CN105176828B - 球孢白僵菌XNBb-04菌株及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，是一种球孢白僵菌XNBb‑04菌株及其培养方法，该球孢白僵菌XNBb‑04菌株于2014年3月6日保藏于典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2014075。本发明提供一种球孢白僵菌XNBb‑04菌株，属半知菌门（Deuteromycota），丛梗孢目（Moniliales），丛梗孢科（Moniliaceae），白僵菌属（Beauveria）。球孢白僵菌XNBb‑04菌株是我国本土的一种昆虫病原真菌，能够进一步制备活体生物农药，对苜蓿根瘤象甲虫有较好致病力作用，能够有效杀死苜蓿根瘤象甲虫，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理，对环境无污染、无残留，本发明球孢白僵菌XNBb‑04菌株在防治害虫方面可以应用于各种生态环境，有利于环境保护。

Description

球孢白僵菌XNBb-04菌株及其培养方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，是一种球孢白僵菌XNBb-04菌株及其培养方法。

背景技术

苜蓿是全世界最主要的豆科牧草，素有“牧草之王”之美称，由于适应性强，产草量高，富含蛋白质等特点，在世界上被广泛栽培种植。除了作为家畜的饲草之外，种植苜蓿还可以改土肥田，提高后茬作物的产量和品质，同时还具有保持水土，改善生态环境的作用。新疆是苜蓿种植的故乡，也是我国苜蓿种植的主产区之一，苜蓿生产是新疆畜牧业发展的重要支柱产业之一。

苜蓿根瘤象隶属于鞘翅目（Coleoptera），象甲科（Curculionidae；weevils）。主要有驴豆根瘤象（Sitona callisus Gyll.）和条纹根瘤象（S.lineatus L.）。本属象甲约15种以上，以幼虫危害豆科牧草的根及根瘤而得名，一年发生一代，以成虫在多年生豆科植物根部或土表枯枝落叶下越冬，广泛分布于欧洲、北美洲各国种植豆科牧草及作物的地区，我国已知种植豆科牧草及作物的地区主要分布于新疆、甘肃。苜蓿根瘤象甲成虫危害幼苗，咬食叶片和生长点，抑制植物生长或引起植株死亡，但危害主要来自幼虫取食根部，危害根和根瘤。幼虫蛀食根和根瘤，减少氮素在根和土壤中的含量，降低土壤肥力，当根瘤受害28%至91%时，植物根中含氮量降低9%至36%。此外由于根和根瘤被害造成的伤口使病原微生物易于入侵，又加重了苜蓿根部病害的发生，导致苜蓿草地严重退化，牧草和种子产量大幅减低甚至绝收，对苜蓿生产造成严重的经济损失。

由于苜蓿根瘤象以幼虫生活在苜蓿根际土壤中，直至羽化为成虫才上到地面危害地上部叶片，但其主要危害虫态是幼虫。在苜蓿根瘤象的防治上，多采用传统的化学防治方法除治成虫。大量化学农药的使用不仅对环境和苜蓿草造成污染，有悖绿色奶业发展的初衷，而且对苜蓿根瘤象幼虫难以奏效。利用白僵菌防治苜蓿根瘤象对控制其种群数量的增加和减少环境污染意义重大，在生物农药防治方面未发现有用于防治苜蓿根瘤象的球孢白僵菌菌株。

发明内容

本发明提供了一种球孢白僵菌XNBb-04菌株及其培养方法，克服了上述现有技术之不足，本发明提供一种可以有效防治苜蓿根瘤象的球孢白僵菌XNBb-04菌株，本发明的另一目的是提供了一种球孢白僵菌XNBb-04菌株的培养方法。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种球孢白僵菌XNBb-04菌株，于2014年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2014075，保藏地址为武汉大学。

下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：

上述球孢白僵菌XNBb-04菌株的形态学特征描述如下：菌落初呈白色平绒状，后变乳黄色粉末状，在马铃薯琼脂葡萄糖培养基培养条件下，菌落背面无色或黄色；分生孢子梗短小，无色，无隔膜，顶端曲折状延伸，单生或聚集成孢梗束，壁光滑，透明，瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，大小为96μm至142μm×4.9μm至7.3μm，平均大小为120μm×5.8μm；分生孢子呈球形、卵形、椭圆形，无色，单胞，大小为2.47μm至5.21μm×1.95μm至3.63μm，平均大小为3.16μm×2.65μm，无厚垣孢子。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种球孢白僵菌XNBb-04菌株的培养方法，按以下步骤进行：

第一步，一级菌种扩大培养：将球孢白僵菌XNBb-04菌株接入装有PDA斜面培养基的试管中，放入培养箱，在温度为24℃至28℃、相对湿度为70%至85%条件下培养，待菌丝长满斜面并产满孢子后得到一级菌株培养物；

第二步，二级菌种扩大培养：在无菌条件下，将培养好的一级菌株培养物的菌种孢子粉刮下，用无菌水配制成浓度为5×10⁷个孢子/mL的悬液，吸1mL接入盛有50mLPDB培养液的250mL三角瓶中，使培养液中孢子浓度为10⁶个孢子/mL，在温度为24℃至26℃、转速为160r/min条件下振荡培养48小时，转接入装有200mLPDB培养液的500mL三角瓶中，继续振荡培养24小时至培养液中长满菌丝球得到二级菌株培养物；

第三步，三级菌种扩大培养：在无菌条件下，将二级菌种培养物的菌种按体积比菌株：固体培养基为1:15的接种量接入灭过菌的固体培养基中，在温度为20℃至23℃、相对湿度为70%至85%条件下培养15d，直到固体培养基上全部长满白色菌丝。

下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：

上述第三步中固体培养基的配制方法为：按重量百分比计，将麦麸68%、米糠30%、黄豆粉1%和奶粉1%混匀，并加入麦麸、米糠、黄豆粉和奶粉总重量70%的水，搅拌均匀，灭菌即得。

本发明提供一种球孢白僵菌XNBb-04菌株，属半知菌门，丛梗孢目，丛梗孢科，白僵菌属。球孢白僵菌XNBb-04菌株是我国本土的一种昆虫病原真菌，能够进一步制备活体生物农药，对苜蓿根瘤象甲虫有较好致病力作用，能够有效杀死苜蓿根瘤象甲虫，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理，对环境无污染、无残留，本发明球孢白僵菌XNBb-04菌株在防治害虫方面可以应用于各种生态环境，有利于环境保护。

附图说明

附图1为本发明的球孢白僵菌XNBb-04菌株菌丝、分生孢子梗和分生孢子形态。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。除非特别说明，本发明中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；除非特别说明，本发明中采用的培养基和试验条件为本技术领域常规培养基和实验条件；除非特别说明，本发明中所用试剂均为市购。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述：

实施例1，该球孢白僵菌XNBb-04菌株于2014年3月6日保藏于典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2014075。

实施例2，该球孢白僵菌XNBb-04菌株的形态学特征描述如下：菌落初呈白色平绒状，后变乳黄色粉末状，在马铃薯琼脂葡萄糖培养基培养条件下，菌落背面无色或黄色；分生孢子梗短小，无色，无隔膜，顶端曲折状延伸，单生或聚集成孢梗束，壁光滑，透明，瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，大小为96μm至142μm×4.9μm至7.3μm，平均大小为120μm×5.8μm；分生孢子呈球形、卵形、椭圆形，无色，单胞，大小为2.47μm至5.21μm×1.95μm至3.63μm，平均大小为3.16μm×2.65μm，无厚垣孢子。如附图1所示。

具体的，本发明球孢白僵菌XNBb-04菌株的分离获得方法如下：

从新疆维吾尔自治区呼图壁县种牛场苜蓿田中采集的苜蓿根瘤象甲被虫生真菌感染的僵虫，在新疆维吾尔自治区新疆农业大学“植物病理和微生物重点实验室”分离获得虫生真菌。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：将200g马铃薯洗净、切块，沸水煮30min后过滤除渣，加入15g琼脂粉，继续加热融化，再加入20g葡萄糖并加入水使总体积为1000ml，分装，经高压蒸汽灭菌锅灭菌(121℃，30min)。

无菌操作条件：所有器皿和用具须经高压灭菌锅灭菌(121℃，30min)，接种、纯化、保种均在超净工作台内进行。

培养条件：置于26℃光照(14L:10D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4℃冰箱贮存。

一、球孢白僵菌菌株的分离、纯化、鉴定：

S1、分离

从采回的被虫生真菌感染的苜蓿根瘤象甲虫尸样品上分离病原菌：利用质量浓度为0.1%的次氯酸钠溶液对被虫生真菌感染的苜蓿根瘤象甲虫尸样品进行表面消毒3min，消毒后的被虫生真菌感染的苜蓿根瘤象甲虫尸样品在灭菌水中洗涤3次，灭菌滤纸吸干苜蓿根瘤象甲虫体表面水分，并放入PDA平板中，倒置于26℃恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4℃冰箱贮存。

、侵染

从S1中分离得到的菌落中挑选生长快、菌落大、孢子多的单菌落孢子在PDA平板上培养20天，待形成菌落后加入质量浓度为0.1% 吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液加无菌玻璃珠在涡旋振荡器上振荡20分钟，用小型手动喷雾器将浓度为1×10⁷个孢子/mL的孢子悬浮液均匀地喷于健康的苜蓿根瘤象甲虫体上，保湿90%以上，20天后挑取被感染的苜蓿根瘤象甲，按S1、S2所述的方法分离到球孢白僵菌XNBb-01菌株。

、纯化

对球孢白僵菌XNBb-01菌株在PDA平板上培养20d，待形成白色菌落后，挑取分生孢子制成1×10⁷个孢子/mL的孢子悬液，取30μL悬液滴于PDA平板培养基上，涂布均匀，26℃恒温倒置培养，待长出可见微小菌落时，取单个菌落分别培养，分别获得球孢白僵菌XNBb-02、球孢白僵菌XNBb-03、球孢白僵菌XNBb-04、球孢白僵菌XNBb-05、球孢白僵菌XNBb-06、球孢白僵菌XNBb-07、球孢白僵菌XNBb-08、球孢白僵菌XNBb-09、球孢白僵菌XNBb-10共10个菌株。

、鉴定

根据菌株的形态学特征进行初步鉴定，所述的球孢白僵菌的形态学特征描述如下，

（1）、菌落形态描述

将获得的10个菌株接种到PDA平板上，于26℃条件下培养，2d可见到长出白色、平绒状、中部隆起的菌落，第5d产生白色粉末状孢子，菌落背面无色或黄色。

（2）、菌丝和孢子形态描述

分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，壁光滑，透明。瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，大小为96μm至142μm×4.9μm至7.3μm，平均大小为120μm×5.8μm；分生孢子呈球形、卵形、椭圆形，无色，单胞，大小为2.47μm至5.21μm×1.95μm至3.63μm，平均大小为3.16μm×2.65μm，无厚垣孢子。如图1。

二、球孢白僵菌菌株的筛选

虫生真菌在遗传、生态及生物学方面具有多样性，又存在有准性生殖现象，同种真菌的不同菌株对目标害虫的致病力差异显著，菌株不同，其LC₅₀、LT₅₀可相差数倍至数十倍。高产优质菌株的筛选与获得是取得较好防治效果的首要前提。以常用的致病力、产孢量、孢子萌发率3个指标作为菌株筛选的依据，筛选出优良的球孢白僵菌菌株。

、菌株对苜蓿根瘤象甲成虫的致病力的测定

(1)供试菌株的处理

经纯化后获得的球孢白僵菌XNBb-01至XNBb-10号菌株，在PDA平板于26士0.5℃的恒温箱(N:D=14：10)中培养。

供试昆虫与寄主植物

苜蓿根瘤象甲，采集苜蓿田间的苜蓿根瘤象甲成虫，室内饲养3d后，剔除死虫、病虫，备用；

供试寄主植物为紫花苜蓿。

致病力的测定

将球孢白僵菌XNBb-01至XNBb-10号菌株培养14d后，用无菌水收集孢子，配制成浓度为10⁸个孢子/ mL的孢子悬液。采用喷雾塔喷雾处理试虫，把处理后的试虫放在滤纸上把试虫身上多余的药液吸干，再将其放入直径90 mm的培养皿中，以100目纱网覆盖皿口，防虫逃逸，喂新鲜的苜蓿进行培养。每个菌株一个处理，每个处理4个重复，每个重复10头试虫，对照组采用喷无菌水处理，将苜蓿根瘤象甲和苜蓿叶片一起置于26士0.5℃的光照培养箱中(N:D=14:10)培养。每3天观察、统计死亡虫数，至12天后计算试虫死亡率，筛选出死亡率最高的菌株。

用DPS软件处理试验数据，求出毒力回归方程、计算其致死中浓度LC₅₀(medianlethal concent ration)和致死中时间LT₅₀(median lethal time)，据此分析该菌株的毒力。

室内毒力测定所得数据用Abbott公式进行校正：

死亡率（%）=（死亡虫数/处理试虫总数）×100%

校正死亡率（%）={（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）}×100%

致病力测定研究结果表明，所有菌株的侵染率与对照组相比差异显著。在喷施孢子悬浮液后第3d试虫的活动明显减少，取食量也开始下降，有些试虫开始死亡。在处理后第12d时浓度为10⁸个孢子/mL的孢子悬液时，各菌株侵染死亡率差异显著，其中，球孢白僵菌XNBb-01菌株对苜蓿叶象甲成虫校正侵染死亡率为91.89 %，球孢白僵菌XNBb-04菌株对苜蓿叶象甲成虫校正侵染死亡率为94.59 %，其余菌株校正侵染死亡率均在70% 以下。从总体而言，XNBb-01和XNBb-04菌株致病力较强。见表1。

2、产孢量的测定

将球孢白僵菌XNBb-01至XNBb-10号菌株分别配制成1×10⁸个孢子/mL的孢子悬液，分别取lmL孢子悬液滴入PDA培养基上，用三角玻璃棒涂匀，待2d至3 d长出菌丝后用直径为10mm的打孔器打取新鲜菌落，接种于PDA平板上，然后置于25 ℃培养箱中培养(N:D=14:10)。每个菌株5次重复。第20d加入质量浓度为0.1% 吐温-80无菌水并收集孢子，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，使孢子充分分散，制成孢子悬浮液，用血球记数板记数测定产孢量。

个菌株的产孢量见表2，生长20d后，菌株XNBb-04的产孢量最高，每皿达到3.29×10⁹个孢子，与其它菌株之间的产孢量差异显著。

3、孢子萌发率的测定

将球孢白僵菌XNBb-01至XNBb-10号菌株分别培养20d后，用无菌水收集孢子并制成悬液，用载玻片萌发法试验。将孢子悬液滴在无菌载玻片上，置于底部铺有滤纸的培养皿内，在皿内滴加无菌水保湿(保持相对湿度90%以上)，培养24h后镜检。每个菌株处理3个重复。

个菌株中，球孢白僵菌XNBb-01号和球孢白僵菌XNBb-04 菌株与其它菌株之间的孢子萌发率差异显著，其中球孢白僵菌XNBb-04号菌株的孢子平均萌发率最高，达到96.20%，球孢白僵菌XNBb-01号菌株孢子平均萌发率达到92.33 %，与其他菌株间孢子萌发率差异显著。见表3。

、结论

在筛选优良菌株时，致病性和产孢量的高低是重要的参考指标，孢子萌发率次之。在本发明中，浓度为10⁸个孢子/mL的孢子悬液不同菌株之间孢子萌发率差异显著。从产孢量和致病性上看，菌株XNBb-01号和XNBb-04较为优良，具有致病性强、产孢量较高的特点(表1、表2、表3)。综合比较各方面的因素，XNBb-04号菌株为最佳菌株，于2014年3月6日在中国武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，其菌株保藏号为CCTCC M 2014075。所述的球孢白僵菌Beaueria bassaria (Balsamo) Vuillemin菌株XNBb-04，属丝孢目，球孢白僵菌。

实施例3，该球孢白僵菌XNBb-04菌株的培养方法，按以下步骤进行：

第一步，一级菌种扩大培养：将球孢白僵菌XNBb-04菌株接入装有PDA斜面培养基的试管中，放入培养箱，在温度为24℃至28℃、相对湿度为70%至85%条件下培养，待菌丝长满斜面并产满孢子后得到一级菌株培养物；

第二步，二级菌种扩大培养：在无菌条件下，将培养好的一级菌株培养物的菌种孢子粉刮下，用无菌水配制成浓度为5×10⁷个孢子/mL的悬液，吸1mL接入盛有50mLPDB培养液的250mL三角瓶中，使培养液中孢子浓度为10⁶个孢子/mL，在温度为24℃至26℃、转速为160r/min条件下振荡培养48小时，转接入装有200mLPDB培养液的500 mL三角瓶中，继续振荡培养24小时至培养液中长满菌丝球得到二级菌株培养物；

第三步，三级菌种扩大培养：在无菌条件下，将二级菌种培养物的菌种按体积比菌株：固体培养基为1:15的接种量接入灭过菌的固体培养基中，在温度为20℃至23℃、相对湿度为70%至85%条件下培养15d，直到固体培养基上全部长满白色菌丝。

实施例4，作为实施例3的优选，第三步中固体培养基的配制方法为：按重量百分比计，将麦麸68%、米糠30%、黄豆粉1%和奶粉1%混匀，并加入麦麸、米糠、黄豆粉和奶粉总重量70%的水，搅拌均匀，灭菌即得。

球孢白僵菌XNBb-04菌株对苜蓿根瘤象甲的致病力测定。

生物测定是检测虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一，能为综合评价该真菌的生物防治潜力提供重要的参考依据。本发明就球孢白僵菌XNBb-04菌株对苜蓿根瘤象甲的致病力进行测定，以筛选出在防治时所用的最佳浓度。

供试昆虫与寄主植物：苜蓿根瘤象甲，采集苜蓿田间的苜蓿根瘤象甲成虫，室内饲养3d后，剔除死虫、病虫，备用。供试寄主植物为紫花苜蓿。

（1）供试菌株的处理

经纯化后获得的球孢白僵菌XNBb-04菌株，采用PDA平板，于26士0.5℃的恒温箱(N:D=14:10)中培养20天，加入质量浓度为0.1%吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再分别配成1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹个孢子/mL 3个浓度梯度孢子悬液待用。

菌株对苜蓿根瘤象甲的致病力测定

将不同浓度孢子悬液喷洒于苜蓿根瘤象甲上，对照喷洒无菌水，3天后开始计量苜蓿根瘤象甲死亡数目，每种浓度的孢子悬浮液处理为10头，4次重复。将苜蓿根瘤象甲和苜蓿叶片一起置于26士0.5℃的光照培养箱中(N:D=14:10)。至16天后计算试虫死亡率。

（3）球孢白僵菌XNBb-04菌株对苜蓿根瘤象甲的累计死亡率

接种后的第4d，各处理区的幼虫开始表现出发病症状，如苜蓿根瘤象甲的体色由灰黑色逐渐变为白色，随后可观察到虫体上有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现白色的孢子，最后苜蓿根瘤象甲死亡。表4为球孢白僵菌XNBb-04菌株悬液处理后苜蓿根瘤象甲成虫第4d、8d、12d、16d的累计死亡率，结果表明随着菌液浓度的增加，苜蓿根瘤象甲成虫的死亡率也增加，同一浓度下随着时间的增加，苜蓿根瘤象甲的死亡率也增加。

表4不同浓度的球孢白僵菌对苜蓿根瘤象甲的累计死亡率

在喷菌4 d后开始，有部分的成虫表现出感病反应，行动迟缓、进食明显减少或不进食的特征，随后开始出现死亡、僵化。表4为白僵菌对苜蓿根瘤象甲的致病力测定结果，表明球孢白僵菌XNBb-04处理苜蓿根瘤象后的校正死亡率随着处理浓度和处理时间的增加而增加，当处理浓度为1.65×10⁹个孢子/mL，处理时间为16天时校正死亡率达到100%。

本发明提供一种球孢白僵菌XNBb-04菌株，属半知菌门，丛梗孢目，丛梗孢科，白僵菌属。球孢白僵菌XNBb-04菌株是我国本土的一种昆虫病原真菌，能够进一步制备活体生物农药，由上述实施例可知，本发明的球孢白僵菌对苜蓿根瘤象甲虫有较好致病力作用，能够有效杀死苜蓿根瘤象甲虫，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理，对环境无污染、无残留，本发明球孢白僵菌XNBb-04菌株在防治害虫方面可以应用于各种生态环境，有利于环境保护。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

Claims (2)

1.一种球孢白僵菌XNBb-04菌株，其特征在于球孢白僵菌XNBb-04菌株于2014年3月6日保藏于典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2014075；其中：

球孢白僵菌XNBb-04菌株的形态学特征描述如下：菌落初呈白色平绒状，后变乳黄色粉末状，在马铃薯琼脂葡萄糖培养基培养条件下，菌落背面无色或黄色；分生孢子梗短小，无色，无隔膜，顶端曲折状延伸，单生或聚集成孢梗束，壁光滑，透明，瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，大小为96μm至142μm×4.9μm 至7.3μm ，平均大小为120μm×5.8μm；分生孢子呈球形、卵形、椭圆形，无色，单胞，大小为2.47μm至5.21μm×1.95μm 至3.63μm ，平均大小为3.16μm×2.65μm，无厚垣孢子。

2.一种根据权利要求1所述的球孢白僵菌XNBb-04菌株的培养方法，其特征在于按以下步骤进行：

第一步，一级菌种扩大培养：将球孢白僵菌XNBb-04菌株接入装有PDA斜面培养基的试管中，放入培养箱，在温度为24℃至28℃、相对湿度为70%至85%条件下培养，待菌丝长满斜面并产满孢子后得到一级菌株培养物；

第二步，二级菌种扩大培养：在无菌条件下，将培养好的一级菌株培养物的菌种孢子粉刮下，用无菌水配制成浓度为5×10⁷个孢子/mL的悬液，吸1mL接入盛有50mLPDB培养液的250mL三角瓶中，使培养液中孢子浓度为10⁶个孢子/mL，在温度为24℃至26℃、转速为160r/min条件下振荡培养48小时，转接入装有200mLPDB培养液的500mL三角瓶中，继续振荡培养24小时至培养液中长满菌丝球得到二级菌株培养物；

第三步，三级菌种扩大培养：在无菌条件下，将二级菌种培养物的菌种按体积比菌株：固体培养基为1:15的接种量接入灭过菌的固体培养基中，在温度为20℃至23℃、相对湿度为70%至85%条件下培养15d，直到固体培养基上全部长满白色菌丝；

其中：第三步中固体培养基的配制方法为：按重量百分比计，将麦麸68%、米糠30%、黄豆粉1%和奶粉1%混匀，并加入麦麸、米糠、黄豆粉和奶粉总重量70%的水，搅拌均匀，灭菌即得。

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