CN115747082B

CN115747082B - 一种白僵菌固体培养基及其应用

Info

Publication number: CN115747082B
Application number: CN202211668942.8A
Authority: CN
Inventors: 王兴红; 刘曼; 黄振兴; 罗丽林; 杨广明; 沈燕; 饶永超
Original assignee: Guizhou Institute of Biology
Current assignee: Guizhou Institute of Biology
Priority date: 2022-12-23
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2042-12-23
Also published as: CN115747082A

Abstract

本发明公开了一种白僵菌固体培养基及其应用，属于微生物技术领域。所述固体培养基包括：大米粉27.00‑74.25g/L，小麦粉13.00‑16.25g/L，NaNO₃ 0.07‑1.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.14‑1.25g/L，CaCO₃ 1.00‑1.25g/L以及琼脂15.00‑20.00g/L。本发明通过培养基原料筛选和优化，得到可以提高白僵菌菌落生长速度、产孢量的培养基和培养条件。本发明培养基的原料来源易得且廉价，多数地区可就地获得，制备流程简单，大大降低生产成本；产品质量稳定，菌株生长速度快，产孢量高，且对试虫3龄粗狭肋鳃金龟幼虫防治效果最佳，为大量生产白僵菌提供技术支持。

Description

一种白僵菌固体培养基及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种白僵菌固体培养基及其应用。

背景技术

白僵菌是目前世界上防治害虫应用较广的一类杀虫真菌，其杀虫谱广，对多种农林害虫具有致死作用，且致病力强，防治效果好，对环境、作物和温血动物无害，易于培养，是公认的很有前途的、应用最广泛的杀虫真菌。目前，已有几种具有代表性的真菌杀虫剂已经商业化并应用于农业。然而，与化学杀虫剂相比，真菌杀虫剂的市场份额非常低，这主要是由于缺乏合适的大规模繁殖技术。而高成本的培养原料是阻碍其商业化应用的一大障碍。因此需要寻求廉价的原料来替代基质来源，提高白僵菌杀虫剂的生产对防治农林害虫具有重大意义。

麻江白僵菌MJ1015菌株是分离自粗狭肋鳃金龟幼虫的一种虫生真菌。研究发现，该菌株孢子悬浮液浓度9.2×10⁸孢子/mL处理14d后，粗狭肋鳃金龟、暗黑鳃金龟、斑青花金龟3龄幼虫的校正死亡率分别是100.00％、94.64％、91.23％，且与其他两种相比，该菌株对粗狭肋鳃金龟3龄幼虫的致病力最强，说明MJ1015菌株具有生物防治应用的潜力，且具有寄主专一性，可进一步探究商业规模化生产致病效果稳定的白僵菌孢子粉，用于大面积防治地下害虫蛴螬。

白僵菌经济、快速地大量培养生产并能高产分生孢子粉是田间应用的前提，据报道，营养会影响白僵菌的产孢量。目前，液体发酵、固体发酵和液固两相发酵系统均可用于生物病原真菌的大规模生产。固体发酵方法操作简单，可产生稳定的分生孢子，能够侵染害虫，且易于保存，通常选用廉价且易获得的两种或两种以上混合的玉米粉、大豆粉、面粉、蚕蛹粉等作为培养原料，因此固体发酵法在白僵菌大量生产中成为首选方法。

聂以均，熊平和赵冬容公开了以麦麸、谷壳、玉米等多种农副产品混合为营养载体生产(湖北林业科技，1991，2:32-33)，但这种方法生产的菌粉不易分离出纯净孢子粉；陈孟，李英，王雪菲等选用大米做为白僵菌孢子粉的固体培养原料，同时添加KNO₃，该条件下大米固体发酵培养产孢量为16.25×10⁸个/g，但是培养天数较长，需要20天(林业与生态科学，2019，34(4)，414-418)。专利球孢白僵菌菌株及其培养方法，公开了选用大米、葡萄糖、蔗糖、黄豆饼粉和玉米粉等作为白僵菌培养原料，先从一至三级培养后再将三级种子液接种到固体培养基进行培养(CN 110093283 A)，操作繁琐，且整个流程时间长；专利球孢白僵菌三级培养基及其制备方法(CN 109628320 A)，利用浅盘发酵容易被坏境微生物污染，通风等控温管理人工成本高；孙佩、童文和龙燕梅(CN 110305801 A)和郑霞林、高一平、王小云等(CN 114438012 A)分别公开了以玉米粉、麦麸、谷壳等作为白僵菌培养基原料，虽缩短了培养周期，但菌袋质地柔软，不能形成固体发酵空间，未形成通气，不利于孢子生长，孢子粉培养时间长。以上文献均以廉价易得的农副产品作为白僵菌培养基质，在基质中添加无机盐等添加物，不仅能缩短培养周期，还能提高产孢量，但不同白僵菌菌株的大规模生产所需营养基质、培养条件和培养方法有所不同。因此，选用廉价易得的农副产品作为培养基原料，研发一种有针对性、简便地、高效地生产麻江白僵菌MJ1015菌株孢子粉的制备方法是本领域技术人员需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种白僵菌固体培养基及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过培养基组分和配比的筛选和优化，可以加速培养周期和提高分生孢子的产量，降低生产成本，此培养基及制备方法的原材料廉价易得，操作过程简单。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种白僵菌固体培养基，所述固体培养基包括以下浓度组分：大米粉27.00-74.25g/L，小麦粉13.00-16.25g/L，NaNO₃ 0.07-1.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.14-1.25g/L，CaCO₃ 1.00-1.25g/L以及琼脂15.00-20.00g/L。

优选的是，所述固体培养基包括以下浓度组分：大米粉58.46-69.80g/L，小麦粉13.00-16.25g/L，NaNO₃ 0.18-0.44g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.24-0.49g/L，CaCO₃ 1.00-1.25g/L以及琼脂粉18.00-20.00g/L。

优选的是，所述固体培养基包括以下浓度组分：大米粉64.70g/L，小麦粉13.00g/L，NaNO₃ 0.30g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.36g/L，CaCO₃ 1.00g/L以及琼脂20.00g/L。

本发明还提供利用所述的固体培养基培养白僵菌的方法，包括以下步骤：经过高温灭菌后的固体培养基，接入白僵菌，然后置于温度为20-30℃、相对湿度为65-95％、光周期为L/D＝0h/24h的条件下培养10-30d，得到白僵菌。

优选的是，温度为28-30℃、相对湿度为85-95％、光周期为L/D＝0h/24h的条件下培养14d。

优选的是，所述高温灭菌为120℃灭菌30min。

本发明还提供所述的固体培养基在提高白僵菌菌落生长速度方面的应用。

本发明还提供所述的固体培养基在提高白僵菌产孢量方面的应用。

本发明还提供所述的固体培养基在防治粗狭肋鳃金龟方面的应用。

优选的是，所述粗狭肋鳃金龟包括3龄粗狭肋鳃金龟幼虫。

本发明公开了以下技术效果：

本发明确定了麻江白僵菌MJ1015菌株固体发酵的营养成分及培养条件，确定了最利于提高白僵菌菌落生长速度、产孢量的培养基和培养条件，通过实验还发现，在最优条件培养的白僵菌能够有效防治3龄粗狭肋鳃金龟幼虫。本发明操作简单，原材料及人工成本低，安全；生产得到的孢子粉为绿色无污染的微生物杀虫剂，可为农业地下害虫防治长期使用。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1不同培养基对白僵菌菌落生长速度、产孢量及毒力的影响

1.试验材料

供试菌株：麻江白僵菌MJ1015菌株(保藏编号CGMCCNO.15090)，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。

供试试虫：3龄粗狭肋鳃金龟幼虫。

供试培养基：大米粉27.00g/L，小麦粉13.00g/L，NaNO₃ 1.00g/L，K₂HPO₄·3H₂O1.00g/L，CaCO₃ 1.00g/L，琼脂15.00g/L。

培养基的制备方法：利用电子天平称取大米粉27.00g，小麦粉13.00g，NaNO₃1.00g，K₂HPO₄·3H₂O 1.00g，CaCO₃ 1.00g，琼脂15.00g后，置于三角锥瓶后加入去离子水定容1000mL，pH为自然，拌匀，加塞、包扎，120℃灭菌30min后取出，置于超净工作台待其冷却至60℃左右，加入培养基体积1/1000的青霉素和硫代硫酸钠(质量比为1:2)两种抗生素的混合液，用无菌的玻璃棒搅拌混匀后取20-25mL倒入无菌的培养基中(直径9cm)，冷却获得白僵菌固体培养基。

2.试验方法

将白僵菌MJ1015菌株活化好后，制备成1×10¹⁰孢子/L的孢子悬浮液。取1μL的白僵菌孢子悬浮液接种到上述的固体培养基上，然后将接种后平板置于，温度为29℃，相对湿度为90％±1％、光周期为L/D＝0h/24h人工气候箱中培养14d后，测定MJ1015的菌落生长速度及产孢量，并将获得的孢子对试虫进行毒力测定。

(1)毒力测定

采用浸渍法接种，将供试幼虫在9×10¹¹孢子/L的孢子悬浮液中浸蘸3～5s，然后迅速取出，置于洁净滤纸上，让其爬行片刻，将其移入装有2/3体积无菌泥土(湿度18％)的100mL烧杯中，用纱布封好烧杯，然后置于温度为(26.5±1)℃、相对湿度为90％±5％、光周期为L/D＝0h/24h人工气候箱中饲养，每个烧杯放1头幼虫。接种后每2d定时观察、记录供试幼虫的死亡情况，将死虫移入铺有湿润滤纸的经高温灭菌培养皿中的载玻片上，置于相同条件下人工气候箱中继续培养，观察死亡虫体表面菌丝生长和孢子产生情况，连续观察14d，记录死亡虫数，以虫体表面长出菌丝或孢子为有效致死。设3个重复，每个重复处理20头金龟子幼虫，用0.05％ Tween-80溶液作空白对照。统计死亡率。

死亡率(％)＝(处理的总死虫数/处理的总虫数)×100；校正死亡率(％)＝[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]×100。

(2)菌落生长速率的计算

将培养14d后的菌落用游标卡尺十字交叉测量菌落生长直径并记录。计算公式：菌落生长速度(mm/d)＝菌落生长直径(mm)/培养时间(d)；菌落孢子量计算：用1cm²的灭菌打孔器从菌落中心距离边缘1/2处打取菌饼，每个处理取3个菌饼，置于20mL含有0.05％吐温-80的无菌水中，在旋涡振荡器上充分振荡混匀，制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子浓度，计算产孢量(孢子/L)。计算公式：孢子数/L＝N/5×25×10×10⁶×稀释倍数(N为5个中方格的孢子总数)。

实施例2

与实施例1的区别在于：供试培养基：大米粉33.75g/L，小麦粉16.25g/L，NaNO₃1.25g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1.00g/L，CaCO₃ 1.25g/L，琼脂16.00g。按照实施例1培养基的制备方法制备。

其它步骤均同实施例1。

实施例3

与实施例1的区别在于：供试培养基：大米粉58.45g/L，小麦粉13.00g/L，NaNO₃0.31g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.37g/L，CaCO₃ 1.00g/L，琼脂18.00g。按照实施例1培养基的制备方法制备。

其它步骤均同实施例1。

实施例4

与实施例1的区别在于：供试培养基：大米粉60.75g/L，小麦粉13.00g/L，NaNO₃0.23g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.29g/L，CaCO₃ 1.00g/L，琼脂19.00g。按照实施例1培养基的制备方法制备。

其它步骤均同实施例1。

实施例5

与实施例1的区别在于：供试培养基：大米粉64.70g/L，小麦粉13.00g/L，NaNO₃0.30g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.36g/L，CaCO₃ 1.00g/L，琼脂20.00g。按照实施例1培养基的制备方法制备。

其它步骤均同实施例1。

对上述实施例1-实施例5不同培养基培养的白僵菌菌落的生长速度、产孢量及毒力进行分析，结果如表1所示。

表1不同培养基对MJ1015菌株菌落生长速度和产孢量及毒力的影响

由表1可知，适合麻江白僵菌菌株MJ1015的最佳固态培养基比例配方：大米粉64.70g/L，小麦粉13.00g/L，NaNO₃ 0.30g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.36g/L，CaCO₃ 1.00g/L，琼脂20.00g，验证试验结果显示，固相培养基发酵的菌落平均生长速度分别比SDAY和PDA快85％和96％，产孢量分别是SDAY和PDA的43.90倍和9.65倍，且对试虫3龄粗狭肋鳃金龟幼虫的毒力最高，防治效果最佳。本发明筛选获得的白僵菌固体培养基提高了菌落生长速度，缩短了培养周期，提高了分生孢子的产量。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种白僵菌固体培养基，其特征在于，所述固体培养基包括如下（1）-（5）任一项所示的培养基：

（1）所述固体培养基的制备方法为：称取大米粉27.00 g，小麦粉13.00 g，NaNO₃1.00g，K₂HPO₄·3H₂O 1.00 g，CaCO₃ 1.00 g，琼脂15.00 g后，加入去离子水定容1000 mL，120℃灭菌30 min后取出，冷却至60℃，加入培养基体积1/1000的含青霉素和硫代硫酸钠的混合液，混匀后冷却获得白僵菌固体培养基；所述混合液中青霉素和硫代硫酸钠的质量比为1:2；

（2）所述固体培养基的制备方法为：称取大米粉33.75 g，小麦粉16.25 g，NaNO₃ 1.25g，K₂HPO₄·3H₂O 1.00 g，CaCO₃ 1.25 g，琼脂16.00 g后，加入去离子水定容1000 mL，120℃灭菌30 min后取出，冷却至60℃，加入培养基体积1/1000的含青霉素和硫代硫酸钠的混合液，混匀后冷却获得白僵菌固体培养基；所述混合液中青霉素和硫代硫酸钠的质量比为1:2；

（3）所述固体培养基的制备方法为：称取大米粉58.45 g，小麦粉13.00 g，NaNO₃0.31g，K₂HPO₄·3H₂O 0.37 g，CaCO₃ 1.00 g，琼脂18.00 g后，加入去离子水定容1000 mL，120℃灭菌30 min后取出，冷却至60℃，加入培养基体积1/1000的含青霉素和硫代硫酸钠的混合液，混匀后冷却获得白僵菌固体培养基；所述混合液中青霉素和硫代硫酸钠的质量比为1:2；

（4）所述固体培养基的制备方法为：称取大米粉60.75 g，小麦粉13.00 g，NaNO₃0.23g，K₂HPO₄·3H₂O 0.29 g，CaCO₃ 1.00 g，琼脂19.00 g后，加入去离子水定容1000 mL，120℃灭菌30 min后取出，冷却至60℃，加入培养基体积1/1000的含青霉素和硫代硫酸钠的混合液，混匀后冷却获得白僵菌固体培养基；所述混合液中青霉素和硫代硫酸钠的质量比为1:2；

（5）所述固体培养基的制备方法为：称取大米粉64.70 g，小麦粉13.00 g，NaNO₃ 0.30g，K₂HPO₄·3H₂O 0.36 g，CaCO₃1.00 g，琼脂20.00 g后，加入去离子水定容1000 mL，120℃灭菌30 min后取出，冷却至60℃，加入培养基体积1/1000的含青霉素和硫代硫酸钠的混合液，混匀后冷却获得白僵菌固体培养基；所述混合液中青霉素和硫代硫酸钠的质量比为1:2。

2.利用权利要求1所述的固体培养基培养白僵菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：在固体培养基中接入白僵菌，然后置于温度为20-30℃、相对湿度为65-95％、光周期为L/D=0 h/24 h的条件下培养10-30 d，得到白僵菌。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，温度为28-30℃、相对湿度为85-95％、光周期为L/D=0 h/24 h的条件下培养14 d。

4.如权利要求1所述的固体培养基在提高白僵菌菌落生长速度方面的应用。

5.如权利要求1所述的固体培养基在提高白僵菌产孢量方面的应用。