫的致病机制复杂，不同于现有化学农药的杀虫机制。至今仍未发现有对昆虫病原真菌产生抗药性的害虫，因而在治理害虫的抗药性问题上昆虫病原真菌的应用开发潜力巨大。

发明内容

本发明旨在克服现有稻飞虱防治技术上的不足，提供一种对稻飞虱具有高致病力，同时对吡蚜酮有较强抗药性的爪哇棒束孢。该菌是一种昆虫病原真菌，可作为一种对稻飞虱具有高致病力的活体生物杀虫剂应用于水稻害虫的防治。

本发明的目的在于提供一种抗吡蚜酮的爪哇棒束孢IJNL-N8菌株。

本发明的另一目的在于提供所述爪哇棒束孢在防治稻飞虱上的应用。

本发明的再一目的是提供一种含有爪哇棒束孢的防治稻飞虱的杀虫剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种抗吡蚜酮的爪哇棒束孢IJNL-N8菌株，该菌株于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2017709。保藏地址为中国武汉，武汉大学。

爪哇棒束孢IJNL-N8菌株是一种昆虫病原真菌，对刺吸式口器害虫的防治效果突出，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理、对环境无污染、无残留的特征，可以作为防治对化学农药产生抗药性的害虫的替代防治药物，对稻飞虱的防治效果显著。

上述爪哇棒束孢IJNL-N8菌株属丝孢目，棒束孢属。

爪哇棒束孢IJNL-N8菌株的形态学特征描述如下：在查氏培养基上菌落不规则，菌落背面中部黄白色，向外变为褚石色；菌丝薄、表面有细颗粒结构，白色，菌丝宽0.3~1.2μm，分隔，透明，光滑；分生孢子梗9～13μm，其上着生2～4个瓶梗组成的轮生体，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细，8~14×2.2～2.8μm；分生孢子近柱形或梭形，透明、光滑，5.0～8×1.4～3μm，分生孢子串生排列成长链。

上述抗吡蚜酮的爪哇棒束孢IJNL-N8对稻飞虱具有很好的防效，因此在防治稻飞虱上的应用以及在制备防治稻飞虱药物中的应用，都应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述爪哇棒束孢为爪哇棒束孢IJNL-N8菌株。

一种防治稻飞虱的杀虫剂，所述杀虫剂包含爪哇棒束孢。

优选地，所述爪哇棒束孢为爪哇棒束孢IJNL-N8菌株。

本发明相对于现有技术具有以下有益效果：

本发明筛选获得了一株对稻飞虱具有高致病力的爪哇棒束孢IJNL-N8菌株，经长期的侵染生物学和室内生物测定，表明该菌株对稻飞虱具有很强的杀虫效果。

而且，该菌株为中国本土的菌株，并非从国外引进，能适应本地的自然环境。该菌株是一种生防真菌，作为一种活体生物杀虫剂，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理，对环境无污染、无残留，能够解决稻飞虱防治过程中的抗药性问题与农药残留问题，适应有机食品生产的要求，在水稻害虫的生物防治中具有非常好的应用潜力。

另外，该菌株对吡蚜酮具有较强的抗性，因此具有制备复配杀虫剂的潜力，与低浓度的吡蚜酮混合使用可彻底控制稻飞虱，可大大减少吡蚜酮等化学农药的使用量，解决水稻飞虱防治过程中的抗药性问题与农药残留问题，同时可用于防治水稻叶蝉等水稻害虫。

附图说明

图1是生长在查氏培养基上的爪哇棒束孢IJNL-N8菌株的菌落形态图（10d）。

图2是爪哇棒束孢IJNL-N8菌株的产孢器和分生孢子形态。

图3是是被爪哇棒束孢侵染的褐飞虱及虫体上生长的菌丝图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 爪哇棒束孢的分离、鉴定

1、材料来源

（1）在广州地区的水稻上采集到被虫真菌侵染后的褐飞虱[Nilaparvata lugens(Stal)]虫尸。

（2）查氏培养基（Czapek）：蔗糖30.0g、硝酸铵（NH₄NO₃）3.0g、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1.0g、硫酸镁（MgSO₄.7H₂O）0.5g、氯化钾（KCl）0.5g、硫酸亚铁（FeSO₄）0.01g、琼脂粉20g倒入烧杯中并加入水加热溶解后使总体积为1000ml，再经高压灭菌锅灭菌（121℃，20min）。

（3）无菌操作条件：所有器皿和用具须经高压灭锅灭菌（121℃，30min），接种等操作均在超净工作台内进行。

（4）培养条件：置于25±1℃光照（14L：10D）恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到查氏培养基斜面，再转入4℃冰箱贮存。

2、菌株的分离与鉴定

（1）分离

从水稻上采集被虫生真菌感染的褐飞虱虫尸样品上分离目标菌。利用5%的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中洗涤3次，并放入查氏平板中，观察培养4～6天待形成菌落并产孢后，取单菌落转移到查氏培养基斜面，菌落编号为A、B、C、D、E、F、G、H共8个菌株，培养至产孢后再转入4℃冰箱贮存。

（2）菌株的鉴定

形态学方面的鉴定：观察菌株的培养性状、菌丝、分生孢子和产孢器等特征；菌株的分子鉴定：以ITS1和ITS4为引物，扩增菌株基因组中的rDNA-ITS序列，然后在GENBANK中进行BLAST比对分析。

形态学鉴定

将获得的8个分离株接种到查氏培养基上，于25℃条件下培养。2~3天可见到长出白色的菌丝，菌落形状不规则，菌落背面中部黄白色，向外变为褚石色；菌丝薄，表面有细颗粒结构，白色，菌丝宽0.3~1.2μm，分隔、透明、光滑；分生孢子梗9～13μm，其上着生2～4个瓶梗组成的轮生体，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细，8~14×2.2～2.8μm；分生孢子近柱形或梭形，透明、光滑，5.0～8×1.4～3μm，分生孢子串生排列成长链。见图1和图2。

菌株的分子鉴定

将所获得的8个分离株接种于Czapek培养液中，于25±1℃、200rpm条件下培养，2~3天后收获菌丝，采用CTAB法抽提菌丝的基因组DNA，以菌株的基因组DNA为模板，以ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS5 (5’-GG AAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)为引物扩增rDNA-ITS区的序列片段，以Bt2a （5’- GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’）和Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC-3’）为引物扩增β-tubulin基因的部分序列，并测序后进行BLAST比对分析。PCR反应体系（25μL）：Taq酶0.25μL、10 × buffer 2.5μL、dNTP 0.2μL、10μmol/L的Primer各1μL、ddH₂O 19.05μL、DNA模板25 ng；扩增rDNA-ITS序列的PCR扩增程序：96℃预变性2min，96℃ 1min、55℃退火1 min、72℃延伸2 min、共35个循环；最后72℃延伸8min。扩增β-tubulin基因序列的PCR扩增程序：94℃预变性3min，94℃ 1min、58℃退火1.5min、72℃延伸2 min、共35个循环；最后72℃延伸8 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，回收目标DNA片段后连接到pMD18-T载体后送样测序。

对所测序列进行BLAST比对分析表明，所检测的rDNA-ITS序列与GENBANK中Isaria javanica RCEF4687菌株的JN204422.1序列的相似性为100%，β-tubulin基因序列与GENBANK中Isaria javanica 340菌株的KY488507.1序列的相似性为100%，说明这些菌株为爪哇棒束孢菌。

综上所述，8个分离株为爪哇棒束孢菌，属丝孢目，棒束孢属。

实施例2 爪哇棒束孢优良菌株的筛选

爪哇棒束孢菌在遗传、生态及生物学等方面具有多样性，同种真菌的不同菌株对目标害虫的致病力差异显著，菌株不同，其LD₅₀、LT₅₀可相差数倍至数十倍，高产优质菌株的筛选与获得是防治害虫时取得较好防治效果的首要前提。以常用的致病力、产孢量、孢子萌发率等3个指标为菌株筛选的依据，筛选优良的爪哇棒束孢菌株。

1、供试菌株的处理

经纯化后获得的爪哇棒束孢A、B、C、D、E、F、G、H共8个分离株接种到查氏培养基平板上，于25±1℃的恒温箱（14L：10D）中培养。

2、供试昆虫与寄主植物

褐飞虱，将网室中饲养在水稻上的褐飞虱成虫接种到无虫的水稻植株上，置于25±1℃的养虫笼中（60×60×60cm），待水稻植株上的褐飞虱发育到3龄若虫时备用。水稻为常规栽培品种，华南农业大学刘永柱老师提供，试验用水稻均采用分蘖后高于30cm的盆栽苗。

3、菌落生长速率和产孢量的测定

将8个分离株分别配制成1×10⁷孢子/ml的分生孢子悬浮液，分别取1ml孢子液滴入查氏培养基上，用三角玻璃棒涂匀，待2～3d长出菌丝后用直径为13mm的打孔器取新鲜菌丝块，接种于查氏平板上，并置于培养箱中培养（L:D=14:10）。每个菌株5次重复。第10d测定菌落直径并收集分生孢子用血球计数板记数测定产孢量。具体操作如下：先用直尺测量菌落直径，用直径为5mm的灭菌打孔器在培养皿中取生长均匀的菌丝块，然后放入加有20ml0.3%吐温-80无菌水中，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，使孢子充分分散，制成孢子悬浮液，用血球记数板记数测定产孢量（孢子总数/菌落面积），结果如表1所示。

8个分离株的菌落生长速率和产孢量见表1，菌落生长直径B、D、H分离株与其它分离株之间差异显著，其中H分离株的菌落生长直径最大。生长10d后，分离株D、H的产孢量与其它分离株之间的产孢量差异显著，其中H分离株的产孢量最高。

表1 爪哇棒束孢8个分离株生长速率和产孢量（10d）

注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著（DMRT法）。

4、孢子萌发率的测定

将8个分离株分别培养10d后，用0.5%吐温-80灭菌水收集孢子并制成孢子悬浮液，将孢子液加入查氏培养液中[蔗糖30.0g、硝酸铵（NH₄NO₃）3.0g、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1.0g、硫酸镁（MgSO₄.7H₂O）0.5g、氯化钾（KCl）0.5g、硫酸亚铁（FeSO₄）0.01g倒入烧杯中并加入水加热溶解后使总体积为1000ml，再经高压灭菌锅灭菌（121℃，20min）]，180rpm/h，25±1℃培养15h后镜检。每个处理3次重复。

8个分离株中，B、H分离株与其它分离株之间的分生孢子萌发率差异显著（见表2）。其中H分离株的孢子萌发率最高。

表2 爪哇棒束孢8个分离株分生孢子萌发率（15h）

注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著（DMRT法）。

5、分离菌株对褐飞虱若虫的致病力测定

将8个分离菌株培养10d后，用含0.05%吐温水溶液收集孢子，配制成浓度为1×10⁷孢子/mL的孢子悬浮液。向带有4龄褐飞虱若虫的水稻茎和叶片喷施孢子液，对照区的水稻喷施0.05%吐温水溶液，自然晾干后放入养虫笼中。每处理为3～4钵盆栽苗（盆直径30cm，苗高40cm，1丛/盆，3~6株/丛），每丛10～20头若虫，3次重复。养虫笼置于25±1℃的空调养虫室内、光照（L:D=14:10）。每日检查并统计若虫感染死亡率，连续观察7d。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。

致病力研究结果表明，所有分离株对4龄褐飞虱的校正死亡率与对照相比差异显著。8个分离株处理区的褐飞虱在第4d开始表现出被侵染症状，从第4d褐飞虱的校正死亡率可看出B、H分离株显著高于A、C、D、E、F、G分离株，第7d时B、H分离株与其它分离株对4龄褐飞虱的校正死亡率差异显著。从总体而言，分离株H、B的致病力最强，平均为50.4%（7d），C分离株的致病力较低，为28.3%（7d）（表3）。

表3爪哇棒束孢8个分离株对4龄褐飞虱若虫的致病力

注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著（DMRT法）。

6、筛选结果

在筛选优良分离株时，致病性和产孢量的高低是重要的参考指标，孢子萌发率和菌落生长速率次之。在本发明中，菌落生长直径B、D、H分离株与其它分离株之间差异显著，其中H分离株的菌落生长直径最大，F分离株的菌落生长直径最小。B、H分离株与其它分离株之间的分生孢子萌发率差异显著。从产孢量和致病性上看，分离株B和H较为优良，具有致病性强、产孢量较高等特点（表1、表3）。

综合比较各方面的因素，H分离株为最佳菌株，将其命名爪哇棒束孢IJNL-N8菌株，并于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2017709。

实施例3 爪哇棒束孢IJNL-N8菌株对褐飞虱的致病力测定

1、生物测定是检测虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一，可为综合评价真菌的生物防治潜力提供重要的参考依据。本研究就爪哇棒束孢IJNL-N8菌株对褐飞虱的致病力进行了生物测定，以筛选出防治时所用的最佳浓度。

（1）供试昆虫与寄主植物：褐飞虱，将网室中饲养在水稻上的褐飞虱成虫接种到无虫的水稻植株上，置于25±1℃的养虫笼中（60×60×60cm），待水稻植株上的褐飞虱发育到3、4、5龄若虫时待用。水稻为常规栽培品种，华南农业大学刘永柱老师提供，试验用水稻均采用分蘖后高于30cm的盆栽苗。

（2）供试菌株的处理

经纯化后获得的爪哇棒束孢IJNL-N8菌株接种到查氏培养基平板上，于25± 1℃的恒温箱（14L:10D）中培养10天，待产孢后加入0.05%吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板将孢子浓度调整为1×10⁷孢子/ml待用。

（3）爪哇棒束孢IJNL-N8菌株对褐飞虱若虫及其处理后新羽化成虫的致病力测定

向分别带有3、4、5龄褐飞虱若虫的水稻茎和叶片喷施孢子液，对照区的水稻喷施0.05%吐温水溶液，自然晾干后放入养虫笼中。每个实验组为3～4钵苗，1丛（3×6颗苗）/钵，每丛10～20头若虫，重复3次。养虫笼置于25±1℃的空调养虫室内、光照（L:D=14:10）。每日检查并统计若虫感染死亡率，连续观察5~11d。同时，观察与统计上述经爪哇棒束孢IJNL-N8菌株处理后的3、4、5龄褐飞虱若虫新羽化成虫的死亡率。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。

2、结果如图3和表4所示

结果表明：接种后的第2～3d，各处理区的若虫开始表现出发病症状，在褐飞虱的体表可观察到有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现灰白色的孢子，随着孢子颜色的加深，褐飞虱死亡。表4为爪哇棒束孢IJNL-N8菌株处理后褐飞虱若虫第4d、7d的累计死亡率，结果表明经爪哇棒束孢IJNL-N8菌株处理后不同龄期褐飞虱的死亡率差异显著，褐飞虱4龄若虫的死亡率最高，5龄若虫的死亡率最低。爪哇棒束孢IJNL-N8菌株处理褐飞虱若虫后，除导致若虫死亡外，新羽化的成虫也会大量死亡，其中处理后4龄若虫新羽化成虫在第7天的累计校正死亡率高达74%。

表4 爪哇棒束孢IJNL-N8菌株对褐飞虱的累计校正死亡率

注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著（DMRT法）。

实施例4 爪哇棒束孢IJNL-N8菌株对白背飞虱的致病力测定

供试昆虫与寄主植物：白背飞虱，将网室中饲养在水稻上的白背飞虱成虫接种到无虫的水稻植株上，置于25±1℃的养虫笼中（60×60×60cm），待水稻植株上的白背飞虱发育到5龄若虫时待用。水稻为常规栽培品种，华南农业大学刘永柱老师提供，试验用水稻均采用分蘖后高于30cm的盆栽苗。

（1）供试菌株的处理

（2）爪哇棒束孢IJNL-N8菌株对白背飞虱若虫及其处理后新羽化成虫的致病力测定

向带有5龄褐飞虱若虫的水稻茎和叶片喷施孢子液，对照区的水稻喷施0.05%吐温水溶液，自然晾干后放入养虫笼中。每个实验组为3～4钵苗、其中1丛（3～6颗苗）/钵，每丛10～20头若虫，3次重复。养虫笼置于25±1℃的空调养虫室内、光照（L:D=14:10）。每日检查并统记若虫感染死亡率，连续观察5～11d。同时，观察与统计上述经爪哇棒束孢IJNL-N8菌株处理后的5龄褐飞虱若虫新羽化成虫的死亡率。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。

结果表明：接种后的第2～3d，处理区的若虫开始表现出发病症状，如虫体行动迟缓随后可观察到虫体上有少量白色的菌丝，几天后虫体表面出现灰白色的孢子，随着孢子颜色的加深，白背飞虱死亡。表5为爪哇棒束孢IJNL-N8菌株处理后5龄幼虫第3d、6d的累计校正死亡率，爪哇棒束孢IJNL-N8菌株处理褐飞虱若虫后，除导致若虫死亡外，新羽化的成虫也会大批死亡，处理后5龄若虫新羽化成虫在第9天的累计校正死亡率高达92%。

表5爪哇棒束孢IJNL-N8菌株对白背飞虱5龄若虫的累计校正死亡率

实施例5 爪哇棒束孢IJNL-N8菌株对吡蚜酮的抗药性测定

1、供试菌株的处理

经纯化后获得的爪哇棒束孢IJNL-N8菌株接种到查氏培养基平板上，于25± 1℃的恒温箱（14:10D）中培养10天后，用不同浓度吡蚜酮的无菌水收集孢子并制成悬液，用载玻片萌发法试验。将孢子悬液滴在无菌载玻片上，置于底部铺有滤纸的培养皿内，在皿内滴加3～4滴无菌水保湿（100，RH），培养12h、14h、16h后镜检，计算孢子萌发率（孢子萌发率 % =萌发的孢子数/总孢子数×100 %）。每个处理3次重复。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。

2、研究结果表明，0.5和0.1倍常规使用剂量的吡蚜酮对菌株的孢子萌发率无影响（表6），爪哇棒束孢IJNL-N8菌株的孢子萌发率高达90%以上；在12h和14h常规使用剂量的吡蚜酮可显著降低菌株的孢子萌发率，但在16h以后不同浓度的吡蚜酮对菌株的孢子萌发率影响差异不显著，爪哇棒束孢IJNL-N8菌株的孢子萌发率高达94%以上。

表6 爪哇棒束孢IJNL-N8菌株在不同浓度吡蚜酮溶液中的孢子萌发率

注：表中同行数字后字母相同者表示差异不显著（DMRT法）。吡蚜酮(1x、0.5x和0.1x)分别表示吡蚜酮的使用剂量为常规剂量、0.5和0.1倍的剂量。

本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗吡蚜酮的爪哇棒束孢（Isaria javanica）IJNL-N8菌株，其特征在于，该菌株于2017年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2017709。

2.如权利要1所述抗吡蚜酮的爪哇棒束孢IJNL-N8菌株，其特征在于，所述爪哇棒束孢IJNL-N8菌株属丝孢目，棒束孢属。

3.如权利要求1所述抗吡蚜酮的爪哇棒束孢IJNL-N8菌株，其特征在于，所述爪哇棒束孢IJNL-N8菌株的形态学特征描述如下：

在查氏培养基上菌落不规则，菌落背面中部黄白色，向外变为褚石色；菌丝薄，表面有细颗粒结构，白色，菌丝宽0.3~1.2μm，分隔，透明，光滑；分生孢子梗9～13μm，其上着生2～4个瓶梗组成的轮生体，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细，8~14×2.2～2.8μm；分生孢子近柱形或梭形，透明、光滑，5.0～8×1.4～3μm，分生孢子串生排列成长链。

4.爪哇棒束孢在防治稻飞虱上的应用。

5.爪哇棒束孢在制备防治稻飞虱药物中的应用。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述爪哇棒束孢为权利要求1所述的爪哇棒束孢IJNL-N8菌株。

7.一种防治稻飞虱的杀虫剂，其特征在于，所述杀虫剂包含爪哇棒束孢。

8.根据权利要求7所述的杀虫剂，其特征在于，所述爪哇棒束孢为权利要求1所述的爪哇棒束孢IJNL-N8菌株。