CN110157624B - 一种基于自动化种曲机的淡紫拟青霉规模化生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于自动化种曲机的淡紫拟青霉规模化生产方法。该方法首先将淡紫拟青霉M‑1接种到灭菌后的一级液体培养基中进行培养，得到一级液体菌种；将所述的一级液体菌种接种到以麸皮和玉米粉为主要原料的灭菌后的固体培养基中进行固态发酵，得二级固体菌种；采用自动化种曲机通过拌料、蒸料、接种、发酵培养、收料、粉碎的步骤对二级固体菌种进行大规模生产，最终获得淡紫拟青霉固体菌剂，该菌剂有效活菌数能达到15.6×109CFU/g，杂菌率<0.01％，水份含量为9.68％。本发明工艺简单且稳定，降低了劳动强度，减少了操作人员数量，制备的菌剂有效活菌数高且杂菌率极低，适用于淡紫拟青霉M‑1工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物农药加工技术领域，涉及一种基于自动化种曲机的淡紫拟青霉规模化生产方法，具体涉及一种采用三角瓶液态发酵、三角瓶固态发酵和种曲机固态发酵多相发酵相结合制备淡紫拟青霉固体菌剂的方法。
背景技术
植物线虫病是严重影响作物生长的主要病害之一，每年给全球农业造成高达千亿美元损失。我国也是受植物线虫病严重影响的国家之一，尤其是我国华南地区香蕉、柑橘、番茄、黄瓜和西瓜等热带果蔬线虫病害普遍发生，同时诱发枯萎病、青枯病和根腐病等多种土传病害，给农业生产带来了严重的损失。目前，化学防治仍然是植物线虫病害最主要的防治措施，但化学杀线剂的其生产和使用存在诸多问题，如成本高、毒性大、残留高、易污染环境、对人畜健康存在潜在威胁等问题。虽然生物防治的效率没有化学杀线剂快速、有效，但其具有稳定、经济、长效和相对安全的特点，起到了杀线增产、降低成本、保护生态平衡、减轻环境污染等作用。因此，生物防治已成为防治线虫研究的热点。防治植物线虫的生防微生物种类很多，主要包括真菌、细菌、放线菌等。淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)是一种广泛分布于土壤和植物根系的习居菌，被认为是最有前途的防治植物线虫病的生物介质。淡紫拟青霉能够寄生包括根结线虫、胞囊线虫在内的多种植物寄生线虫的卵、幼虫及成虫，侵染过程中通过菌丝机械压力和分泌的胞外酶(如几丁质酶、丝氨酸蛋白酶)联合作用，使线虫和虫体破裂而死，而且在代谢过程中能够产生具有杀线虫活性的物质，抑制线虫卵的孵化，并强烈抑杀二龄幼虫从而控制作物线虫病害。此外，淡紫拟青霉还能产生促进植物生长的生物活性物质。因此，淡紫拟青霉在植物线虫病的生物防治上具有巨大的潜力。
淡紫拟青霉在生物防治上虽然表现出巨大的潜力，同时市场需求量大，但大规模生产技术的不成熟以及产品货架期短是限制其工业化的主要因素。目前，我国淡紫拟青霉的生产以深层液体发酵为主。深层液体发酵具有生产容易控制、不易染杂菌、产量较大等优点，但是存在着一些明显的缺点，如生产成本高、连续搅拌带来能耗高、产品孢子含量不高、产品保质期时间短等。与深层液体发酵相比，固体发酵具有设备简单、成本低、环保节能、产物加工方便等优点。在产品上，采用固体发酵法生产的淡紫拟青霉制剂与液体发酵制剂相比具有耐存储、易运输以及田间防效更稳定的优点。目前，国内外学者普遍选择低值的农副产品作为淡紫拟青霉固体发酵的营养基质，如大米、糖蜜、甘蔗渣、果皮、麸皮、玉米粉、玉米秸秆等。汪军等人利用玉米粉、甘蔗渣、麸皮和壳聚糖为主要成分进行固体发酵淡紫拟青霉，产孢量最大可达8.22×1010个/g。Brand利用甘蔗渣分别与脱脂大豆饼和咖啡壳组合培养淡紫拟青霉产孢量最大达1.53×1010个/g。目前，国内外科研人员也已利用固体发酵技术将淡紫拟青霉进行实验室培养或小试生产制成相应菌剂，但是利用传统固体发酵技术(浅盘式)对淡紫拟青霉进行工业化生产存在极其关键的缺点：(1)易染杂菌：淡紫拟青霉规模化发酵步骤较多，培养周期长，接种及培养环境很难做到无菌，且淡紫拟青霉生长性能普遍低于空气中广泛分布的曲霉属的黑曲霉、黄曲霉等，因此，淡紫拟青霉规模化固体发酵经常容易受到曲霉属的污染；(2)劳动强度大：传统淡紫拟青霉固体发酵方式，是把原料混合后通过人工装填进浅盘后，灭菌、冷却后打散、接种、装盘、移入培养室培养等过程，导致劳动负荷大，工作效率低，人工成本高。此外，不同地理来源的菌株存在区域性差异，也限制了淡紫拟青霉菌剂田间防治效果的稳定性及应用。
发明内容
本发明针对淡紫拟青霉传统液体发酵和固体发酵的不足，选取在酿酒以及酱油行业应用成熟的大型固态发酵反应器(自动化种曲机)，通过在无菌密闭环境下对淡紫拟青霉培养，避免了杂菌干扰，配合自动化控制系统保证淡紫拟青霉培养的适宜环境，降低了劳动强度，减少了操作人员数量，很好的适应了现代产业化的需求。本发明针对我国华南地区气温高的特点以及淡紫拟青霉田间防治效果不稳定性，选取具有耐热特性且生长性能良好的菌株淡紫拟青霉M-1，根据生物学特性开展培养基配方和工艺条件研究，形成基于自动化种曲机的工业化独特发酵工艺。
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1是自主分离筛选获得的一株防治根结线虫的优良菌株，采用原位筛选的方法，从华南地区番茄根际线虫中分离获得，能耐高温且生防效果稳定。该菌株于2019年03月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC NO：60596。
本发明技术方案如下：
一种基于自动化种曲机的淡紫拟青霉规模化生产方法，其特征在于，将淡紫拟青霉M-1固体菌种接种到种曲机中，利用种曲机对淡紫拟青霉M-1进行发酵培养，得到淡紫拟青霉固体菌剂。
具体是先通过液体发酵制备淡紫拟青霉M-1一级液体菌种，再将一级液体菌种接种到固体发酵培养基中制备淡紫拟青霉M-1固体菌种，然后再将淡紫拟青霉M-1固体菌种接种到种曲机中，利用种曲机对淡紫拟青霉M-1进行发酵培养，得到淡紫拟青霉固体菌剂。
优选，包括以下步骤：
(1)一级液体菌种的制备：将活化的淡紫拟青霉M-1菌株接种于液体培养基，然后在恒温振荡器中150～180rpm、28～30℃震荡培养72～84h，得到一级液体菌种；
(2)二级固体菌种的制备：将一级液体菌种接种于含固体发酵培养基的三角瓶，在28～30℃静置培养，待菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养1.5～2.5d后进行扣瓶培养，总共培养5～7d，得到二级固体菌种；
(3)基于自动化种曲机的大规模发酵：采用自动化种曲机通过拌料、蒸料、接种、发酵培养、收料、粉碎的步骤对二级固体菌种进行大规模生产，得到淡紫拟青霉固体菌剂。
优选，所述的基于自动化种曲机的大规模发酵具体步骤为：
(1)拌料：将固体发酵培养基加入种曲机的卧式搅拌机，搅拌均匀后分装入培养盘，装盘厚度为1.5～2cm，铺平后将培养盘置于种曲机的培养室；
(2)蒸料：培养盘经灭菌后，排除蒸汽，通过循环水系统对培养室进行降温，冷却至30～35℃；
(3)接种：将二级固体菌种加入种曲存储罐，利用经过灭菌过滤后的压缩空气将固体菌种送入培养室，并通过循环风使固体菌种菌粉分布在每个培养盘表面；
(4)发酵培养：设定培养温度28～30℃、相对湿度90～95％以及通气量0.05MPa，培养过程保持常压，通过通入无菌空气进行加氧，通过喷雾装置对培养罐内进行加湿，通过循环水系统调节培养室内温度，发酵培养5～7d；
(5)收料：停止加湿和无菌空气，打开空压气阀门，风机转速为700～900rpm，在35～40℃下干燥24～48h，收料；
(6)粉碎：将所收物料进行粉碎，得到淡紫拟青霉固体菌剂。
优选，所述的固体发酵培养基配制步骤为：将麸皮与玉米粉按照1～5:1的质量比混匀，按料水比(质量比)1:0.65～0.75的比例加入水，按占干料重2.5～5％加入蔗糖，按占干料重0.1～0.5％加入尿素，按占干料重0.1～2％加入硫酸铵，混合均匀，得到固体发酵培养基。进一步优选，所述的固体发酵培养基配制步骤为：将麸皮与玉米粉按照1:1的质量比混匀，按料水比(质量比)1:0.67比例加入水，按占干料重4～5％加入蔗糖，按占干料重0.1％加入尿素，按占干料重0.1％加入硫酸铵，混合均匀，得到固体发酵培养基。
优选，所述的液体培养基每升含马铃薯浸出粉300g、葡萄糖20g，余量为水，pH自然。
优选，所述的二级固体菌种制备步骤中，一级液体菌种的接种量是5％m/m。
优选，所述的基于自动化种曲机的大规模发酵中的接种步骤中，二级固体菌种的接种量是0.1～0.5％m/m。进一步优选，二级固体菌种的接种量是0.5％m/m。
优选，所述的基于自动化种曲机的大规模发酵中的发酵培养步骤中，其培养温度28℃、相对湿度95％以及通气量0.05MPa，发酵培养7d。
所述的一级液体菌种制备中，将活化的淡紫拟青霉M-1菌株接种于液体培养基具体为：从活化的淡紫拟青霉M-1试管斜面培养基中挑取1环接种于液体培养基，液体培养基的装量为500mL三角瓶装100mL培养基。
所述的500mL三角瓶为500mL SCHOTT DURAN带挡板三角瓶。
优选，所述的基于自动化种曲机的大规模发酵中的收料步骤中，干燥是在35℃下干燥24h。
所述的基于自动化种曲机的大规模发酵中的拌料步骤中，培养盘为2cm高的不锈钢筛网。
优选，所述的基于自动化种曲机的大规模发酵中的蒸料步骤中，培养盘经高温高压蒸煮是在0.1MPa，121℃蒸煮20min。
优选，所述的基于自动化种曲机的大规模发酵中的蒸料步骤中，冷却温度为35℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明制备的淡紫拟青霉菌剂有效活菌数能达到15.6×109CFU/g，杂菌率<0.01％，水份含量为9.68％。
(2)原材料成本低：固体发酵培养基所用的主要原料麸皮和玉米粉来源广泛、价格低廉，大大降低了生产成本。
(3)杂菌率极低：现有淡紫拟青霉规模化发酵步骤较多，培养周期长，接种及培养环境很难做到无菌，且淡紫拟青霉生长性能普遍低于空气中广泛分布的曲霉属的黑曲霉、黄曲霉等，因此，现有淡紫拟青霉规模化固体发酵经常容易受到曲霉属的污染，而本发明选取在酿酒以及酱油行业应用成熟的大型固态发酵反应器(自动化种曲机)，使物料灭菌、接种、培养以及干燥均在无菌密闭的种曲机中进行，减少染杂菌几率，最终产品杂菌率<0.01％。
(4)劳动强度小：现有淡紫拟青霉固体发酵方式，是把原料混合后通过人工装填进浅盘后，灭菌、冷却后打散、接种、装盘、移入培养室培养等过程，导致劳动负荷大，工作效率低，人工成本高，而本发明采用自动化种曲机进行规模化生产，能将物料打散、接种后装盘、移入培养室、翻料等步骤省去，大大降低了劳动强度，减少了操作人员数量。
(5)菌剂防治效果稳定：本发明所用菌株淡紫拟青霉M-1是自主分离筛选获得的一株防治根结线虫的优良菌株，采用原位筛选的方法，从华南地区番茄根际线虫中分离获得，能耐高温且生防效果稳定。
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1，于2019年03月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为GDMCC NO：60596。
附图说明
图1是不同发酵基础培养基对淡紫拟青霉M-1产孢的影响。
图2是不同麸皮与玉米粉配比对淡紫拟青霉M-1产孢的影响。
图3是不同料水比对淡紫拟青霉M-1产孢的影响。
图4是速效碳源蔗糖含量对淡紫拟青霉M-1产孢的影响。
图5是不同速效氮源及含量对淡紫拟青霉M-1产孢的影响。
图6是不同培养温度对淡紫拟青霉M-1产孢的影响。
图7是不同发酵时间对淡紫拟青霉M-1产孢的影响。
图8是不同液体接种量对淡紫拟青霉M-1产孢的影响。
图9是不同固体接种量对淡紫拟青霉M-1产孢的影响。
图10是不同烘干温度对有效孢子数的影响。
图11是淡紫拟青霉M-1固体菌剂。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。以下实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
实施例1
1.1.1供试菌株
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60596。
1.1.2试剂
硫酸铵、尿素等试剂均为国产分析纯(AR)；葡萄糖、蛋白胨、琼脂均为生化试剂(BR)，均购于广东环凯生物科技有限公司。
1.1.3仪器
恒温振荡器(HZQ-X300C)；生化培养箱(SHP-080)；自动化种曲机(ZPG 550)
1.1.4培养基
试管斜面培养基：PDA合成培养基。
液体培养基：每升含马铃薯浸出粉300.0g，葡萄糖20.0g，余量为水，pH自然，混合均匀，灭菌即得。
1.2方法
1.2.1淡紫拟青霉固体发酵工艺流程
(1)一级液体菌种的制备
从活化好的淡紫拟青霉M-1试管斜面中挑取1环置液体培养基中，液体培养基的装量为500mL SCHOTT DURAN带挡板三角瓶装100mL液体培养基，然后在恒温振荡器中180rpm、28℃震荡培养72h。培养得到的菌液用于接种二级固体种子培养基。
(2)二级固体菌种的制备
按固体发酵培养基配方均匀混合物料和水，润料30min，然后分装入2L广口三角瓶，每个装料量为300.0g，121℃高温高压灭菌20min，摇碎后冷却，按5％(m/m)的接种量接种一级液体菌种，混匀后置入28℃培养室中静置培养，菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养，总共培养5～7d，得到二级固体菌种。
(3)基于自动化种曲机大规模发酵
1)按优化的固体发酵培养基配方，将物料和水加入卧式搅拌机，搅拌均匀后分装入不锈钢培养盘，装盘厚度为1.5～2cm，铺平后将培养盘装入小车并推入种曲机的培养室。2)蒸料：关闭培养室门，0.1MPa高温高压蒸煮20min，蒸料完成后，排除蒸汽，通过循环水系统对培养室进行降温，冷却至35℃。3)接种：将摇碎后的二级固体菌种加入种曲存储罐，利用经过灭菌过滤后的压缩空气将二级固体菌种送入培养室，并通过循环风使固体菌种菌粉分布在每个培养盘表面。4)发酵培养：设定培养温度为28℃、相对湿度为95％、通气量为0.05MPa，培养7d。培养过程保持常压，通过通入无菌空气进行加氧，通过喷雾装置对培养罐内进行加湿，通过循环水系统调节培养室内温度。5)收料：停止加湿和无菌空气，打开空压气阀门，调节烘干温度，风机转速为800rpm，对固体培养物干燥24h，打开培养室门，收料。6)粉碎：将所收物料进行粉碎，得到淡紫拟青霉固体菌剂。
1.2.2分生孢子的计数方法
准确称取10.00g淡紫拟青霉固体菌剂，装入含有90mL无菌水(含有0.1％Tween-80m/m)和20个直径为0.5cm的玻璃珠的250mL三角瓶中，180rpm充分震荡30min，得到孢子悬浮液，用血球计数板计数分生孢子量，重复3次。
1.2.3固体发酵培养基初筛
分别选取全部麸皮、麸皮和玉米粉(1:1m/m)、麸皮和黄豆粉(1:1m/m)、麸皮和豆粕粉(1:1m/m)、麸皮和米糠(1:1m/m)作为发酵基础培养基，分别将发酵基础培养基按料水比1:0.6(质量比)加入蒸馏水并混合均匀，润料30min后分装入500mL广口三角瓶，于121℃灭菌20min，摇碎后冷却，按5％m/m的接种量接入一级液体菌种，混匀后置入28℃培养室中静置培养，待菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养，总共培养7d后测定孢子数，每组3个重复。
淡紫拟青霉固体发酵对营养物质要求不高，发酵基础培养基组成多以农副产品为主，例如玉米粉、麸皮、大米、米糠、豆粕等，这些原材料供应稳定且价格低廉，同时能为淡紫拟青霉发酵提供适宜养分。发酵基础培养基初筛结果如图1所示。由图1可知，发酵基础培养基组成为麸皮和玉米粉时，分生孢子数最高，为8.68×109CFU/g；其次是玉米粉和米糠产孢量为7.06×109CFU/g，两者呈显著差异。由此可见，玉米粉是一种适合淡紫拟青霉M-1的营养物质，而麸皮和米糠除了提供营养物质外，增加孔隙度也是其重要功能。因此，适合淡紫拟青霉M-1固体发酵培养基的基质组成为麸皮和玉米粉。
1.2.4固体发酵培养基组成单因素实验
1)麸皮与玉米粉的比例对产孢的影响。
将麸皮与玉米粉分别按照质量比为0.25:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1的比例混合均匀，按料水比(质量比)1:0.6加入蒸馏水并混合均匀，润料30min后分装入500mL广口三角瓶，于121℃灭菌20min，摇碎后冷却，按5％m/m的接种量接入一级液体菌种，混匀后置入28℃培养室中静置培养，待菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养，总共培养7d后测定孢子数，每组3个重复。
结果见图2。由图2可知，淡紫拟青霉M-1均可在麸皮、玉米粉及他们之间不同配比的固体培养基中生长。麸皮和玉米粉质量比为1:1处理，整体菌丝生长较快，产孢最多，为8.81×109CFU/g，且与其他处理组有显著差异。在处理组中玉米粉过多或过少均不利于淡紫拟青霉M-1生产及产孢。麸皮和玉米粉质量比为4:1处理，菌丝生长较差，产孢能力也较差，这是因为玉米粉提供的营养不足。相反，麸皮和玉米粉质量为1:4处理，物料表面菌丝生长快，产孢多，但物料中间未长透，菌丝少，产孢少，分析原因可能是玉米粉过多，物料容易板结，透气性不足，而淡紫拟青霉M-1属于好氧菌，所以物料中间氧气不足，影响淡紫拟青霉M-1的生长及产孢。实验中同样发现，麸皮和玉米粉的细度对淡紫拟青霉M-1产孢有较大影响，麸皮应为粗麸，有利于增加透气性，玉米粉越细越好，有利于淡紫拟青霉M-1的吸收利用。
2)料水比对产孢的影响
将麸皮与玉米粉按照1:1的质量比混合均匀，改变料水比(质量比)分别为1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.67(预实验得出料水比1:0.67优于1:0.7)、1:0.8、1:0.9、1:1，将物料和水混合均匀，润料30min后分装入500mL广口三角瓶，于121℃灭菌20min，摇碎后冷却，按5％m/m的接种量接入一级液体菌种，混匀后置入28℃培养室中静置培养，待菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养，总共培养7d后测定孢子数，每组3个重复。
料水比主要通过影响固体发酵过程中通气性和孔隙度来影响固体发酵水平，是决定淡紫拟青霉固体发酵能否成功的重要因素。料水比对产孢的影响结果如图3所示。由图3可知，料水比(质量比)为1:0.67时，分生孢子数最高，为8.63×109CFU/g，与其他处理组有显著差异。这说明料水比(质量比)为1:0.67时物料的通气性和营养物质的转化到达最佳平衡，既可使固体物料基质保持疏松，有利于氧气的流通和热量的传递，又可为淡紫拟青霉M-1的生长提供营养，繁殖产生大量菌丝。料水比过低或者过高均不利于淡紫拟青霉M-1的产孢。料水比过低时，物料含水量大，物料底部和中部供氧不足，物料容易聚集成团，从而影响淡紫拟青霉M-1的生长。而料水比过高时，物料含水量小，不利于淡紫拟青霉M-1菌丝生长及产孢。
3)不同速效碳源含量对产孢的影响
将麸皮与玉米粉按照1:1的质量比混合均匀，按料水比(质量比)1:0.6比例加入水，按占干料重0％、1％、2％、3％、4％、5％和6％的添加量加入蔗糖，混合均匀，润料30min后分装入500mL广口三角瓶，于121℃灭菌20min，摇碎后冷却，按5％m/m的接种量接入一级液体菌种，混匀后置入28℃培养室中静置培养，待菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养，总共培养7d后测定孢子数，每组3个重复。
结果见图4，由图4可知，添加速效碳源蔗糖能促进淡紫拟青霉M-1产孢。当蔗糖添加量为4％和5％时，分生孢子数分别为10.47×109CFU/g和10.63×109CFU/g，两者差异不显著，但都与空白组呈显著差异。因为蔗糖价格高于麸皮和玉米粉，从成本上考虑，选取4％为最佳蔗糖添加量。添加速效碳源蔗糖能促进菌丝生长，提高产孢，分析原因可能是原料以麸皮和玉米粉为主，碳氮比较低，物料碳源主要为淀粉和纤维素等多糖，增加一定量蔗糖有助于提高碳氮比，且蔗糖为二糖，更容易被菌体所吸收利用，从而有利于淡紫拟青霉M-1菌丝生长及产孢。
4)不同速效氮源及含量对生长和产孢的影响
将麸皮与玉米粉按照1:1的质量比混合均匀，按料水比(质量比)1:0.6比例加入水，按占干料重0％、0.1％、0.2％和0.5％的添加量加入尿素，或按占干料重0.1％、0.5％、1％、2％的添加量加入硫酸铵，或同时按占干料重0.1％的添加量添加尿素和按占干料重0.1％的添加量添加硫酸铵，混合均匀，润料30min后分装入500mL广口三角瓶，于121℃灭菌20min，摇碎后冷却，按5％m/m的接种量接入一级液体菌种，混匀后置入28℃培养室中静置培养，待菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养，总共培养7d后测定孢子数，每组3个重复。
结果见表1和图5。由表1和图5可知，不同速效氮源及含量对淡紫拟青霉M-1生长和产孢有不同的影响。由表1可知，尿素添加量为0.1％、0.2％时，对菌丝生长有促进作用，能使菌丝快速扩张且菌丝很浓密，但当尿素添加量为0.5％时，会对淡紫拟青霉M-1生长有显著的抑制作用，只有极少量菌丝生长。少量添加硫酸铵对淡紫拟青霉M-1的无显著作用，而大量添加对其生长有抑制作用，添加量越大越明显。而同时添加0.1％尿素和0.1％硫酸铵时，对菌丝生长有促进作用，与单独添加0.1％和0.2％尿素无明显区别。由图5可知，单独添加尿素(0.2％)或硫酸铵(0.1％、0.5％、1％)均可有效提高产孢量，其中以硫酸铵添加量为0.1％和0.5％的处理最明显，两者无显著差异，但与其他处理有显著差异。而同时添加0.1％尿素和0.1％硫酸铵时，能有效提高产孢量，且对淡紫拟青霉M-1产孢的提高效果优于尿素和硫酸铵的单独添加效果。从对菌丝生长和产孢量这两方面综合因素考虑，添加速效氮源以同时添加尿素和硫酸铵比较合适，尿素添加量为0.2％，硫酸铵添加量为0.1％～0.5％。分析可知，适量尿素能促进淡紫拟青霉菌M-1丝生长，适量硫酸铵更偏向于促进淡紫拟青霉M-1产孢，而同时添加0.1％尿素和0.1％硫酸铵既能促进淡紫拟青霉菌菌丝M-1生长，也能促进产孢，分生孢子数能达到12.33×109CFU/g，其对产孢的促进效果更优于尿素和硫酸铵的单独添加效果。硫酸铵是微生物发酵的主要外加氮源，1.5％硫酸铵添加量能显著促进木霉的产孢量。
表1不同速效氮源及含量对淡紫拟青霉M-1生长的影响
注：CK组为尿素和硫酸铵添加量都为0％的处理组。
1.2.5培养基组成正交实验
根据单因素实验结果，以产孢子数为考察指标，设计5因素3水平的正交试验，共进行16次试验。因素水平见表2：
表2培养基组成正交因子水平表
具体实验流程为：将麸皮与玉米粉混合均匀，按料水比加入水，按占干料重添加尿素和/或硫酸铵，混合均匀，润料30min后分装入500mL广口三角瓶，于121℃灭菌20min，摇碎后冷却，按5％m/m的接种量接入一级液体菌种，混匀后置入28℃培养室中静置培养，待菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养，总共培养7d后测定孢子数，每组3个重复。
结果见表3。由表3可知，固体发酵培养基的最佳组合为A2B3C1D1E2，即麸皮：玉米粉质量为1:1、蔗糖量添加量5％(按占干料重)、尿素添加量0.1％(按占干料重)、硫酸铵添加量0.1％(按占干料重)、料水比(质量比)1:0.67，淡紫拟青霉M-1的分生孢子数最高，为14.7×109CFU/g。由极差分析可知，影响分生孢子数的主次因素为料水比>硫酸铵添加量>尿素添加量>麸皮和玉米粉比例>蔗糖添加量，其中料水比对分生孢子数影响最大。因此，在固体发酵过程中应严格控制料水比。
表3发酵培养基正交实验结果
1.2.6不同培养温度对产孢的影响
将麸皮与玉米粉按照1:1的质量比混合均匀，按料水比1:0.67(质量比)比例加入水，按占干料重0.1％加入尿素，按占干料重0.1％加入硫酸铵，按占干料重5％加入蔗糖，混合均匀，润料30min后分装入500mL广口三角瓶，于121℃灭菌20min，摇碎后冷却，按5％m/m的接种量接入一级液体菌种，混匀后分别置入22℃、25℃、28℃、31℃、34℃培养箱中培养，菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养，总共培养7d后测定孢子数，每组3个重复。
结果见图6。由图6可知，温度对淡紫拟青霉M-1发酵影响很大。在一定的温度范围内，随着温度的升高，淡紫拟青霉M-1产孢子量增加，在28℃时孢子形成率最高，与其他温度成显著差异，分生孢子数达到14.17×109CFU/g。而随着温度的继续增加，淡紫拟青霉产孢量减少。因为温度过高会加快水分散失，而对数期菌株生长快速，会放出大量热，使固体发酵培养基内部温度迅速上升，过热把菌落烧死，不利于菌株生长和孢子产生。温度过低菌株生长缓慢，延长了生产周期。因此，28℃是淡紫拟青霉M-1孢子形成的最适温度。
1.2.7不同发酵时间对产孢的影响
将麸皮与玉米粉按照1:1的质量比混合均匀，按料水比1:0.67(质量比)比例加入水，按占干料重0.1％加入尿素，按占干料重0.1％加入硫酸铵，按占干料重5％加入蔗糖，混合均匀，润料30min后分装入500mL广口三角瓶，于121℃灭菌20min，摇碎后冷却，按5％m/m的接种量接入一级液体菌种，混匀后置入28℃培养室中静置培养，待菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养。分别在不同发酵天数测定发酵物料中孢子数。发酵天数分别为5d、6d、7d、8d、9d、10d，每组3个重复。
固体发酵周期普遍为3～10d，发酵时间对微生物的生长繁殖有着重要影响。不同发酵时间对产孢的影响如图7所示。由图7可知，随着培养天数的增加，淡紫拟青霉M-1分生孢子数含量也越高。发酵前期淡紫拟青霉M-1主要以菌丝生长为主，从第4d分生孢子开始产生，第6d以后孢子数增加显著，培养7d以后，分生孢子增加幅度较小，且培养7d到10d的处理无显著差异。因此，发酵时间为7d较适合，此时分生孢子数达到14.50×109CFU/g。淡紫拟青霉发酵周期的不同可能是由于菌株生长性能及发酵工艺不同所引起的。
1.2.8不同接种量对产孢的影响
1)不同液体接种量对产孢的影响
将麸皮与玉米粉按照1:1的质量比混合均匀，按料水比1:0.67(质量比)比例加入水，按占干料重0.1％加入尿素，按占干料重0.1％加入硫酸铵，按占干料重5％加入蔗糖，混合均匀，润料30min后分装入500mL广口三角瓶，于121℃灭菌20min，摇碎后冷却，分别按1％、3％、5％、7％、9％m/m的接种量接入一级液体菌种，混匀后置入28℃培养室中静置培养，待菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养，总共培养7d后测定孢子数，每组3个重复。不同液体接种量对产孢的影响如图8所示。
2)不同固体接种量对产孢的影响
将麸皮与玉米粉按照1:1的质量比混合均匀，按料水比1:0.67(质量比)比例加入水，按占干料重0.1％加入尿素，按占干料重0.1％加入硫酸铵，按占干料重5％加入蔗糖，混合均匀，润料30min后分装入500mL广口三角瓶，于121℃灭菌20min，摇碎后冷却，按0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％m/m的接种量接入二级固体菌种，混匀后置入28℃培养室中静置培养，菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养，总共培养7d后测定孢子数，每组3个重复。不同固体接种量对产孢的影响如图9所示。
由图8和图9可知，接种方式及接种量对淡紫拟青霉M-1产孢的影响较大，固体接种方式比液体接种方式更有利于产孢。但由于整个工艺的设计，两种接种方式都需要。针对液体接种方式，随着接种量的增大，淡紫拟青霉M-1分生孢子数含量逐渐增加，当接种量为5％m/m时分生孢子数达到最大值，为14.47×109CFU/g，与其他接种量组有显著差异(除7％m/m接种量组)。随着接种量的进一步增加，淡紫拟青霉M-1分生孢子数开始下降。针对固体接种方式，随着接种量的增大，淡紫拟青霉M-1分生孢子数含量逐渐增加，当接种量为0.5％m/m时，分生孢子数达到最大值，为20.23×109CFU/g，随着接种量的增大，淡紫拟青霉M-1分生孢子数无显著变化。当接种量过小时，会延长发酵周期，增加能耗及人工成本，且会增加杂菌污染几率，影响菌剂产品质量。此外，从实际操作来看，菌种用量太少，不利于混匀。当接种量过大时，液体菌种积累了次级代谢产物，过多的代谢产物可能会影响产孢，且过大的液体接种量使发酵培养基的含水率增大，通气性降低，从而影响产孢。此外，接种量过大不利于菌体对营养的利用。但在本实验中固体接种量在达到最适接种量后，继续增大接种并未导致产孢量减少，分析原因可能为，一方面实验中0.9％m/m接种量并未达到过多接种的水平，另一方面固体菌种不会影响固体培养基通气性。因此，淡紫拟青霉M-1最佳液体接种量为5％m/m，最佳固体接种量为0.5％m/m。
1.2.9烘干温度对有效孢子数的影响
将已培养好的固体培养物均匀平铺在陶瓷浅盘中，置入鼓风干燥箱中，分别于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃进行烘干(即对应收料步骤：停止加湿和无菌空气，打开空压气阀门，温度设置调整为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，风机转速为800rpm，对固体培养物干燥)，至水分达到10％停止烘干，然后采用稀释涂布法测定有效孢子数，每组3个重复。
固体菌剂的干燥过程也是菌剂生产中最重要的环节，干燥效果直接影响最后成品菌剂的有效孢子数及使用效果。菌剂含水量是菌剂的主要检测指标，含水量过高则达不到产品要求，菌剂容易染杂菌，且产品保质期会大大缩短。菌剂含水量过低，会延长烘干时间，增加能耗且会导致菌剂活菌数过低。根据国内固体菌剂行业内普遍标准及实验室前期实验结果，选取10％为淡紫拟青霉M-1菌剂最终含水量。不同烘干温度对有效孢子数的影响如图10所示。由图10可知，采用不同烘干温度，固体菌剂含水量均能在24h后降低至10％以下，而采用60℃进行烘干，固体菌剂含水量降到10％以下只需12h。说明烘干温度越高菌剂的干燥效率也越高，60℃的烘干效率比35℃的烘干效率提高了1倍以上。采用不同烘干温度，固体菌剂中有效孢子数均有显著的降低趋势，其中烘干温度越高，固体菌剂中有效孢子数降低的越显著。未烘干菌剂的有效孢子数为20.70×109CFU/g，采用35℃进行烘干后有效孢子数为9.47×109CFU/g，与其他温度处理组有显著差异(除40℃处理组，8.47×109CFU/g)，比60℃烘干处理组的有效孢子数高了近4倍(1.97×109CFU/g)。综合考虑淡紫拟青霉M-1有效孢子数含量、生产效率、能耗及人工成本，采用35℃对菌剂进行烘干。
实施例2
淡紫拟青霉固体发酵工艺流程
优化的固体发酵培养基：麸皮与玉米粉按照1:1的质量比混合均匀，按料水比1:0.67(质量比)比例加入水，按占干料重5％％加入蔗糖，按占干料重0.1％加入尿素，按占干料重0.1％加入硫酸铵，混合均匀，润料30min，得到固体发酵培养基。
(1)一级液体菌种的制备
从活化好的淡紫拟青霉M-1试管斜面培养基中挑取1环置液体培养基中，液体培养基的装量为500mL SCHOTT DURAN带挡板三角瓶装100mL培养基，然后在恒温振荡器中180rpm、28℃震荡培养72h，得到一级液体菌种；培养得到的菌液用于接种二级固体种子培养基。
(2)二级固体菌种的制备
将固体发酵培养基分装入2L广口三角瓶，每个装料量为300.0g，于121℃灭菌20min，摇碎后冷却，按5％m/m的接种量接入一级液体菌种，混匀后置入28℃培养室中静置培养，待菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养2d后进行扣瓶培养，总共培养7d，得到二级固体菌种。
(3)基于自动化种曲机大规模发酵
将固体发酵培养基加入卧式搅拌机，搅拌均匀后分装入2cm高的不锈钢筛网培养盘，装盘厚度为1.5～2cm，铺平后将培养盘装入小车并推入种曲机的培养室。2)蒸料：关闭培养室门，将培养盘在0.1MPa，121℃高温高压蒸煮20min，蒸料完成后，排除蒸汽，通过循环水系统对培养室进行降温，冷却至35℃。3)接种：按接种量为0.5％m/m，将摇碎后的二级固体菌种加入种曲存储罐，利用经过灭菌过滤后的压缩空气将固体菌种送入培养室，并通过循环风使固体菌种菌粉分布在每个培养盘表面。4)发酵培养：设定培养温度为28℃、相对湿度为95％、通气量为0.05MPa，培养过程保持常压，通过通入无菌空气进行加氧，通过喷雾装置对培养罐内进行加湿，通过循环水系统调节培养室内温度，培养7d。5)收料：停止加湿和无菌空气，打开空压气阀门，温度设置调整为35℃，风机转速为800rpm，干燥24h，打开培养室门，收料。6)粉碎：将所收物料进行粉碎，得到淡紫拟青霉固体菌剂。
利用
自动化种曲机按照上述工艺进行3批规格为600kg的规模化生产，淡紫拟青霉M-1固体菌剂见图11所示，其质量如表4所示。由表4可知，淡紫拟青霉M-1固体菌剂有效活菌数能达到15.6×109CFU/g，高于实验室优化的最高有效活菌数，分析原因可能是自动化种曲机发酵过程中，物料通氧更充足，湿度控制更为精确。菌剂杂菌数为7.81×103CFU/g，杂菌率极低(<0.01％)，分析原因为：从物料灭菌、接种、培养到烘干都在同一反应器中进行，菌剂不易染杂菌。此外，菌剂水份含量为9.68％。由此说明，该工艺可用于淡紫拟青霉M-1工业化生产，且产品质量优异。
表4淡紫拟青霉M-1固体菌剂的质量
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种基于自动化种曲机的淡紫拟青霉规模化生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）一级液体菌种的制备：将活化的淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）M-1菌株接种于液体培养基，然后在恒温振荡器中150~180 rpm、28~30℃震荡培养72~84 h，得到一级液体菌种；所述的液体培养基每升含马铃薯浸出粉300 g、葡萄糖20 g，余量为水，pH自然；所述的淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）M-1菌株的保藏编号为GDMCC NO：60596；
（2）二级固体菌种的制备：将一级液体菌种按5% m/m的接种量接种于含固体发酵培养基的三角瓶，在28~30℃静置培养，待菌丝长满后进行摇瓶，摇碎结块，使物料疏松，继续培养1.5~2.5d后进行扣瓶培养，总共培养5~7 d，得到二级固体菌种；所述的固体发酵培养基配制步骤为：将麸皮与玉米粉按照1:1的质量比混匀，按料水比1:0.67比例加入水，按占干料重4~5%加入蔗糖，按占干料重0.1%加入尿素，按占干料重0.1%加入硫酸铵，混合均匀，得到固体发酵培养基；
（3）基于自动化种曲机的大规模发酵：采用自动化种曲机通过拌料、蒸料、接种、发酵培养、收料、粉碎的步骤对二级固体菌种进行大规模生产，得到淡紫拟青霉固体菌剂，具体步骤为：
S1拌料：将固体发酵培养基加入种曲机的卧式搅拌机，搅拌均匀后分装入培养盘，装盘厚度为1.5~2 cm，铺平后将培养盘置于种曲机的培养室；
S2蒸料：培养盘经灭菌后，排除蒸汽，通过循环水系统对培养室进行降温，冷却至30~35℃；
S3接种：将二级固体菌种加入种曲存储罐，二级固体菌种的接种量是0.5% m/m，利用经过灭菌过滤后的压缩空气将固体菌种送入培养室，并通过循环风使固体菌种菌粉分布在每个培养盘表面；
S4发酵培养：设定培养温度28℃、相对湿度95%以及通气量0.05MPa，培养过程保持常压，通过通入无菌空气进行加氧，通过喷雾装置对培养罐内进行加湿，通过循环水系统调节培养室内温度，发酵培养7d；
S5收料：停止加湿和无菌空气，打开空压气阀门，风机转速为700~900 rpm，在35~40℃下干燥24~48 h，收料；
S6粉碎：将所收物料进行粉碎，得到淡紫拟青霉固体菌剂。
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: No. 56, courtyard, No. 100, Xianlie Middle Road, Guangzhou, Guangdong 510070 Patentee after: Institute of Microbiology, Guangdong Academy of Sciences Country or region after: China Patentee after: GUANGDONG BOWOTE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: No. 56, courtyard, No. 100, Xianlie Middle Road, Guangzhou, Guangdong 510070 Patentee before: GUANGDONG INSTITUTE OF MICROBIOLOGY (GUANGDONG DETECTION CENTER OF MICROBIOLOGY) Country or region before: China Patentee before: GUANGDONG BOWOTE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |