CN114806898B - 一株红棕象甲球孢白僵菌BbKMND202111菌株及其应用 - Google Patents

一株红棕象甲球孢白僵菌BbKMND202111菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株红棕象甲球孢白僵菌BbKMND202111菌株及其应用，本发明的一株红棕象甲球孢白僵菌BbKMND202111菌株，该菌株为球孢白僵菌Beauveria baasiana，保藏名称为球孢白僵菌Beauveria baasiana；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年12月31日；保藏编号：CGMCC No.40033。本发明是初次从红棕象甲幼虫体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大。其对红棕象甲成虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于红棕象甲的防治。

Description

一株红棕象甲球孢白僵菌BbKMND202111菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株红棕象甲球孢白僵菌BbKMND202111菌株及其应用。
背景技术
红棕象甲Rhynchophorus ferrugineus Oliver属鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)棕榈象属(Rhynchophorus)，别名锈色棕榈象、椰子隐喙象、椰子甲虫等，于2005年被国家林业局列入林业检疫性有害生物名录。红棕象甲起源于亚洲南部及西太平洋上美拉尼西亚群岛，于20世纪80年代通过苗木调运传入地中海沿岸、大洋洲和拉丁美洲等40余个国家和地区；国内已扩散至海南、广东、福建、云南等长江以南地区。该虫主要寄主植物包括加纳利海枣、椰子、槟榔、大王棕、霸王棕、油棕、美丽针葵等30余种棕榈植物。该虫成虫在寄主植物叶柄基部的伤痕、裂口处产卵，待卵孵化后，幼虫首先蛀入幼嫩的叶柄基部取食为害，后在茎干内钻蛀，形成隧道并在隧道内留下植株纤维和排泄物，取食幼嫩组织，破坏生长点最终导致寄主植物死亡。因该虫取食特点及生活习性，致使防控难度加大。目前中国对于该虫防治主要以聚集信息素诱集成虫为主，在化学防治方面主要针对幼虫采用茎干注射杀虫剂或选用具有触杀、胃毒作用的杀虫剂，稀释后对寄主植物进行灌淋或埋根处理，起到预防红棕象甲对寄主植物的危害。目前利用化学防治手段是防治红棕象甲主要的手段，在生物防治方面的研究还相对较少。目前国内关于利用生物防治红棕象甲的研究主要集中于金龟子绿僵菌、粘质沙雷氏菌及昆虫病原线虫尚未见白僵菌对红棕象甲生物防治研究的相关报道。
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)属于接合菌亚门丝孢纲丝孢目白僵菌属真菌，是一种经典的虫生真菌。球孢白僵菌在世界范围被用于害虫生物防治，其中我国使用球孢白僵菌防治玉米螟和马尾松毛虫是国际上利用虫生真菌防治害虫的典型，取得了良好的害虫持续控制效果。球孢白僵菌能寄生鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、双翅目、半翅目、直翅目、等翅目、缨翅目、脉翅目、革翅目、蚤目、螳螂目、蜚蠊目和纺足目等15目149科521属707种害虫，已被开发为防治鳞翅目害虫幼虫及鞘翅目、同翅目等害虫成虫和幼虫的生物农药，应用于作物、蔬菜和林业害虫的防治实践。由于球孢白僵菌能有效控制害虫虫口数量，同时其他天敌昆虫和有益生物无伤害作用，符合有害生物综合治理的宗旨，同时由于其容易大量生产，防治成本较有竞争力，因而其具有广泛的应用前景。
红棕象甲已扩散至我国海南、广东、福建、云南等长江以南地区，国内主要利用化学农药的方式防治该害虫。对于该虫生物防治的研究，国内主要集中于金龟子绿僵菌、淡紫色拟青霉、粘质沙雷氏菌亚种，然而关于自然感染红棕象甲幼虫的球孢白僵菌国内还未见报道，因而还缺乏能用于生物防治红棕象甲幼虫的球孢白僵菌。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种球孢白僵菌BbKMND202111菌株及其应用，旨在克服现有球孢白僵菌未发现能寄生红棕象甲幼虫的不足，通过生物技术手段防治红棕象甲幼虫，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题。
为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一株红棕象甲球孢白僵菌BbKMND202111菌株，该菌株为球孢白僵菌Beauveria baasiana，保藏名称为球孢白僵菌Beauveria baasiana；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年12月31日；保藏编号：CGMCCNo.40033。
进一步地，所述的球孢白僵菌BbKMND202111菌株的16S rDNA的基因序列为SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述的球孢白僵菌BbKMND202111菌株为白色绒毛状，菌落边缘整齐，呈扩环状生长；接种后第5d，菌落开始产孢，略变为淡沙黄色，菌落中间略凸起，孢子层呈粉状长势均匀，菌落背面淡黄色并出现褶皱；在PDA培养基上培养至15d时，菌落直径为55.53mm(图1a-b)；在SDAY培养基上培养至第15d时，菌落直径为48.38mm(图1c-d)。
在光学显微镜下营养菌丝细长无色，分生孢子梗在菌丝端部侧面分支向前延生，顶端形成新的分生孢子。分生孢子无色、光滑，圆球形少数卵圆形，直径2.1～2.4μm(图1e-f)。
本发明所述的红棕象甲球孢白僵菌BbKMND202111菌株制备的球孢白僵菌BbKMND202111菌株菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的球孢白僵菌BbKMND202111菌株的发酵液初提物；
(b)所得球孢白僵菌BbKMND202111菌株细胞的超声裂解上清；
(c)所得球孢白僵菌BbKMND202111菌株细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的球孢白僵菌BbKMND202111菌株在红棕象甲防治制剂中的应用。
有益效果：本发明是初次从红棕象甲幼虫虫体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大。其分生孢子对红棕象甲低龄幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于红棕象甲幼虫的防治。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明的球孢白僵菌BbKMND202111菌株是我们首次从草地贪夜蛾成虫上分离纯化获得的球孢白僵菌BbKMND202111，CGMCCNo.40033。
(2)该菌株在温度为30℃、相对湿度80％以上在PDA培养基上生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对红棕象甲低龄幼虫的致病力较好，可以广泛地用于红棕象甲幼虫的防治。同时，该菌株培养原料来源广泛，价格便宜，培养方法简单，易大量进行生产，具有较大的开发应用潜力，用该菌株防治红棕象甲幼虫，即为典型的生物防治，可避免化学农药所带来的抗药及环境污染等问题，将为红棕象甲幼虫的绿色防控提供依据。
附图说明
图1为本发明的球孢白僵菌BbKMND202111菌株的分生孢子形态图。
图2为本发明的球孢白僵菌BbKMND202111菌株的感染红棕象甲幼虫的图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
病原菌的分离、鉴定
1.1材料与方法
1.1.1材料
将采集自云南省昆明市云南农业大学校园内棕榈树上的罹病红棕象甲幼虫，。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)马铃薯200g+葡萄糖20g+琼脂15g+蒸馏水1000mL。
无菌操作条件：所有的器皿和用具均经高温灭菌锅(121℃，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。
培养条件：置于30℃光照(12L：12D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到试管PDA斜面，培养3-4天，转入4℃冰箱储存。
1.1.2病原菌的分离和纯化
分离：从罹病红棕象甲幼虫尸体上分离病原菌。将红棕象甲幼虫罹病虫体带回实验室，将红棕象甲幼虫尸体按顺序依次经过70％酒精浸泡30s、再经过0.1％升汞溶液浸泡3分钟(彻底消毒)、最后用无菌水冲洗三次，再用接种针取处理好的红棕象甲忧愁组织接种于PDA培养基上。在30℃条件下培养，按单孢分离、培养得到纯的、产孢能力强的菌株球孢白僵菌Beauveria bassiana，转移到PDA斜面上生长3-4天，在4℃冰箱储存。
复壮：将分离到的菌株在PDA培养基上培养5天，等产生大量分生孢子后，再收集该分生孢子挑入含1％吐温-80的无菌水中，用磁力搅拌器搅拌均匀，获得孢子悬浮液，用喷雾塔均匀喷于红棕象甲幼虫虫体体表，然后在80％以上湿度条件下培养。对死亡虫体进行收集并保湿培养，得到的成虫虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。
纯化：挑取培养基上分生孢子粉，再次接种在新配制培养基上。如此培养2～3代，纯化得到菌株。
1.1.3病原菌的鉴定
根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。利用40×10倍显光学微镜，镜检菌丝、分生孢子和产孢结构的形态。
1.2结果
在PDA培养基上，培养后第3d时菌落边缘整齐，白色绒毛状，呈扩环状生长；接种后第5d，菌落开始产孢，略变为淡沙黄色，菌落中间略凸起，孢子层呈粉状长势均匀，菌落背面淡黄色并出现褶皱；在PDA培养基上培养至15d时，菌落直径55.53mm(图1a-b)。在光学显微镜下营养菌丝细长无色，分生孢子梗在菌丝端部侧面分支向前延生，顶端形成新的分生孢子。分生孢子无色、光滑，圆球形少数卵圆形，直径2.1～2.4μm(图1e-f)。
从被虫生真菌自然侵染的红棕象甲幼虫虫体上分离获得一球孢白僵菌野生菌株，马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养，并回接于红棕象甲幼虫复壮获得一菌株，对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的菌株，即球孢白僵菌Beauveria bassiana BbKMND202111。
根据自然感染症状、采集罹病虫体室内分离观察，并依据《昆虫真菌学》(蒲蜇龙，李增智，1996)有关球孢白僵菌感染症状、分生孢子及菌丝的形态特征进行鉴定，确定为球孢白僵菌。
实施例2
球孢白僵菌纯化菌株生物学特性
2.1材料与方法
2.1.1供试菌株
选择纯化后生长旺盛、生长均匀的一皿作为供试菌株。取菌丝再次接种到PDA培养基上，于25℃的恒温光照(12L:12D)培养箱中培养。
2.1.2培养基对菌株生长和产孢的影响
分别测定菌株在SDAY、SMAY、PDA及蔗糖培养基上的生长和产孢情况。采用点接法将分生孢子接种于上述培养基，置于25℃，光周期L：D＝24h：0h培养箱内，定时观察并记录菌落色泽、形态及产孢时间等。自第3d起，采用十字交叉法测量菌落的横纵直径直至菌株产孢结束，用灭菌后的打孔器(直径＝10mm)自菌落的中心点至边缘距离的1/2处打孔，将所得菌块置于含有20mL 0.05％Tween-80无菌水的三角瓶中，磁力搅拌10min，充分震荡后获得孢子悬液。用微量移取器吸取混匀的孢子悬浮液，用血球计数板计数，以10倍进行稀释至血球计数板可数为止，计算各个条件下单个菌落的平均产孢量，每个处理重复5次。
2.1.3温度对菌株生长和产孢的影响
将菌株分生孢子接种于1.4.1中选出的最佳培养基上，之后分别置于温度为20、25、30℃，光周期L：D＝24h：0h培养箱内，定时观察并测定其生长速率。继续培养15d后，按上述2.1.2方法测定产孢量，每个处理重复5次。
2.1.4光周期对菌株生长和产孢的影响
依上述所筛选出最佳条件，将接种好的培养基分别置于光周期24L：0D、12L：12D、0L：24D条件下，定时观察并测定其生长速率及产孢量，每个处理重复5次。
2.2结果
2.2.1培养基对菌株生长的影响
本发明从罹病红棕象甲幼虫虫体上分离获得球孢白僵菌野生菌株，将野生菌株回接于红棕象甲幼虫虫体上复壮得到球孢白僵菌菌株，对该菌株采用按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的球孢白僵菌。在PDA及SMAY培养基上生长最快，第15d菌落直径分别为55.53mm和54.01mm。生长于不同培养基菌落日增长量分别为4.64mm/d、4.19mm/d、4.61mm/d以及4.44mm/d。由此表明，PDA培养基以及SMAY培养基较适宜该菌株生长。其中PDA培养基上的产孢量最高，达到6.38×109孢子/cm2；在SDAY培养基产孢量为3.20×109孢子/cm2；在SMAY培养基产孢量为5.53×109孢子/cm2；在蔗糖培养基产孢量为4.63×109孢子/cm2。综上所述，球孢白僵菌BbKMND202111菌株适宜在PDA培养基上生长。
2.2.2温度对菌株生长的影响
球孢白僵菌BbKMND202111菌株在20、25和30℃条件下均可生长。在30℃条件下生长最快，第15d菌落直径可达到61.18mm高于其余处理。在不同培养温度条件下，菌落日增长量依次为2.64mm/d、4.65mm/d以及5.55mm/d。在30℃条件下菌落生长速率最高。在30℃下，产孢量最高为9.09×109孢子/cm2；在25℃下，产孢量最高为6.63×109孢子/cm2；在20℃下，产孢量最低仅为2.47×109孢子/cm2。
2.2.3光周期对菌株生长的影响
球孢白僵菌BbKMND202111菌株在0L：24D、12L：12D及24L：0D条件下均可生长。菌株生长至第15d不同光周期条件下菌落直径及单位面积产孢量未见显著差异。
球孢白僵菌BbKMND202111菌株生长于不同培养基培养特征如表1所示：
表1
Figure BDA0003690001750000081
球孢白僵菌BbKMND202111菌株生长于不同温度培养特征如表2所示：
表2
Figure BDA0003690001750000082
球孢白僵菌BbKMND202111菌株于不同光周期培养特征如表3所示：
表3
Figure BDA0003690001750000083
实施例3
球孢白僵菌BbKMND202111对红棕象甲低龄幼虫的室内毒力测定
3.1、材料与方法
3.1.1供试虫源
红棕象甲Rhynchophorusferrugineus Oliver幼虫，由本实验室，温度(28±1)℃，湿度(80±5)％，光周期12L﹕12D光照培养箱中，采用新鲜甘蔗饲养。获得健康、大小一致低龄幼虫作为试虫。
3.1.2孢子悬浮液的制备
取长势良好的纯化球孢白僵菌用无菌水将分生孢子洗下并过滤配成108孢子/mL分生孢子菌悬液，用无菌毛细滴管取分生孢子菌悬液滴于血细胞计数板上，在显微镜下数孢子并记录数据，以含0.5％吐温80的无菌水为空白对照，用于毒力测定。
3.1.3接种处理
配制1.0×108孢子/mL的孢子悬浮液，采用浸渍法接种红棕象甲低龄幼虫，放入(28±1)℃，RH(75±5)％，光周期12L﹕12D的恒温培养箱中饲养，每隔24h观察供试红棕象甲低龄幼虫染菌情况，统计死亡数量。将死亡的虫体，在灭菌培养皿中于(28±1)℃光照培养箱中保湿培养，每天定时观察死亡虫体上菌体的生长和产孢情况，从而确定死亡虫为白僵菌感染致死。
3.2结果
球孢白僵菌BbKMND202111对红棕象甲低龄幼虫具有强侵染致病作用，在1.0×108孢子/mL浓度分生孢子悬浮液接种处理后第10天时，红棕象甲低龄幼虫的死亡率达100％，而对照组低龄幼虫的死亡率仅为9.7％。由此表明，球孢白僵菌BbKMND202111对红棕象甲低龄幼虫具有很强的致病力。
红棕象甲低龄幼虫感染症状如图2(g-h)所示。可以看出，菌丝首先从被侵染幼虫腹部长出，生长后期在红棕象甲低龄幼虫上产生大量孢子。头部长满菌丝和孢子因为头部有蜕裂线和背侧线等，菌丝很容易从这些地方长出。
实施例4
球孢白僵菌BbKMND202111对红棕象甲高龄幼虫的室内毒力测定
4.1材料与方法
4.1.1供试虫源
在温室内，温度(25±1)℃，湿度(80±5)％，光周期12L﹕12D条件下用新鲜甘蔗饲养红棕象甲幼虫，获得健康、大小一致的同日龄高龄幼虫作为试虫。
4.1.2防治方法
在室内用PDA培养基，于温度(30±1)℃，湿度(80±5)％，光周期12L﹕12D条件下培养球孢白僵菌BbKMND202111，配制球孢白僵菌BbKMND202111的108孢子/mL，采用浸虫法处理红棕象甲高龄幼虫，以含0.5％吐温80的无菌水为空白对照，每天定时观察和记数蛹的死亡数量，将死亡的虫体，在灭菌培养皿中于(28±1)℃光照培养箱中保湿培养，每天定时观察死亡虫体上菌体的生长和产孢情况，从而确定死亡虫为白僵菌感染致死。
4.2结果
球孢白僵菌BbKMND202111用1.0×108孢子/mL浓度分生孢子悬浮液接种处理后第10天时，红棕象甲低龄高龄的死亡率73.6％，而对照组高龄幼虫的死亡率仅为6.0％。由此表明，球孢白僵菌BbKMND202111对红棕象甲高龄幼虫具有良好的防治作用。红棕象甲高龄幼虫感染症状如图2(i-j)所示。
根据文献比对，目前国内尚未见有关红棕象甲球孢白僵菌的研究报道。本发明发现的球孢白僵菌BbKMND202111菌株是我国首次从红棕象甲幼虫上分离纯化获得的球孢白僵菌BbKMND202111，CGMCC No.40033，该菌株在温度为30℃、相对湿度80％以上在PDA培养基上生长快速，产孢量高，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对红棕象甲低龄和高龄幼虫的致病力均较高，可以广泛地用于红棕象甲幼虫的防治。同时，该菌株培养原料来源广泛，价格便宜，培养方法简单，易大量进行生产，具有较大的开发应用潜力，用该菌株防治红棕象甲幼虫，即为典型的生物防治，可避免化学农药所带来的抗药及环境污染等问题，将为红棕象甲的绿色防控提供依据。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 云南农业大学
<120> 一株棕榈象甲球孢白僵菌BbKMND2021117菌株及其应用
<130> 2022
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列(球孢白僵菌BbKMND202111菌株的16S rDNA的基因序列)
<400> 1
tggcatcgac ttcactccct acccttctgt gaacctacct atcgttgctt cggcggactc 60
gccccagccc ggacgcggac tggaccagcg gcccgccggg gacctcaaac tcttgtattc 120
cagcatcttc tgaatacgcc gcaaggcaaa acaaatgaat caaaactttc aacaacggat 180
ctcttggctc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag 240
aatccagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc cgccagcatt ctggcgggca 300
tgcctgttcg agcgtcattt caaccctcga cctccccttg gggaggtcgg cgttggggac 360
cggcagcacc accgccggcc ctgaaatgga gtggcggccc gtccgcggcg acctctgcgt 420
agtaatacag ctcgcaccgg aaccccgacg cggccacgcc gtaaaacacc caacttctga 480
acgttgacct cgaatcaggt aggactaccc gctgaactta agcatatcaa aagcccggag 540
gaa 543

Claims (4)

1.一株红棕象甲球孢白僵菌BbKMND202111菌株，其特征在于：该菌株为球孢白僵菌Beauveria baasiana，保藏名称为球孢白僵菌Beauveria baasiana；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年12月31日；保藏编号：CGMCC No.40033。
2.权利要求1所述的红棕象甲球孢白僵菌BbKMND202111菌株制备的球孢白僵菌BbKMND202111菌株菌剂。
3.根据权利要求2所述的球孢白僵菌BbKMND202111菌株菌剂，其活性成分为权利要求1所述的球孢白僵菌BbKMND202111菌株的孢子悬浮液。
4.权利要求1所述的球孢白僵菌BbKMND202111菌株在红棕象甲防治制剂中的应用。
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