CN113684136B - 一种广谱杀虫性的球孢白僵菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种广谱杀虫性的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BbPs01菌株及其应用，属于生物农药技术领域。菌株BbPs01已在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)保藏，保藏日期2021年2月4日，保藏号GDMCC NO:61494。菌株BbPs01对鞘翅目的黄曲条跳甲、半翅目的菜缢管蚜、柑橘木虱与烟粉虱、膜翅目的红火蚁等害虫具有高活性；该菌株具有作为真菌杀虫剂的潜力，作为一种生物活体农药，具有对环境无污染，对人畜无毒性的特征，适用于有机农产品生产需求。

Description

一种广谱杀虫性的球孢白僵菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种广谱杀虫性球孢白僵菌Beauveria bassiana菌株及其应用，属于生物农药技术领域。
背景技术
球孢白僵菌是一种广泛应用的昆虫病原真菌，在害虫生物防治中发挥重要作用。美国、欧洲、巴西、印度等境外许多国家与地区都有白僵菌杀虫剂登记与应用。目前，我国有25种白僵菌杀虫剂产品登记，用于防治蝗虫、蛴螬、韭蛆、蓟马、茶小绿叶蝉、松毛虫、小菜蛾、玉米螟、稻纵卷叶螟、二化螟等害虫，但每种产品的应用范围有限(http://www.chinapesticide.org.cn/)。球孢白僵菌的寄主昆虫有上千种，但其致病性分化，不同菌株的寄主范围差异很大，大多数菌株只能防治少数特定害虫，因此，筛选对多种害虫有效的广谱杀虫型菌株，对扩大白僵菌的应用范围、提高经济价值具有重要意义。
黄曲条跳甲Phyllotreta striolata(Fabricius)，隶属鞘翅目Coleoptera叶甲科Chrysomelidae，是我国十字花科作物的重要害虫。其幼虫为害作物的根部，成虫取食作物地上部，严重影响作物生长与蔬菜产品品质。
菜缢管蚜Lipaphis erysimi(Kaltebach)，属半翅目Hemiptera蚜科Aphididae害虫，主要为害十字花科作物，不仅引起产量和品质降低，而且还传播病毒。
烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是半翅目Hemiptera小粉虱科Aleyrodidae重大害虫，其B与Q生物型是入侵性超级害虫，广泛分布于90多个国家和地区。其寄主范围广，多达900种以上。烟粉虱对蔬菜除以刺吸汁液造成直接为害以及分泌蜜露引起霉污病外，最主要是传播植物双生病毒病，造成更大损失。
柑橘木虱Diaphorina citri(Kuwayama)属半翅目木虱科Psyllidae害虫，是柑橘黄龙病(HLB)的传播虫媒，HLB对柑橘造成毁灭性危害，控制柑橘木虱对于减少HLB的传播至关重要。
红火蚁Solenopsis invicta Buren是膜翅目Hymenoptera蚁科Formicidae重大害虫，在地表筑土巢生活，作为“地表最强入侵物种”之一，红火蚁极具杀伤力，危害巨大。最新数据显示，红火蚁已入侵我国12个省份435个县市区；近5年来，新增的红火蚁发生县级行政区多达191个。红火蚁习性凶猛、繁殖力强、食性复杂、竞争力强，在新入侵地区易形成高密度的种群，对农林业生产、人体健康、公共安全和生态环境等均可能造成严重危害。
黄曲条跳甲、菜缢管蚜、烟粉虱、柑橘木虱及红火蚁等害虫都是农业生产上重要害虫。它们严重困扰相关行业的发展，在其防治过程中过度使用化学农药也引发“3R”问题的产生，而以天敌昆虫和细菌、真菌、病毒等昆虫病原微生物为主的生物防治将有助于这些重要害虫的绿色与可持续治理。
黄曲条跳甲和红火蚁作为土壤和植物表面双栖害虫，特别适合于真菌杀虫剂防治；而菜缢管蚜、烟粉虱与柑橘木虱等半翅目吸汁性害虫，不适宜用细菌和病毒杀虫剂进行防控。因此，真菌杀虫剂可能是防治上述害虫最好微生物杀虫剂。
近年来国内外对黄曲条跳甲的生物防治取得了一些研究成果，包括昆虫病原线虫、病原细菌、虫生真菌，以及植物源农药的开发利用等，虫生真菌为重要的研究方向。据报道，玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea、金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae、淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinum、球孢白僵菌Beauveria bassiana等可侵染黄曲条跳甲，并已有一些相关发明专利公开：专利申请号CN200510033568.4公开了一种球孢白僵菌及其应用，该菌株对小猿叶甲虫、黄曲条跳甲有效；专利申请号CN201510084020.6公开了一种金龟子绿僵菌CQMa421菌株，对黄曲条跳甲或小菜蛾的防治效果突出；专利申请号CN202011457358.9公开了一种淡紫紫孢菌菌株及其在防治黄曲条跳甲方面的应用；专利申请号CN202010971228.0公开了一种爪哇棒束孢菌株及其在防治黄曲条跳甲方面的应用。
目前，一些研究者致力于蚜虫生物防治方面的研究，并取得一定的成效，但是应用球孢白僵菌防治蔬菜蚜虫的研究还比较少。已有一些相关发明专利公开：专利申请号CN201911256441.7公开的虫生真菌蜡蚧菌与烟碱的复配杀虫剂，对害虫粉虱和蚜虫有很好的防治效果。申请号CN200810089529.X公开了一种球孢白僵菌HFW－05菌株及其应用，田间防治烟粉虱、小菜蛾、蚜虫等效果达70％以上。
防治烟粉虱的真菌杀虫剂已有一些相关发明专利公开：专利申请号CN201910223909.6公开了一种球孢白僵菌菌株SB009及其应用，对烟粉虱具有高活性。申请号CN201510444821.9公开了一株淡紫拟青霉PlTS01菌株，对B型烟粉虱2龄若虫的半致死浓度LC50为1.66×106孢子/mL，半致死时间LT50为4.35d(在1.0×107孢子/mL剂量下)。申请号CN201510444569.1公开了一株金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02菌株，对2龄烟粉虱的致死中浓度LC50为5.15×106孢子/mL(处理后7天)，致死中时间LT50为6.40天(107孢子/mL)。申请号CN201410317110.0公开了一种基因重组玫烟色棒孢霉菌If01 GM菌株，其LC50值比野生菌株低约50％，LT50值短1～2天。申请号CN201811505030.2公开了一种爪哇虫草GZQ-1菌株，对烟粉虱和柑橘木虱具有较强的活性。申请号CN201210449949.0公开的玫烟色棒孢霉菌株对2龄若虫的半致死浓度(LC50)为7.5×105分生孢子/mL(接种后第4天)，对B型烟粉虱的田间防治效果达到90％以上，与化学杀虫剂螺虫乙酯相当。申请号CN201510444910.3公开了一株刀孢轮枝菌LpTS01菌株，对B型烟粉虱高度致病，对其2龄若虫的半致死浓度(LC50)为0.36×106分生孢子/mL(接种后第6天)，致死中时(LT50)为4.23d(浓度10×106分生孢子/mL)
已报道的柑橘木虱昆虫病原真菌有：玫烟色棒束孢、球孢白僵菌、金龟子绿僵菌，以及宛氏拟青霉Paecilomyces varioti Bainier等(Saldarriaga Ausique et al.,2017；张艳璇等，2013；代晓彦等，2017；宋晓兵等，2018)。已有一些相关发明专利公开：申请号CN201310341306.9公开了一种蜡蚧菌属真菌新种ZJLSP07菌株，对柑橘木虱的活性高。申请号CN201310117537.1公开了一株对柑橘木虱具强致病力的淡紫拟青霉ZJPL08菌株。申请号CN201510736571.6公开了一株对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉菌GZMS-11菌株。申请号CN202110243723.4公开了一株对柑橘木虱具强致病力的枝状枝孢霉菌株。申请号公开了CN201310167685.4一株刀孢轮枝菌ZJLP09菌株，防治柑橘木虱的效果显著。申请号CN201610142231.5公开了一种对柑橘木虱高致病力玫烟色棒束孢菌株。申请号CN201811505030.2公开了一种爪哇虫草，对柑橘木虱低龄若虫有很高的防治效果。
近来国内外对红火蚁的生物防治进行了大量研究，研究包括利用天敌昆虫、捕食性螨类、寄生性线虫和病原微生物进行防治。有多种虫生真菌可侵染红火蚁，如玫烟色棒孢霉、黄绿绿僵菌Metarhizium flavoviride、金龟子绿僵菌和球孢白僵菌、淡紫紫孢菌、爪哇棒束孢菌等，并已有一些相关发明专利公开：申请号CN201910398036.2公开了一种曲霉属真菌菌株，对红火蚁有效。申请号CN201710362077.7公开了一株对红火蚁效果良好的球孢白僵菌BbL25菌株。专利申请号201610656107.0公开了一株抗紫外线的高毒力金龟子绿僵菌诱变菌株MaUV 1及其应用，该菌株对抗药性小菜蛾、红火蚁等害虫具有较强的侵染杀虫效果。专利申请号201510103305.X公开了一种防治红火蚁的微生物杀虫剂组合物，白僵菌和噻虫啉复配有显著的增效作用。专利申请号201310721119.3公开了一种玫烟色棒束孢与阿维菌素油悬浮剂及其制备方法和应用，该悬浮剂主要用于小菜蛾和红火蚁等害虫的防治。专利申请号201120139109.5公开了一种诱集红火蚁感染虫生真菌的装置，防治红火蚁效果很好。专利申请号200810029158.6公开了一种爪哇拟青霉菌株，对粉虱、红火蚁、斜纹夜蛾、蚜虫、小菜蛾等害虫有效。专利申请号200810029745.5公开了一种爪哇拟青霉与印楝素的复配杀虫剂，对红火蚁、斜纹夜蛾、蚜虫、粉虱和小菜蛾等害虫有防治效果。
回顾技术研究与应用进展说明，目前，缺乏广谱性球孢白僵菌菌株，没有同时对鞘翅目、半翅目、膜翅目害虫，如黄曲条跳甲、菜缢管蚜、烟粉虱、红火蚁及柑橘木虱都具有高活性的杀虫真菌菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种广谱杀虫性球孢白僵菌菌株及其在防治鞘翅目的黄曲条跳甲，半翅目的菜缢管蚜、烟粉虱、柑橘木虱，以及膜翅目的红火蚁等害虫方面的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：本发明提供了一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株BbPs01，所述菌株已在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)保藏，保藏日期2021年2月4日，保藏号GDMCC NO:61494。
所述球孢白僵菌菌株BbPs01系从广东省广州市华南农业大学启林农场菜心地的黄曲条跳甲虫僵上分离纯化获得，通过生物活性测定、菌种生物学鉴定，明确所述菌株是对黄曲条跳甲、菜缢管蚜、烟粉虱、红火蚁及柑橘木虱等高效的新型虫生真菌菌株，所述菌株分类地位属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草菌科(Cordycipitaceae)、白僵菌属(Beauveria)。
所述球孢白僵菌BbPs01菌株在PAD(马铃薯培养基)平板上菌落形态如图1所示，菌落圆形，具同心轮环，培养初期多呈白色，后逐渐变为乳白色，菌丝呈白色绒毛状，后期菌落中部变为粉末状，菌落背面为淡黄色；培养12天后菌落直径为(58.5±0.5)mm。
所述球孢白僵菌BbPs01菌株的显微镜结构：如图2所示，在光学显微镜下，菌丝有隔、有分枝、透明，宽度为(1.58±0.26)μm；产孢细胞轮生或单生，分生孢子梗不分枝，分生孢子梗顶端膨大，分生孢子浓密地生长；在分生孢子梗上，分生孢子球形或近球形、单胞、无色，直径(2.43±0.19)μm。
本申请发明人还对所述菌株进行了分子鉴定，其ITS1-5.8S-ITS4 rDNA的PCR扩增序列长533bp，如SEQ ID NO:1所示。经NCBI数据库比对，结果表明，所述菌株序列与多个球孢白僵菌菌株序列高度相似。其系统发育进化树如图3所示，本发明分离到的菌株与所有球孢白僵菌聚集在同一个分支上，其亲缘关系为高度同源。
另外，本发明还提供所述球孢白僵菌菌株BbPs01在防治鞘翅目、半翅目以及膜翅目害虫方面的应用。
优选地，以所述球孢白僵菌菌株BbPs01的分生孢子为有效成份直接或加工成制剂用于防治鞘翅目、半翅目及膜翅目害虫。
优选地，所述鞘翅目害虫为黄曲条跳甲，所述半翅目害虫为菜缢管蚜、柑橘木虱和烟粉虱，所述膜翅目害虫为红火蚁。
本发明提供所述球孢白僵菌菌株BbPs01对黄曲条跳甲、菜缢管蚜、烟粉虱、柑橘木虱及红火蚁的活性明显高于供试的其他菌株，当处理浓度为1×107spores/mL时，BbPs01菌株对上述害虫的在处理后7d的累计校正死亡率大于70％，具体详见表1。
所述球孢白僵菌BbPs01菌株对黄曲条跳甲具有高活性，当处理浓度大于5×106spores/mL时，处理后6d，黄曲条跳甲成虫的累计校正死亡率达到100％，具体详见表2。所述球孢白僵菌菌株BbPs0对黄曲条跳甲成虫在处理后5d和9d的致死中浓度(LC50)分别为3.52×106spores/mL和1.08×105spores/mL。当处理浓度为1×106spores/mL和1×108spores/mL时，致死中时间(LT50)分别为6.14d和3.80d，具体详见表3和表4。本发明还对所述球孢白僵菌菌株BbPs01侵染黄曲条跳甲成虫的过程进行了观察(如图4所示)，该菌株以1×108spores/mL分生孢子悬浮液浸渍法处理黄曲条跳甲成虫在处理后2-3d，跳甲即开始发病，行动变得迟缓，并且取食减少；4d开始大量死亡，5d，在体视显微镜下，可观察到死虫关节处有少量白色绒毛状菌丝；6d，死虫被大量白色菌覆盖并且有少量粉状孢子；7d死虫被粉状孢子包裹。
所述球孢白僵菌菌株BbPs01在黄曲条跳甲的幼虫同样具有高活性：浸渍法处理黄曲条跳甲幼虫(三龄刚蜕皮幼虫)7和10d后，对黄曲条跳甲三龄幼虫的LC50分别为9.92×106spores/mL和4.59×105spores/mL；在1×108spores/mL和1×106spores/mL处理浓度下，LT50分别为5.87d和9.46d。具体详见表5和表6。本发明还对所述球孢白僵菌菌株BbPs01侵染黄曲条跳甲幼虫的过程进行了观察(如图4所示)，1×108spores/mL浓度时，三龄幼虫在处理后4-5d，跳甲即开始发病，行动变得迟缓，并且取食减少，5d开始死亡；1×108spores/mL处理后5d，在体视显微镜显下，可观察到死虫有少量白色绒毛状菌丝；并且部分死虫体色泛红(但不会像细菌感染用毛笔轻轻触动便溃烂)，用解剖针解剖后在显微镜下观察到，幼虫内脏组织被菌丝侵染；7d，死虫被大量白色菌覆盖并且有少量粉状孢子；9-10d死虫完全被粉状孢子包裹；11d调查结束后，将仍存活的幼虫解剖，在显微镜下观察到血腔中有芽生孢子和少量菌丝。
球孢白僵菌BbPs01菌株对菜缢管蚜在处理后5d和7d的LC50分别为7.59×105和3.08×104spores/mL；1×108和1×106spores/mL浓度时，对菜缢管蚜的LT50分别为3.32d和4.89d，详细见表7与表8。
球孢白僵菌BbPs01菌株对烟粉虱在处理后7d和10d的LC50分别为9.75×106和8.89×105spores/mL；1×108和1×106spores/mL浓度时，对烟粉虱的LT50分别为4.53d和9.77d，详细见表9与表10。
球孢白僵菌BbPs01菌株对柑橘木虱在处理后4d和5d的LC50分别为6.89×106和5.56×102spores/mL；1×108和1×106spores/mL浓度时，LT50分别为3.68d和4.25d，详细见表11与表12。
球孢白僵菌BbPs01菌株对红火蚁在处理后3d和4d的LC50分别为2.90×105和2.17×102spores/mL；1×108和1×106spores/mL浓度时，LT50分别为2.36d和3.05d，详细见表13与表14。
本发明还对球孢白僵菌菌株BbPs01侵染菜缢管蚜、烟粉虱、柑橘木虱和红火蚁的过程进行了观察(如图5-8所示)。供试昆虫死亡后，0.5d体表开始长出绒毛状菌丝，1d开始长少量孢子，3d左右被大量孢子覆盖。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的球孢白僵菌菌株BbPs01对黄曲条跳甲的侵染率高、致病力强，并且对菜缢管蚜、烟粉虱、红火蚁、柑橘木虱等害虫也具有高致病力；本发明提供的球孢白僵菌菌株BbPs01是一种昆虫病原真菌，作为一种生物活体农药，具有对环境无污染，对人畜无毒性的特征，适用于有机农产品生产需求。
附图说明
图1为本发明提供的球孢白僵菌菌株BbPs01菌落形态(马铃薯培养基，25℃，12天)；其中，图1a为菌落正面，图1b为菌落背面；
图2为本发明提供的球孢白僵菌菌株BbPs01的产孢结构和分生孢子；
图3为本发明提供的球孢白僵菌菌株BbPs01的rDNA-ITS系统发育树；
图4为本发明提供的球孢白僵菌菌株BbPs01侵染黄曲条跳甲形态特征；其中，图4a为菌株BbPs01侵染黄曲条跳甲成虫早期图，图4b为菌株BbPs01侵染黄曲条跳甲成虫后期图，图4c为菌株BbPs01侵染黄曲条跳甲幼虫早期图，图4d为菌株BbPs01侵染黄曲条跳甲幼虫后期图；
图5为本发明提供的球孢白僵菌菌株BbPs01侵染菜缢管蚜形态特征；其中，图5a为菌株BbPs01侵染菜缢管蚜早期图，图5b为菌株侵染菜缢管蚜后期图；
图6为本发明提供的球孢白僵菌菌株BbPs01侵染烟粉虱若虫形态特征；图6a为菌株BbPs01侵染烟粉虱早期图，图6b为菌株BbPs01侵染烟粉虱后期图；
图7为本发明提供的球孢白僵菌菌株BbPs01侵染柑橘木虱形态特征；其中，图7a为菌株BbPs01侵染柑橘木虱早期图，图7b为菌株BbPs01侵染柑橘木虱后期图；
图8为本发明提供的球孢白僵菌菌株BbPs01侵染红火蚁形态特征；其中，图8a为菌株BbPs01侵染红火蚁早期图(节间处长菌丝)，图8b为菌株BbPs01侵染红火蚁后期图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：球孢白僵菌BbPs01菌株的分离纯化及鉴定
(1)菌株分离纯化：将从广东省广州市华南农业大学启林农场菜心地采集的黄曲条跳甲僵虫，用消毒后的接种针挑取僵虫上的菌层，接种于PDA平板上，放入25℃培养箱中培养，长出菌落后按常规方法进行单孢分离、培养获得纯系，转移到PDA斜面上培养7天，在4℃冰箱保藏。以上操作均在超净工作台上无菌环境进行。
(2)菌株形态学鉴定：将分离纯化的球孢白僵菌菌株在直径90mm的PDA培养基上于25℃条件下培养，4-5天挑取白色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态，10-12天后挑取成熟分生孢子制片观察分生孢子的形态和大小，7-15天左右观察记录菌落形态特征。
菌落形态如图1所示，菌落圆形，具同心轮环，菌丝呈白色绒毛状，后期菌落中部变为粉末状，背面为淡黄色；菌落培养初期多呈白色，后逐渐变为乳白色。培养12天后，菌落直径为(58.5±0.5)mm(图1)。在光学显微镜下，菌丝有隔、有分枝、透明，宽度为(1.58±0.26)μm；产孢细胞轮生或单生，分生孢子梗不分枝，分生孢子梗顶端膨大，分生孢子浓密地生长；分生孢子球形或近球形、单胞、无色，直径(2.43±0.19)μm(图2)。
(3)菌株分子生物学鉴定：提取该菌株的总DNA，以提取的DNA为模板，以真菌ITS1F和ITS4R通用引物扩增ITS区段，测序、对比，并构建发育树。球孢白僵菌ITS1-5.8S-ITS4rDNA基因序列长度为533bp，其基因序列，如SEQ ID NO:1所示。
在NCBI数据库比对ITS1-5.8S-ITS4rDNA基因序列，对比结果表明，所述菌株序列与多个球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株序列高度相似。将该菌株与与球孢白僵菌、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、一些近似菌株，及以玫烟色棒束孢、淡紫紫孢菌和金龟子绿僵菌菌株为外群，构建其系统发育进化树；结果如图3所示，本发明分离到的菌株与所有球孢白僵菌聚集在同一个分支上，其亲缘关系为高度同源。
通过分子鉴定结果，并结合上述形态学鉴定结果，确定该菌株为球孢白僵菌，并将该菌株命名为BbPs01。
实施例2：球孢白僵菌BbPs01菌株与其他菌株的活性比较
(1)菌株培养
取供试菌株的斜面菌种，刮取少量分生孢子接种至PDA平板上，25℃培养箱中培养14d左右，刮取菌落表层分生孢子备用。
(2)分子孢子悬浮液配制
将步骤(1)刮取的分生孢子置于离心管中，加入0.02％的吐温-80溶液，振荡摇匀，用血球计数板测量孢子浓度，配制成1×107spores/mL的孢子悬浮液，备用。
(3)生物活性测定
在实验室内的条件下，采用浸渍法，用供试菌株的孢子悬浮处理供试昆虫，以0.02％的吐温-80溶液处理作为对照，每个处理20头昆虫，3次生物学重复。处理后放入饲养盒里，用新鲜寄主植物饲养(红火蚁在蜂蜜饲养)，适时更换饲料，25℃，L：D＝14：12，RH>85％条件下饲养，1-9d调查昆虫死亡率，计算校正死亡率：
校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100％
结果如表1所示，球孢白僵菌BbPs01菌株对五种供试害虫的活性明显高于其他供试菌株，害虫在处理后7d的校正死亡率大于70％。
表1供试真菌菌株对几种害虫的活性(处理后7d的校正死亡率，％)
注：处理剂量为1×107spores/mL，CK为0.02％吐温80溶液，黄曲条跳甲为成虫，菜缢管蚜、烟粉虱和柑橘木虱均为3龄若虫，红火蚁为工蚁，处理虫数为20头，重复3次。
实施例3：球孢白僵菌BbPs01菌株对黄曲条跳甲成虫的毒力测定
应用上述实施例2中所生产的分生孢子，在实验室内的条件下，将不同浓度孢子浸渍法处理黄曲条跳甲成虫，以0.02％的吐温-80溶液处理作为对照，每个处理20头，3次生物学重复。处理后放入饲养盒里，每个饲养盒添加新鲜萝卜块，三天更换一次；25℃，L：D＝14：12，RH>85％条件下饲养，每天调查黄曲条跳甲成虫的死亡率，用SPSS软件分析计算校正死亡率、致死中浓度(LC50)和致死中时(LT50)。
生物测定同时，对球孢白僵菌BbPs01菌株侵染黄曲条跳甲成虫的过程进行观察，在体视显微镜下观察黄曲条跳甲的形态变态。
累积死亡率(％)＝调查时累积死亡虫数/处理前虫数×100％
校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100％
表2球孢白僵菌BbPs01菌株对黄曲条跳甲成虫的活性
表3球孢白僵菌BbPs01菌株对黄曲条跳甲成虫的LC50值
表4球孢白僵菌BbPs01菌株对黄曲条跳甲成虫的LT50值
结果表明，球孢白僵菌菌株对黄曲条跳甲成虫活性很高，当处理浓度≥5×106spores/mL时，处理后6d的累计校正死亡率都达到100％(详见表2)。
在处理后5和9d的致死中浓度(LC50)分别为3.52×106和1.08×105spores/mL；在观察时间内，随着时间增加LC50值减小(详见表3)。
分生孢子浓度1×106和1×108spores/mL时，致死中时间(LT50)分别为6.14d和3.80d，分生孢子浓度越高LT50值越小(详见表4)。
球孢白僵菌菌株BbPs01侵染黄曲条跳甲成虫的过程如图4所示，1×108spores/mL分生孢子悬浮液处理2-3d，跳甲即开始发病，行动变得迟缓，并且取食减少；4d开始大量死亡，5d，在体视显微镜显下，可观察到死虫关节处有少量白色绒毛状菌丝；6d，死虫被大量白色菌丝覆盖并且有少量粉状孢子；7d死虫被粉状孢子包裹。
实施例4：球孢白僵菌BbPs01菌株对黄曲条跳甲幼虫的毒力测定
应用上述实施例2中所生产的分生孢子，在实验室内条件下，将不同浓度孢子浸渍法处理黄曲条跳甲三龄幼虫(刚蜕皮幼虫)，以0.02％的吐温-80溶液处理作为对照，每个处理20头，3次生物学重复。处理后放入饲养盒里，每个饲养盒添加新鲜萝卜块，三天添加一次。25℃，L：D＝14：12，RH>85％条件下饲养，调查黄曲条跳甲的死亡率，用SPSS软件分析计算校正死亡率、致死中浓度(LC50)和致死中时(LT50)。
生物测定同时，对球孢白僵菌BbPs01菌株侵染黄曲条跳甲的过程进行观察，在体视显微镜下观察黄曲条跳甲的形态变化。
表5球孢白僵菌BbPs01菌株对黄曲条跳甲三龄幼虫的活性
表6球孢白僵菌BbPs01菌株对黄曲条跳甲三龄幼虫LC50和LT50值
结果表明，球孢白僵菌BbPs01菌株对黄曲条跳甲幼虫的防治效果良好，1×108和5×107spores/mL浓度时，处理后10d，黄曲条跳甲幼虫的累计校正死亡率达到100％(详见表5)。
该菌株在处理后7和10d，对黄曲条跳甲三龄幼虫的LC50分别为9.92×106和4.59×105spores/mL。1×108和1×106spores/mL浓度时，致死中时间LT50分别为5.87d和9.46d(详见表6)。
本发明还对球孢白僵菌菌株BbPs01侵染黄曲条跳甲幼虫进行了观察(如图4所示)，1×108spores/mL浓度时，三龄幼虫在处理后4-5d即开始发病，行动变得迟缓，并且取食减少；处理后5d，在体视显微镜显下，可观察到死虫有少量白色绒毛状菌丝；并且部分死虫体色泛红(但不会像细菌感染用毛笔轻轻触动便溃烂)，用解剖针解剖后在显微镜下观察到，幼虫内脏组织被菌丝侵染；7d，死虫被大量白色菌丝覆盖并且有少量粉状孢子；第9-10d死虫完全被被粉状孢子包裹。11d调查结束后，将仍存活的幼虫解剖，在显微镜下观察到血腔中有芽生孢子和少量菌丝。
实施例5：球孢白僵菌BbPs01菌株对菜缢管蚜的毒力测定
应用上述实施例2中所生产的分生孢子，在实验室内的条件下，将不同浓度孢子浸渍法处理菜缢管蚜二龄若虫，以0.02％的吐温-80溶液处理作为对照，每个处理20头以上，3次生物学重复。处理后放入饲养盒的菜心叶片上，叶背向上(茎部用无菌水浸湿的棉花包裹)，适时更换；25℃，L：D＝14：12，RH>85％条件下饲养，1-9d调查菜缢管蚜的死亡率，用SPSS软件分析计算校正死亡率、致死中浓度(LC50)和致死中时(LT50)。
生物测定同时，对球孢白僵菌BbPs01菌株侵染菜缢管蚜的过程进行观察，在体视显微镜下观察菜缢管蚜的形态变化。
实验结果：
结果表明，球孢白僵菌BbPs01菌株对菜缢管蚜活性具有明显的剂量时间依赖关系，当处理剂量为1×107或1×108spores/mL浓度时，菜缢管蚜在处理后6d的累计校正死亡率达到100％(详见表7)。该菌株对菜缢管蚜在处理后5d和7d的LC50分别为7.59×105和3.08×104spores/mL。当处理剂量为1×108spores/mL和1×106spores/mL时，该菌株对菜缢管蚜致死中时(LT50)分别为3.32d和4.89d(详见表8)。
菌株BbPs01引起菜缢管蚜死亡后0.5d体表开始长出绒毛状菌丝，1d开始长少量孢子，3d左右被大量孢子覆盖进行了观察(如图5所示)。
表7球孢白僵菌BbPs01菌株对菜缢管蚜的活性
表8球孢白僵菌BbPs01菌株对菜缢管蚜的LC50和LT50值
实施例6：球孢白僵菌BbPs01菌株对B型烟粉虱的毒力测定
应用上述实施例2中所生产的分生孢子，在实验室内的条件下，将B型烟粉虱在盆栽一品红置于养虫笼中饲养，采用浸渍法将BbPs01菌株孢子悬浮液处理载有B型烟粉虱二龄若虫的一品红叶片，以0.02％的吐温-80溶液处理作为对照，每个处理20头以上，3次生物学重复。处理后放入饲养盒里，叶片茎部用无菌水浸湿的棉花包裹；25℃，L：D＝14：12，RH>85％条件下饲养，1-10d调查菜烟粉虱的死亡率，用SPSS软件分析计算校正死亡率、致死中浓度(LC50)和致死中时(LT50)。
生物测定同时，对球孢白僵菌BbPs01菌株侵染烟粉虱的过程进行观察，在体视显微镜下观察烟粉虱的形态变化。
实验结果：
结果表明，球孢白僵菌BbPs01菌株对烟粉虱活性具有明显的剂量时间依赖关系，当5×107spores/mL浓度时，烟粉虱累计校正死亡率在处理后第8天达到90％以上(详见表9)。
球孢白僵菌BbPs01菌株对烟粉虱的LC50在处理后7d和10d分别为9.75×106和8.89×105spores/mL。当时1×108或1×106spores/mL spores/mL浓度时，对烟粉虱的致死中时(LT50)为4.53d或9.77d(详见表10)。
球孢白僵菌菌株BbPs01引起烟粉虱死亡后，0.5d体表开始长出绒毛状菌丝，1d开始长少量孢子，3d左右被大量孢子覆盖(如图6所示)。
表9球孢白僵菌BbPs01菌株对B型烟粉虱的活性
表10球孢白僵菌BbPs01菌株对B型烟粉虱的LC50和LT50值
实施例7：球孢白僵菌BbPs01菌株对柑橘木虱的毒力测定
应用上述实施例2中所生产的分生孢子，在实验室内的条件下，将不同浓度孢子浸渍法处理柑橘木虱成虫，以0.02％的吐温-80溶液处理作为对照，每个处理20头，3次生物学重复。处理后放入饲养盒里，每个饲养盒里有九里香枝条(茎部插入有无菌水的2mL离心管中，并用封口膜封上离心管口)，适时更换；25℃，L：D＝14：12，RH>85％条件下饲养，1-9d调查柑橘木虱的死亡率，用SPSS软件分析计算校正死亡率、致死中浓度(LC50)和致死中时(LT50)。
生物测定同时，对球孢白僵菌BbPs01菌株侵染柑橘木虱的过程进行观察，在体视显微镜下观察橘木虱的形态变化。
实验结果：
结果表明，球孢白僵菌BbPs01菌株对柑橘木虱的活性具有明显的剂量时间依赖关系。1×107spores/mL浓度时，柑橘木虱在处理后5d的累计校正死亡率达即到100％(详见表11)。
球孢白僵菌BbPs01菌株对柑橘木虱在4d或5d的LC50分别为6.89×106和5.56×102spores/mL；1×108spores/mL或1×106spores/mL浓度时，对柑橘木虱致死中时(LT50)分别为3.68d和4.25d(详见表12)。
球孢白僵菌菌株BbPs01引起柑橘木虱死亡后，0.5d体表开始长出绒毛状菌丝，1d开始长少量孢子，3d左右被大量孢子(如图7所示)。
表11球孢白僵菌BbPs01菌株对柑橘木虱的活性
表12球孢白僵菌BbPs01菌株对柑橘木虱的LC50和LT50值
实施例8：球孢白僵菌BbPs01菌株对红火蚁的毒力测定
应用上述实施例2中所生产的分生孢子，在实验室内的条件下，将不同浓度孢子浸渍法处理红火蚁，以0.02％的吐温-80溶液处理作为对照，每个处理20头，3次生物学重复。处理后放入饲养盒里，棉花球蘸取25％的蜂蜜水饲喂，适时添加或更换；25℃，L：D＝14：12，RH>85％条件下饲养，1-9d调查红火蚁的死亡率，用SPSS软件分析计算校正死亡率、致死中浓度(LC50)和致死中时(LT50)。
生物测定同时，对球孢白僵菌BbPs01菌株侵染红火蚁的过程进行观察，在体视显微镜下观察红火蚁的形态变化。
实验结果：
结果表明，球孢白僵菌BbPs01菌株对红火蚁活性好，1×106spores/mL浓度时，处理后4.5d，红火蚁的累计校正死亡率达到100％(详见表13)。该菌株对红火蚁在处理后3d和4d的LC50分别为2.90×105和2.17×102spores/mL；对红火蚁的致死中时(LT50)在1×108或1×106spores/mL浓度时，分别为2.36d和3.05d(详见表14)。
球孢白僵菌菌株BbPs01引起红火蚁死亡后，0.5d体表开始长出绒毛状菌丝，1d开始长少量孢子，3d左右被大量孢子(如图8所示)。
表13球孢白僵菌BbPs01菌株对红火蚁的活性
表14球孢白僵菌BbPs01菌株对红火蚁的LC50和LT50值
综上实验结果表明，本发明提供的球孢白僵菌菌株BbPs01对黄曲条跳甲的侵染率高、致病力强，并且对菜缢管蚜、烟粉虱、红火蚁、柑橘木虱等害虫也具有高活性。该菌株是对多种害虫有效的广谱型菌株，具有作为真菌杀虫剂的潜力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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<110> 华南农业大学
<120> 一种广谱性球孢白僵菌菌株及其应用
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 533
<212> DNA
<213> ITS1-5.8S-ITS4 rDNA
<400> 1
tacctcccct taacccttct gtgacctacc tatcgttgct tcggcggact cgccccagcc 60
cggacgcgga ctggaccagc ggcccgccgg ggacctcaaa ctcttgtatt ccagcatctt 120
ctgaatacgc cgcaaggcaa aacaaatgaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggct 180
ctggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaatccagtg 240
aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc ccgccagcat tctggcgggc atgcctgttc 300
gagcgtcatt tcaaccctcg acctcccctt ggggaggtcg gcgttgggga ccggcagcac 360
caccgccggc cctgaaatgg agtggcggcc cgtccgcggc gacctctgcg tagtaataca 420
gctcgcaccg gaaccccgac gcggccacgc cgtaaaacac ccaacttctg aacgttgacc 480
tcgaatcagg taggactacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag gaa 533

Claims (3)

1.一种球孢白僵菌(Beauveriabassiana)BbPs01菌株，其特征在于，所述菌株已在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)保藏，保藏日期2021年2月4日，保藏号GDMCCNO:61494。
2.如权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)BbPs01菌株在防治鞘翅目、半翅目及膜翅目害虫方面的应用，其特征在于，所述鞘翅目害虫为黄曲条跳甲，所述半翅目害虫为菜缢管蚜、柑橘木虱和B型烟粉虱，所述膜翅目害虫为红火蚁。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，以所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BbPs01菌株的分生孢子为有效成份直接或加工成制剂用于防治鞘翅目、半翅目及膜翅目害虫；所述鞘翅目害虫为黄曲条跳甲，所述半翅目害虫为菜缢管蚜、柑橘木虱和B型烟粉虱，所述膜翅目害虫为红火蚁。
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