CN112143658B - 一种球孢白僵菌菌株mq-08及其应用和微生物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业技术领域，特别涉及一种球孢白僵菌菌株MQ‑08及其应用和微生物制剂。该球孢白僵菌菌株的保藏编号为CGMCC NO.19378。本发明菌株的产孢量、孢子萌发率及对温度的适应性均良好，特别是该菌株表现出耐高温特性，其在32℃高温下生长速率较快，适合在热带作物上应用；该菌株对咖啡果小蠹、茶角盲蝽成虫及高龄若虫的致病力强，致僵虫率也高，这是国内首次报道对两种害虫有致病力的病原真菌。

Description

一种球孢白僵菌菌株MQ-08及其应用和微生物制剂

技术领域

本发明涉及农业技术领域，特别涉及一种球孢白僵菌菌株MQ-08及其应用和微生物制剂。

背景技术

咖啡果小蠹Hypothenemus hampei Ferrari属鞘翅目(Coleoptera)、象甲科(Curculionidae)、小蠹亚科(Scolytinae)、咪小蠹属(Hypothenemus)，是全球咖啡产业的头号害虫，可造成咖啡收获量减少70％以上，该虫已于2007年被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。该虫钻蛀为害咖啡果实，整个发育历期不再飞出果实，终身与后代相伴。2019年6月，中国热带农业科学院香料饮料研究所科技人员首次在海南省万宁市兴隆地区咖啡种植园中发现咖啡果小蠹入侵，截止2019年12月，该虫已迅速蔓延至琼中县、白沙县和澄迈县等海南主要咖啡种植区。

茶角盲蝽Helopeltis theivora Waterhouse属半翅目Hemiptera、盲蝽科Miridae，是可可、茶叶和咖啡等多种热带经济作物的重要害虫，已知寄主超过60种。该虫在热区一年发生10～12代，世代重叠且无越冬现象，其成、若虫全年为害寄主的幼果和嫩叶，显著降低作物的产量和品质，因此该虫是限制热作产业可持续发展的重要因素之一，每年造成的经济损失为25～50％。

目前，生产上主要依靠农业措施和化学药剂防治咖啡果小蠹，但由于农业措施劳动强度大，同时该虫生存环境隐蔽，两种方法防治效果均较差；另外茶角盲蝽存在突出的抗药性问题和寄主转移现象，造成化学防治等措施的效果不佳，因此，迫切需要新的防治方法解决上述生产实际问题。生物防治技术具有专一性强、可持续性、不易产生抗药性、对人畜无害、对环境友好等优点，为了保护生态环境、确保农产品质量安全性，生物防治技术作为害虫防治新策略已广泛应用于多种作物害虫防控，越来越受到人们的重视。

球孢白僵菌Beauveria bassiana是一种昆虫病原真菌，也是生产上应用较多的生物防治资源，在我国已被广泛应用于亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis、飞蝗Locustamiratoria和松毛虫Dendrolimus punctatus等农林害虫的防治，取得了显著的经济、社会和生态效益。然而，我国尚无利用球孢白僵菌控制咖啡果小蠹和茶角盲蝽的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种球孢白僵菌菌株MQ-08及其应用和微生物制剂。该菌株对咖啡果小蠹、茶角盲蝽成虫及高龄若虫的致病力强，致僵虫率也高，这是国内首次报道对两种害虫有致病力的病原真菌。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种球孢白僵菌菌株，其保藏编号为CGMCC NO.19378。

在已有研究基础上，本发明从海南省万宁市中国热带农业科学院香料饮料研究所咖啡基地采集到咖啡果小蠹僵虫，于PDA培养基上分离纯化获得纯化菌株，经形态学和分子生物学方法鉴定为球孢白僵菌，命名为MQ-08；进一步地，本发明对MQ-08菌株进行培养，测定其产孢量、孢子萌发率、不同温度生长曲线等指标，并将菌株配制为1×10⁴～1×10⁸个/mL的孢子悬浮液，测定该菌株对咖啡果小蠹、茶角盲蝽成虫及高龄若虫的致病性。

在本发明中，保藏编号为CGMCC NO.19378的球孢白僵菌菌株的筛选方法为：将采集的咖啡果小蠹僵虫消毒，置于PDA培养基，经培养、纯化，得到球孢白僵菌菌株。

在本发明提供的具体实施例中，培养的温度为26℃。

在本发明提供的具体实施例中，培养、纯化具体为：培养2～3天，待虫体周围长出菌丝后，挑取外围菌丝接入新的PDA培养基中，如此重复3～5次。

本发明还提供了该球孢白僵菌菌株在防治农业害虫中的应用，农业害虫为咖啡果小蠹和/或茶角盲蝽。

作为优选，咖啡果小蠹为咖啡果小蠹成虫，茶角盲蝽为茶角盲蝽成虫和/或高龄若虫。

本发明还提供了一种微生物菌剂，包括上述球孢白僵菌菌株和/或其分生孢子。

作为优选，微生物菌剂还包括农药学上可接受的辅料。

作为优选，辅料为表面活性剂。但辅料并非仅限于表面活性剂，只要是本领域技术人员认可的辅料均在本发明保护范围之内。

作为优选，表面活性剂为吐温-80。但表面活性剂并非仅限于吐温-80，只要是本领域技术人员认可的表面活性剂均在本发明保护范围之内。

作为优选，球孢白僵菌菌株和/或其分生孢子的施用浓度为1×10²～1×10¹⁰个/mL。

优选地，球孢白僵菌菌株和/或其分生孢子的施用浓度为1×10⁴～1×10⁸个/mL。

本发明提供了一种球孢白僵菌菌株MQ-08及其应用和微生物制剂。该球孢白僵菌菌株的保藏编号为CGMCC NO.19378。本发明有益效果如下：

1、本发明提供了一株球孢白僵菌菌株MQ-08；

2、菌株MQ-08的产孢量、孢子萌发率及对温度的适应性均良好，特别是该菌株表现出耐高温特性，其在32℃高温下生长速率较快，适合在热带作物上应用；

3、菌株MQ-08对咖啡果小蠹、茶角盲蝽成虫及高龄若虫的致病力强，致僵虫率也高，这是国内首次报道对两种害虫有致病力的病原真菌。

生物保藏说明

生物材料MQ-08，分类命名：球孢白僵菌，Beauveria bassiana，于2020年4月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.19378。

附图说明

图1菌株MQ-08对咖啡果小蠹(A)和茶角盲蝽(B)的侵染；

图2菌株MQ-08的形态特征；

注：A菌落正面；B菌落背面；C分生孢子；D分生孢子梗；

图3菌株MQ-08在不同温度下的生长曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种球孢白僵菌菌株MQ-08及其应用和微生物制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的球孢白僵菌菌株及其应用和微生物制剂中所用试剂或辅料可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：球孢白僵菌MQ-08分离与鉴定

(1)菌株分离纯化

2019年从海南省万宁市中国热带农业科学院香料饮料研究所咖啡基地采集到咖啡果小蠹僵虫，将虫体浸入70％乙醇中消毒30s后置于含PDA培养基的平板中，在26℃恒温培养箱中培养2～3天，待虫体周围长出菌丝后，挑取外围菌丝接入新的PDA平板中，如此重复3～5次直至获得纯化菌株，编号为MQ-08。将获得的纯化菌株MQ-08转入含PDA培养基的斜面中，26℃恒温培养7～15天，待长出大量分生孢子后，在4℃冰箱保存。

(2)形态学鉴定

菌株MQ-08在PDA培养基上的菌落质地为绒毛状，正面呈乳白色，背面呈淡黄色，菌落生长后期中央有褶皱。通过光学显微镜观察发现，菌株MQ-08的产孢细胞簇生于分生孢子梗上，分生孢子梗呈穗状，向顶部延伸形成弯曲的产孢轴。分生孢子透明，圆形或卵形，壁薄，表明光滑。初步鉴定为白僵菌属Beauveria。

(3)分子鉴定

按照天根真菌DNA提取试剂盒说明书提取MQ-08菌株的总DNA，采用18S rDNA与ITS序列分析方法对菌株进行分子生物学鉴定。

18S rDNA鉴定引物为：NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)/NS6(5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’)，

ITS鉴定引物为：ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)/ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATA-3’)。

PCR反应体系为25μL，反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物测序后在NCBI数据库中进行BLAST比对，结果表明18S rDNA与ITS两个序列与球孢白僵菌的同源性均到达99％以上。结合形态学鉴定结果，最终将MQ-08菌株鉴定为球孢白僵菌Beauveria bassiana。

18S rDNA序列：

5’-CTGGTCTCATGTCTAGTATAAGCATTATACAGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAATCCCGACTTCGGAAGGGAGGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCTCTGGGCTCCTTGGTGATTCATAATAACTTTTCGAATCGCACGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTCGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGATTCGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCTCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCTCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAAAATAGGACGCGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGATGTTATTTTTTGACGCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCTGTATTGCTTTGGCAGTACACCGGCTTCTTAGAGGACTATCGCTCAGCCGAGATTT-3’

ITS序列：

5’-TTCCTCCGCTTCTTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTCGAGGTCAACGTTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGTCGGGGTTCCGGTGCGAGCTGTATTACTACGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCCATTTCAGGGCCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACCTCCCCCAGGGGAGGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAAGATGCTGGAATACAAGAGTTTGAGGTCCCCGGCGGGCCGCTGGTCCAGTCCGCGTCCGGGCTGGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTAGGTTCACAGAAGGGTTAGGGAGTTGAAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGGTCACCTACGGAA-3’

实施例2：球孢白僵菌MQ-08的生物学特性

(1)不同温度下的生长速率测定

将MQ-08菌株接种于PDA平板，置于12℃、17℃、22℃、26℃、32℃等5种温度条件下培养15d，用十字交叉法每天测量1次菌落直径，每处理设3个重复。结果显示，5种温度条件下，MQ-08菌株均能生长，其适应范围广。随着温度的升高其生长速率越快，至26℃时达最快，之后逐渐减慢，尽管32℃时该菌株生长速率略有下降，但仍然保持较快速度生长，表明MQ-08菌株耐受高温环境。

(2)产孢量测定

将MQ-08菌株接种于PDA平板，26℃条件下培养15d，用直径为0.50cm的打孔器在菌落中央至边缘的中点处打3个孔，取菌落块转移至三角瓶中，加入含0.2％吐温-80的无菌水，在磁力搅拌器上充分振荡使孢子分散均匀，配制成孢子悬浮液。用血球计数板测定孢子数量，重复3次，换算为单位面积的产孢数量。结果表明，MQ-08菌株的产孢量为(2.34±0.11)×10⁸个/cm²。

(3)孢子萌发率测定

将MQ-08菌株接种于PDA平板，26℃条件下培养15d，刮取菌落于含0.2％吐温-80的无菌水中，并用灭菌滤纸进行过滤，在磁力搅拌器上充分振荡使孢子分散均匀。通过血球计数板计算，再用PDA液体培养基稀释为1×10⁶～1×10⁷个/mL的孢子悬浮液，置于26℃条件下振荡培养，记录24h后孢子萌发率。结果表明，MQ-08菌株的孢子萌发率为91.17％。

表1菌株MQ-08的孢子萌发率

重复	总孢子数(个)	萌发孢子数(个)	萌发率(％)
				1	334	303	90.72
2	427	389	91.10
				3	337	309	91.69
平均	366	334	91.17

实施例3：球孢白僵菌MQ-08对咖啡果小蠹的致病性测定.

将MQ-08菌株接种于PDA平板，26℃条件下培养15d，刮取菌落于含0.2％吐温-80的无菌水中，并用灭菌滤纸进行过滤，通过血球计数板计算，配制浓度为1×10⁸个/mL的孢子悬浮液母液，再依次稀释为1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴个/mL的孢子悬浮液。将健康活跃的咖啡果小蠹成虫在不同浓度孢子悬浮液中浸渍10s，然后放入底部装有灭菌滤纸的培养皿中，在滤纸上加入适量水保湿，用封口膜封口，防止该虫逃逸。每个处理10头成虫，6个重复，以0.2％吐温-80水悬液处理作为对照，在温度26℃、相对湿度85％条件下培养7d，每天记录咖啡果小蠹成虫死亡情况，死虫保湿培养观察菌丝生长和产孢情况，统计死亡率和僵虫率。结果表明：处理7天后，各浓度菌株MQ-08对咖啡果小蠹的校正死亡率均大于60％，并且随着浓度的升高，菌株MQ-08对咖啡果小蠹的致病性显著增加，当浓度为1×10⁷时，咖啡果小蠹的校正死亡率即可达到100％，表明菌株MQ-08对咖啡果小蠹有较强的致病力。另外，孢子浓度为1×10⁸和1×10⁷个/mL时的僵虫率分别为94.83％和92.25％，显著高于其他浓度，表明菌株MQ-08对咖啡果小蠹有较好的感染效果。

表2不同浓度菌株MQ-08对咖啡果小蠹的致病性评价

实施例4：球孢白僵菌MQ-08对茶角盲蝽的致病性测定

MQ-08菌株孢子悬浮液的配制方法同实施例2。用移液枪将不同浓度的孢子悬浮液点滴于健康活跃的茶角盲蝽背部，每头虫点滴20μL，然后将处理后的茶角盲蝽放入底部装有灭菌滤纸的方形塑料盒中，盒盖设有透气网窗，在滤纸上加入适量水保湿。设置成虫组和高龄若虫组(4龄和5龄若虫)两个实验组，每个处理10头成虫或若虫，6个重复，以0.2％吐温-80水悬液处理作为对照，在温度26℃、相对湿度85％条件下培养7d，每天记录茶角盲蝽死亡情况，死虫保湿培养观察菌丝生长和产孢情况，统计死亡率和僵虫率。结果表明：处理茶角盲蝽成虫7d后，孢子浓度为1×10⁶个/mL以上的菌株MQ-08对成虫的校正死亡率均大于90％，显著高于其他浓度；当浓度为1×10⁷和1×10⁸个/mL时，校正死亡率均达100％，僵虫率分别为94.67％和100％，显著高于其他浓度。处理茶角盲蝽高龄若虫7d后，孢子浓度为1×10⁸个/mL时的菌株MQ-08对高龄若虫的校正死亡率为92.50％，显著高于其他浓度；当浓度为1×10⁷和1×10⁸个/mL时，僵虫率分别为72.33％和84.17％，显著高于其他浓度。表明菌株MQ-08对茶角盲蝽成虫和高龄若虫均有较强的致病力和感染效果，但其对茶角盲蝽成虫致病性更好。

表3不同浓度菌株MQ-08对茶角盲蝽成虫的致病性评价

表4不同浓度菌株MQ-08对茶角盲蝽高龄若虫的致病性评价

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNO.19378。

2.权利要求1所述的球孢白僵菌菌株在防治农业害虫中的应用，其特征在于，所述农业害虫为咖啡果小蠹和/或茶角盲蝽。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述咖啡果小蠹为咖啡果小蠹成虫，所述茶角盲蝽为茶角盲蝽成虫和/或高龄若虫。

4.一种微生物菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的球孢白僵菌菌株和/或其分生孢子。

5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂还包括农药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述辅料为表面活性剂。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的微生物菌剂，其特征在于，所述球孢白僵菌菌株和/或其分生孢子的施用浓度为1×10²～1×10¹⁰个/mL。

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