CN108315284A - 一种产蛋白酶、抗番茄灰霉病菌的沙福芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产蛋白酶、抗番茄灰霉病菌的芽孢杆菌菌株，该菌株分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)SH180，于2018年4月8日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC15565。所述菌株具有促进生物生长，产蛋白酶，抗番茄灰霉病的作用。该菌株应用于生产中，对于番茄产量的提高，减少农药对灌溉水体的危害，降低耐药菌的产生有重要意义。

Description

一种产蛋白酶、抗番茄灰霉病菌的沙福芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物菌株及其应用，具体涉及一种具有抗番茄灰霉病、产蛋白酶的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)SH180及其产蛋白酶及抗番茄灰霉病的应用。

背景技术

番茄作为我国主要的经济果蔬之一，在我国广泛种植，但是随着种植的推广，许多问题也就逐渐凸显。例如，果农在大棚中连续种植番茄，大棚中温暖湿润的环境，容易引发番茄灰霉病等真菌性感染。若使用化学药物，易造成农药在果实表面残留过多，增加食用风险。另外，在灌溉的过程中，农药溶解在水中随之进入自然环境，还可能污染水体。另一方面，追求高产的菜农可能大量使用化肥，导致土壤板结、肥力下降，不能为植物生长供给足够的营养。国内外报道的根际促生菌PGPR种类繁多，细菌的生长繁殖及活动不但能够促进番茄更好地吸收利用土壤中的养分，微生物的活动还可以使土壤松动，缓解板结的现象。PGPR还能增强植物对病害的抗性，有些细菌更能够改善被重金属、农药等污染的土壤环境。微生物种类繁多、分布广泛、代谢繁殖速度快，为微生物肥料的大量生产和广泛应用提供了良好的前提条件。

番茄种植广泛，但易发病，番茄灰霉病是其中一种常见病害。番茄灰霉病病原菌为半知菌亚门的灰葡萄孢菌，病原菌的孢子可以借气流、雨水和人类生产活动等多种方式进行传播。灰霉病的空间传播性很强，低温高湿气候下易发病，番茄叶、茎、果实都可能被感染，叶片发病部位成灰褐色“V”字形病斑，表面生有灰白色霉层；茎部多发生在分枝处或基部，有水渍状斑点或淡褐色大斑，严重的绕茎一周，病枝折断；果实腐烂，密生灰色霉层，传播速度快。一旦发病，造成严重减产，可使产量减少20％-50％。现在我国生产栽培的植株都是非抗病基因型，虽然市面有售一些防治灰霉病的化学药剂，但是灰霉病的遗传存在异核现象，在化学药剂选择作用下有一定抗药性的菌株会大量繁殖，导致各种药剂的防治效果逐渐下降，最后丧失效果。近年来，国内外众多学者都专注于研究抗番茄灰霉病的各种药剂，以防治番茄灰霉病。

蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，能催化蛋白质和多肽水解，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。目前，关于芽孢杆菌抑制番茄灰霉病的报道较多，但关于同时具有产蛋白酶、抗番茄灰霉病菌和显著促生作用的芽孢杆菌报道却较少。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种沙福芽孢杆菌株(Bacillussafensis)SH180，本发明的菌株具有产蛋白酶的作用，发酵液蛋白酶活性能够达到244.18μg/mL，所产生蛋白酶可以降解土壤中的蛋白质来增加土壤中的氨基酸含量，氨基酸肥料对植物生长有着促进作用，将该菌株应用于番茄培育中，对于提供蛋白酶产率，防治番茄灰霉病菌有重要意义。

为了实现以上技术目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明目的之一在于提供一种芽孢杆菌，该菌株分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)SH180，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年4月8日，保藏编号：CGMCC15565。该菌株的16S rRNA基因序列见SEQ NO.1。

沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)SH180的生理生化特征为：淀粉水解试验阴性，伏-普试验阴性，丙酸盐利用试验阳性，明胶液化试验阳性，接触酶试验阳性，吲哚产生试验阴性，柠檬酸盐利用试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，运动性试验阳性，阿拉伯醇试验阴性，卫矛醇试验阴性，葡萄糖发酵试验阳性，蔗糖发酵试验阳性，甘露糖发酵试验阳性，鼠李糖发酵试验阴性，棉籽糖发酵试验阴性，硫化氢产生试验阴性，尿素酶试验阴性。

优选的，经培养基优化，确定本发明菌株最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是豆粕粉，最佳无机盐是FeSO₄·7H₂O，利用正交试验，确定最佳培养基配方。最佳培养基：4％葡萄糖，2％豆粕粉，0.003％FeSO₄·7H₂O。

本发明的芽孢杆菌能明显抑制番茄生长时期灰霉病害，促进番茄生长。

本发明的目的之二在于提供沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)SH180的培养方法，该芽孢杆菌在LB平板培养基上培养24h后菌落呈圆形，白色，凸起，湿润，不透明；菌体呈长杆状。优选的，所述培养基的组成为0.5％酵母浸膏，1％蛋白胨，1％氯化钠，1.6％琼脂，蒸馏水，121℃灭菌20min，pH7.0。

本发明的目的之三在于提供一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含上述沙福芽孢杆菌株(Bacillus safensis)SH180的培养物。

优选的，微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。

进一步的，微生物菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。

本发明的目的之四在于提供一种促生菌发酵液的制备方法，步骤如下：将沙福芽孢杆菌株(Bacillus safensis)SH180转接到装有5ml液体培养基的试管中，放在恒温摇床中培养12-14h，温度：37℃，转速：180-200rpm；将活化好的菌液按1％接种量接入到100-200mL培养基中，放入摇床培养24h，温度：37℃，转速：180-200rpm，制成发酵液。经研究表明，在盆栽条件下，用本发明的产蛋白酶、抗番茄灰霉病菌的芽孢杆菌的发酵液在番茄定苗后灌根处理，在土壤中能产生蛋白酶，增强番茄的根系活力，促进番茄株高、根长、地径的生长，提高植株生物量，增加番茄茎叶干湿重，抗番茄灰霉病害，提高番茄产量。

本发明目的之五在于提供上述促生菌发酵液的使用方法，在番茄定苗后，取制备好的发酵液稀释后灌根处理，盆栽试验中每株5mL。

本发明目的之六在于提供一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物中包含上述微生物菌剂、促生菌发酵液中的一种或组合。

本发明目的之七在于保护上述菌株、微生物菌剂及药物组合物在降解土壤中蛋白质变成植物可直接吸收利用的氮源，从而促进植物生长、抗番茄灰霉病菌方面的应用。

本发明的有益效果

本发明通过提供了一种新的菌株，沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)SH180。本发明的菌株具有提高土壤中氨基酸含量、促进生物生长、抗番茄灰霉病的作用。该菌株的发酵液在番茄生长初期进行灌根处理，番茄株高、根长、地径以及茎叶干湿重较对照组均有很大的增加，达到了显著或极显著差异。有效提高产量的同时降低病虫害的发生，降低农药在生产中的使用，对于环境保护也具有重要意义。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1 SH180的镜检照片；

图2 SH180的平板菌落特征图；

图3 SH180的产蛋白酶能力图；

图4 SH180的盆栽实验促生效果对比图；

图5 SH180对番茄灰霉病菌拮抗性效果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一个具体实施方式中，提供一株芽孢杆菌，该菌株分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)SH180，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年4月8日，保藏编号：CGMCC15565。该菌株的16S rRNA基因序列见SEQ ID NO.1，菌落形态形态见图2。

该沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)SH180的生理生化特征为：淀粉水解试验阴性，伏-普试验阴性，丙酸盐利用试验阳性，明胶液化试验阳性，接触酶试验阳性，吲哚产生试验阴性，柠檬酸盐利用试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，运动性试验阳性，阿拉伯醇试验阴性，卫矛醇试验阴性，葡萄糖发酵试验阳性，蔗糖发酵试验阳性，甘露糖发酵试验阳性，鼠李糖发酵试验阴性，棉籽糖发酵试验阴性，硫化氢产生试验阴性，尿素酶试验阴性。

该菌株最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是豆粕粉，最佳无机盐是FeSO₄·7H₂O，利用正交试验，确定最佳培养基配方。最佳培养基：4％葡萄糖，2％豆粕粉，0.003％FeSO₄·7H₂O。

本发明的又一具体实施例，提供沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)SH180的培养方法，该芽孢杆菌在LB平板培养基上培养24h后菌落呈圆形，白色，凸起，湿润，不透明；菌体呈长杆状。所述培养基的组成为0.5％酵母浸膏，1％蛋白胨，1％氯化钠，1.6％琼脂，蒸馏水，121℃灭菌20min，pH7.0。

本发明的又一具体实施方式，提供一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含上述沙福芽孢杆菌株(Bacillus safensis)SH180的培养物。微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。

作为优选，微生物菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种促生菌发酵液的制备方法，步骤如下：将沙福芽孢杆菌株(Bacillus safensis)SH180转接到装有5ml液体培养基的试管中，放在恒温摇床中培养12-14h，温度：37℃，转速：180-200rpm；将活化好的菌液按1％接种量接入到100-200mL培养基中，放入摇床培养24h，温度：37℃，转速：180-200rpm，制成发酵液。

本发明的又一具体实施例中，提供上述促生菌发酵液的使用方法，在番茄定苗后，取制备好的发酵液稀释后灌根处理，盆栽试验中每株5mL。

本发明的又一具体实施例中，提供一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物中包含上述微生物菌剂、促生菌发酵液中的一种或组合。

本发明的又一具体实施例中，提供上述菌株、微生物菌剂及药物组合物在提高蛋白酶产率、抗番茄灰霉病菌方面的应用。

实施例1 SH180促进植物生长能力测定

选用CK菌株作为对照，试验采用营养盘种植方式，于自然土中进行，在育苗基质中培育至5-6片真叶，选取健康、长势均一的番茄苗备用。灌根的方式处理番茄苗，方法如下：移苗后待幼苗长势稳定，7天后用菌剂处理5株幼苗(1株/盆)，每株施加5mL促生菌发酵液(浓度约为10⁸cfu/mL)，适当稀释后浇灌于根系周围，正常管理；对照为CK菌株培养液。40天后测量植株的株高、地径、根长。对比结果如表1和图4所示。

表1促生效果

注：*表示在和CK相比在0.05水平上达到显著性差异，**表示和CK相比在0.01水平上达到极显著差异。

实施例2 SH180产蛋白能力测定

测定采用Folin酚法，将1mL原发酵液加2mL质量分数为0.5％的酪蛋白液在pH值为7.0，37℃水浴15min，再用质量分数为10％的三氯乙酸灭活，然后取1mL上述反应液的离心上清液加1mL Folin酚和5mL 0.55mol/L的Na₂CO₃，在37℃水浴15min，测660nm下的吸光度值。以加灭活酶液的反应系统为空白对照。在此反应条件下定义：每1min生成1μg酪氨酸所需酶量为一个酶活。产蛋白酶效果如图3所示。

产蛋白酶检测结果如下表2所示：

表2产生蛋白酶检测结果

实施例3平板对峙法验证SH180抗灰霉病病原菌效果测定

平板对峙法验证灰霉病病原菌拮抗效果方法：在PDA固体平板上，用镊子将活化完成的灰霉病病原真菌挑取黄豆般大小的菌苔，放置在平板的中央，在28℃条件下培养1d，待灰霉病病原真菌的直径为2cm左右时，用灭菌后的牙签挑取待测菌株，从靠近灰霉病病原真菌的一侧2cm左右处沿与病原菌生长方向相交的方向划线接种，置于28℃条件下培养1-2d后观察拮抗效果，效果如图5所示。

所用PDA培养基制备方法：200g土豆煮30min后过滤取全部滤液，蔗糖20g，琼脂1.6％，定容至1L，121℃灭菌20min。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种产蛋白酶、抗番茄灰霉病菌的沙福芽孢杆菌及其应用

<130> 2010

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1390

<212> RNA

<213> 沙福芽孢杆菌 Bacillus safensis 16s rRNA

<400> 1

aaggttacct caccgacttc gggtgttgca aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac 60

aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg attactagcg attccagctt 120

cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca gatttatggg attggctaaa 180

ccttgcggtc ttgcagccct ttgttctgtc cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata 240

aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct 300

tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta 360

acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtcac tctgtccccg 420

aagggaaagc cctatctcta gggttgtcag aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc 480

gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga 540

gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta 600

aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat 660

ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg 720

ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca ccgctacacg tggaattcca 780

ctctcctctt ctgcactcaa gtttcccagt ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg 840

gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt acgcccaata attccggaca 900

acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt 960

taggtaccgt caaggtgcga gcagttactc tcgcacttgt tcttccctaa caacagagct 1020

ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg 1080

cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg 1140

gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg gtgagccatt accccaccaa 1200

ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtgacagccg aaaccgtctt tcatccttga 1260

accatgcggt tcaaggaact atccggtatt agctccggtt tcccggagtt atcccagtct 1320

tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc taacatccgg gagcaagctc 1380

ccttctgtcc 1390

Claims (10)

1.一种沙福芽孢杆菌株(Bacillus safensis)SH180，该菌株已于2018年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC15565。

2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是豆粕粉，最佳无机盐是FeSO₄·7H₂O，最佳培养基中包括4％葡萄糖，2％豆粕粉，0.003％FeSO₄·7H₂O。

3.如权利要求1所述的菌株的培养方法，其特征在于，采用LB平板培养基培养。

4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述LB平板培养基配方为：0.5％酵母浸膏，1％蛋白胨，1％氯化钠，1.6％琼脂，蒸馏水，121℃灭菌20min，pH7.0。

5.一种微生物菌剂，所述菌剂包括权利要求1所述菌株的培养物。

6.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂；优选的，所述菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。

7.一种促生菌发酵液的制备方法，其特征在于：将斜面保存的权利要求1所述菌株转接到装有5ml液体培养基的试管中，放在恒温摇床中培养12-14h，温度：37℃，转速：180-200rpm；将活化好的菌液按1％接种量接入到100-200mL培养基中，放入摇床培养24h，温度：37℃，转速：180-200rpm，制成发酵液。

8.如权利要求7所述发酵液的使用方法，其特征在于，番茄定苗后，将所述发酵液进行灌根处理，盆栽试验中每株5mL。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含权利要求5所述的微生物菌剂、权利要求7所述的促生菌发酵液中的一种或组合。

10.权利要求1所述菌株、权利要求5所述的微生物菌剂及权利要求9所述药物组合物在产生蛋白酶，分解土壤中蛋白质促进植物对氮源的供应、抗番茄灰霉病菌方面的应用。