CN107488592A - 淡紫拟青霉新菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

淡紫拟青霉新菌株及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种淡紫拟青霉新菌株及其制备方法和应用，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2016年12月28日，保藏编号为CGMCC No.13379。本发明包括以下制备步骤：制备淡紫拟青霉种子液；将种子液接入到固体增殖培养基中在无菌有氧条件下进行增殖培养，培养温度设定为25～45摄氏度，培养时间设定为5～10天；将增殖培养后的培养基进行干燥，得到淡紫拟青霉原菌菌剂。本发明提供的淡紫拟青霉新菌株应用于农作物线虫防治。该淡紫拟青霉新菌株具有良好的杀灭线虫卵的能力，经过测定，其发酵物中几丁质酶活性较高，可用于防治作物根部线虫病害。

Description

淡紫拟青霉新菌株及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物制备和土壤肥料领域，尤其涉及一种农用微生物制剂及其应用。
背景技术
植物寄生线虫是一类重要的植物病原物，在引起植物侵染性病害的四大病原中，其危害超过细菌和病毒，仅次于真菌病毒。据报道，植物寄生线虫每年造成世界农业生产损失约1000亿美元，其中根结线虫(Meloidogyne spp.)仅对世界上重要的经济作物每年造成的损失就达数百亿美元。其寄主范围广、危害严重，而且受害植物更易受真菌和细菌侵染，成为诱发植物其它病害的重要原因之一。根结线虫卵寄生真菌的研究历史不长，已报道的种类有70多种，目前研究最多的是淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus(Thom)Samson)。
淡紫拟青霉是土壤及多种植物根系的习居菌，是植物寄生线虫如孢囊线虫、肾形线虫、穿孔线虫等的重要天敌，淡紫拟青霉能够产生几丁质酶和丝氨酸蛋白酶，并通过这两种酶的作用破坏根结线虫卵壳，从而菌丝侵入根结线虫的卵并寄生于卵内，因此淡紫拟青霉是一种极具推广潜力的生防菌和功能菌。
淡紫拟青霉属半知菌纲、丝孢菌目、拟青霉属，在显微镜下观察可见淡紫拟青霉分生孢子梗和分支比青霉菌分散，分生孢子梗成干燥的向基部链，形成指头状分支。单孢卵圆形到纺锤形，无色，在固体平板培养基上，会长出扁平，淡紫色的特征菌落。在液体震荡培养条件下会形成菌球。淡紫拟青霉生长温度范围很宽，从8℃到38℃都可以生长，在15～30℃生长良好，最佳生长和产孢温度为25～30℃，6℃和40℃时停止生长，35℃时停止产孢。由于该菌是土壤习居菌，光照对其生长和产孢有一定的抑制作用，所以在完全黑暗条件下生长最佳，其次是黑暗和光亮交替，在光亮中也能生长。pH在2～12均能生长，菌丝生长最佳pH为6～9，产孢最佳pH为4～6，这样的广谱适宜温度和pH范围，使其在农业土壤中成为有竞争力的生物。淡紫拟青霉营养要求不高，碳水化合物、有机酸及低级醇类都可以作为其培养的碳源，其中以二糖为最佳，氮源可以是有机氮，也可以是NaNO3、NH4NO3等无机氮化合物。
如中国专利申请第201210358765.3号揭示的一株淡紫拟青霉及其应用，该专利申请所提供的淡紫拟青霉是淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)E16，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5951。该专利申请的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)E16CGMCC No.5951在盆栽实验中对2龄香蕉根结线虫的防治效果为86.37％，对香蕉根重的增长率为37.76％，对香蕉株高的增长率为56.47％，对香蕉地上部分的增长率为38.03％；小区实验中对香蕉根结线虫的防治效果为83.03％，对香蕉果实的增产率为28.05％。然而，该专利申请并未揭示该淡紫拟青霉的制备方法。
又如中国专利申请第201310644028.4号揭示的一株淡紫拟青霉菌及其应用，该专利申请的菌株淡紫拟青霉菌Paecilomyceslilacinus(Thom)Samson CGMCC No.7994。对番茄等的促生长作用：麦麸与水按1:1比例混合均匀，取适量菌株淡紫拟青霉菌Paecilomyceslilacinus CGMCC No.7994扩大培养后，制备麸皮菌剂。取长势一致的番茄苗，对其根部周围撒播菌剂处理。然而，该专利申请的淡紫拟青霉菌应用于促进番茄生长，并非提高其防止农作物线虫的性能。
再如中国专利申请第201410213157.2号揭示的一种淡紫拟青霉菌剂的制备方法，步骤是：(1)硅藻土、玉米粉和水按质量3:3:4混合得到固体培养基；(2)发酵：超净台里以每200mlPDB种子菌液加入0.5kg固体培养基中，菌液中孢子浓度为1010-1011cfu/ml，搅拌均匀后，按厚度2.4-2.6cm装入容器中，容器封口并通氧，消毒，温度25-28℃湿度25％-35％培养，发酵7d-10d得到固体发酵物；(3)制成颗粒。该专利申请同时还公开了一种淡紫拟青霉菌剂的发酵装置，在浅盘侧壁设置小孔，无菌棉球或硅胶塞堵住小孔，用橡皮筋将塑料薄膜箍在浅盘的盘口边沿密封。然而，该专利申请的淡紫拟青霉菌剂的制备方法制备得到的为普通常见的淡紫拟青霉菌，并不能改善其杀线虫卵性能。
因此，提供一种能够显著提升杀线虫卵性能的淡紫拟青霉依然是业内急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种淡紫拟青霉新菌株及其应用，该淡紫拟青霉新菌株具有十分显著的杀线虫卵性能。
根据本发明的第一方面，提供一种淡紫拟青霉新菌株(Paecilomyceslilacinus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2016年12月28日，保藏编号为CGMCC No.13379。
根据本发明的第二方面，提供一种含有淡紫拟青霉新菌株的菌剂。
可选择地，该含有淡紫拟青霉新菌株的菌剂，其中淡紫拟青霉新菌株的活菌数至少为10亿/克，优选30亿/克。
根据本发明的第三方面，提供一种含有淡紫拟青霉新菌株的菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备淡紫拟青霉种子液。(2)将步骤(1)的种子液接入到固体增殖培养基中在无菌有氧条件下进行增殖培养，培养温度设定为25～45摄氏度，培养时间设定为5～10天。(3)将步骤(2)增殖培养后的培养基进行干燥，得到淡紫拟青霉原菌菌剂。
优选地，步骤(1)中的淡紫拟青霉种子液的制备包括步骤：(1.1)在无菌操作台上将冻干管内的淡紫拟青霉菌种接入到PDA培养基中培养3～7天得到淡紫拟青霉健康菌落，培养温度设定为20～30摄氏度。(1.2)将淡紫拟青霉健康菌落接入营养琼脂培养基中在20～30摄氏度条件下培养3～7天。(1.3)挑选发育健康菌种备用。(1.4)将备用健康菌种接入到经过灭菌的液体培养基培养2～5天，获得淡紫拟青霉种子液，液体培养基的转速设定为120转/分钟～180转/分钟、温度设定为38～45摄氏度。
可选择地，淡紫拟青霉种子液的制备步骤(1.4)中的液体培养基按重量份计包含：蔗糖5～15、氯化钠3～10份、牛肉膏5～15份、氯化钙3～8份、磷酸二氢钾0.2～1.0份、三氯化铁0.01份、酵母膏1～4份、水1000份。优选地，液体培养基按重量份计包含：蔗糖8～12份、氯化钠4～7份、牛肉膏8～12份、氯化钙4～6份、磷酸二氢钾0.25～0.4份、三氯化铁0.01份、酵母膏1.5～3份、水1000份。
可选择地，步骤(2)的固体增殖培养基按重量份计包含：麦麸50～100份、玉米芯粉10～40份、红糖1～10份、豆饼5～20份、氯化钙1～3份、氯化钠1～3份。
可选择地，步骤(2)的固体增殖培养基设定为pH7.0～7.5。
根据本发明的第四方面，提供一种淡紫拟青霉新菌株在农作物线虫防治中的应用。
可选择地，线虫包括根结线虫、胞囊线虫、茎线虫或干尖线虫中的至少一种。
若无特别说明，本发明中提到的“份”是指“重量份”。
其中，本发明提供的淡紫拟青霉新菌株是自然环境中提取并通过长期筛选、纯化、驯化而获得生产性能和代谢活性稳定的菌株。经过测定，本发明提供的淡紫拟青霉新菌株的发酵物中几丁质酶和丝氨酸蛋白酶活性较高，具有破坏根结线虫卵壳的特效。
研究人员在自然环境中，取植物根部土壤通过选择培养基培养，取符合淡紫拟青霉特征的菌种并在显微镜下检查，证明为单一菌体后通过反复分离和大量菌株重复性培养筛选，获得菌株。菌株通过菌落形态、显微形态特征等确定该菌株符合淡紫拟青霉的特征，并通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心核准保藏。
本发明的有益效果是：(1)、本发明提供了一种淡紫拟青霉新菌株，其具有十分显著的杀线虫卵性能，且对人畜无毒无害；(2)、本发明提的淡紫拟青霉新菌采用液体+固体联合发酵方法进行制造增殖，与传统的液体发酵吸附成固体制剂的方式相比，该方法进行菌种增殖的效率更高、其产品的生物活性更好，保存期更长，在常温下可以保存长达12个月以上；(3)、经过测定，本发明的淡紫拟青霉新菌株对大多数作物自然根部存在的微生物无明显的拮抗性，即该含有淡紫拟青霉新菌株的菌剂的通用和与其他菌株的配伍性很好；(4)、本发明提供的淡紫拟青霉新菌株具有良好的杀灭线虫卵的能力，经过测定，其发酵物中几丁质酶活性较高，可用于防治作物根部线虫病害。
保藏信息
本发明分离鉴定的淡紫拟青霉新菌株(Paecilomyces lilacinus)，命名为PL-FWJ01，已于2016年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.13379。
附图说明
图1为本发明的淡紫拟青霉新菌株的菌剂制备流程图。
具体实施方式
如图1所示，根据本发明的一种非限制性实施方式，提供了一种含有淡紫拟青霉新菌株的菌剂的制备方法，包括以下步骤。
步骤S1：在无菌操作台上将冻干管内的淡紫拟青霉菌种接入到PDA培养基中培养5天得到淡紫拟青霉健康菌落，培养温度设定为约28摄氏度。
步骤S2：将淡紫拟青霉健康菌落接入营养琼脂培养基中在约28摄氏度条件下培养5天。
步骤S3：挑选发育健康菌种备用。
步骤S4：将备用健康菌种接入到经过灭菌的液体培养基培养4天，获得淡紫拟青霉种子液，液体培养基的转速设定为150转/分钟、温度约为38～45摄氏度。得到淡紫拟青霉种子液。
步骤S5：将淡紫拟青霉种子液接入到固体增殖培养基中在无菌有氧条件下进行增殖培养，培养温度约为42摄氏度，培养7天。
步骤S6：将增殖培养后的培养基进行干燥，得到淡紫拟青霉原菌菌剂。
作为一种可替代实施方式，步骤S4中的液体培养基按重量份计约包含：蔗糖10份、氯化钠5份、牛肉膏10份、氯化钙5份、磷酸二氢钾0.5份、三氯化铁0.01份、酵母膏2份、水1000份。
作为一种可替代实施方式，步骤S5中的固体增殖培养基按重量份计约包含：麦麸80份、玉米芯粉25份、红糖5份、豆饼12份、氯化钙2份、氯化钠2份。
作为一种可替代实施方式，步骤S5中的固体增殖培养基设为pH7.0。
下面将结合具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
淡紫拟青霉的鉴定
本发明的淡紫拟青霉具有如下菌落形态及形态：
(1)在麦芽汁琼脂培养基(MEA)上菌落生长快，28℃黑暗条件下培养5天，菌落直径40-50mm；(2)菌落初期呈白色，之后菌落由白色逐渐变为浅粉色至浅紫色，质地絮状，无水溶性色素；(3)在显微镜下观察可见淡紫拟青霉分生孢子梗和分支比青霉菌分散，分生孢子梗成干燥的向基部链，形成指头状分支；(4)单孢卵圆形到纺锤形、无色，在固体平板培养基上，会长出扁平、淡紫色的特征菌落。
上述特征均符合淡紫拟青霉的特征。
测定本发明淡紫拟青霉的DNA序列，该序列与已知的淡紫拟青霉DNA序列的同源性较高。
通过上述特征可以确定本发明分离得到的菌株确为淡紫拟青霉。
实施例2
淡紫拟青霉原菌菌剂的制备
本发明采用液体+固体联合发酵培养工艺进行淡紫拟青霉的培养，通过先液体增殖培养再接入到固体培养物增殖培养，所形成的菌剂具有很强的生物酶活性。具体步骤包括以下步骤。
种子制备及液体增殖培养：将保存有淡紫拟青霉的冻干管进行活化，具体方法是先在无菌操作台上将冻干管内的菌种接入到PDA培养基的斜面中在28℃进行培养5天。在获得健康菌落后，将其接入营养琼脂培养基，约28℃条件下培养5天后，挑选发育健康菌种接入到经过灭菌的液体培养基，在150r/min、约42℃条件下培养3天，获得淡紫拟青霉种子液。其中，液体培养基中按重量份计约包含：蔗糖10份、氯化钠5份、牛肉膏10份、氯化钙5份、磷酸二氢钾0.5份、三氯化铁0.01份、酵母膏2份、水1000份。
固体增殖培养：将种子液接入到pH7.0的固体培养基，在28℃的无菌有氧条件下固体增殖培养7天。其中，固体培养基按重量份计约包含：麸皮52份、玉米芯粉30份、红糖5份、豆饼10份、氯化钙1.5份、氯化钠1.5份，种子液接入前固体培养基经过120℃以上高温灭菌。
干燥处理：固体增殖培养完毕后将其放于干燥室进行常温干燥。干燥后的发酵物经过平板计数法检测有效活菌数为30亿/克，作为原菌制剂包装入库保存。
尽管在此已详细描述本发明的优选实施方式，但要理解的是本发明并不局限于这里详细描述和示出的具体结构和步骤，在不偏离本发明的实质和范围的情况下可由本领域的技术人员实现其它的变型和变体。此外，本发明中的温度、浓度或时间等参数可以根据具体使用条件在本发明所公开的范围内适当选取。

Claims (10)

1.一种淡紫拟青霉新菌株(Paecilomyces lilacinus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2016年12月28日，保藏编号为CGMCCNo.13379。
2.一种含有如权利要求1所述的淡紫拟青霉新菌株的菌剂。
3.如权利要求2所述的含有淡紫拟青霉新菌株的菌剂，其中所述淡紫拟青霉新菌株的活菌数至少为10亿/克。
4.如权利要求2或3所述的含有淡紫拟青霉新菌株的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备淡紫拟青霉种子液；
(2)将步骤(1)的种子液接入到固体增殖培养基中在无菌有氧条件下进行增殖培养，培养温度设定为25～45摄氏度，培养时间设定为5～10天；
(3)将步骤(2)增殖培养后的培养基进行干燥，得到淡紫拟青霉原菌菌剂。
5.如权利要求4所述的淡紫拟青霉新菌株的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的淡紫拟青霉种子液的制备包括步骤：
(1.1)在无菌操作台上将冻干管内的淡紫拟青霉菌种接入到PDA培养基中培养3～7天得到淡紫拟青霉健康菌落，培养温度设定为20～30摄氏度；
(1.2)将淡紫拟青霉健康菌落接入营养琼脂培养基中在20～30摄氏度条件下培养3～7天；
(1.3)挑选发育健康菌种备用；
(1.4)将备用健康菌种接入到经过灭菌的液体培养基培养2～5天，获得淡紫拟青霉种子液，液体培养基的转速设定为120转/分钟～180转/分钟、温度设定为38～45摄氏度。
6.如权利要求5所述的含有淡紫拟青霉新菌株的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1.4)的液体培养基按重量份计包含：蔗糖5～15、氯化钠3～10份、牛肉膏5～15份、氯化钙3～8份、磷酸二氢钾0.2～1.0份、三氯化铁0.01份、酵母膏1～4份、水800～1000份。
7.如权利要求4所述的含有淡紫拟青霉新菌株的菌剂的制备方法，其特征在于，所述固体增殖培养基按重量份计包含：麦麸50～100份、玉米芯粉10～40份、红糖1～10份、豆饼5～15份、氯化钙1～3份、氯化钠1～3份。
8.如权利要求4所述的含有淡紫拟青霉新菌株的菌剂的制备方法，其特征在于，所述固体增殖培养基设定为pH7.0～7.5。
9.如权利要求1所述的淡紫拟青霉新菌株在农作物线虫防治中的应用。
10.如权利要求9所述的淡紫拟青霉新菌株的应用，其特征在于，所述线虫包括根结线虫、胞囊线虫、茎线虫或干尖线虫中的至少一种。
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