CN103724407A - 一种抗菌蛋白pbr1及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗菌蛋白pbr1及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种抗菌蛋白PBR1及其制备方法与应用，涉及分子生物学以及生物农药技术领域。该抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。该抗菌蛋白PBR1在防治植物病害方面对十字花科根肿菌、水稻稻瘟菌、玉米弯孢弯霉叶斑病菌、康乃馨枯萎病菌、棉花枯萎病菌、魔芋基腐病菌、三七根腐病菌、石榴枯萎病菌、小麦全蚀病菌、苹果斑点病菌、烟草赤星病菌和/或番茄灰霉病菌具有优良的防治效果。用该抗菌蛋白PBR1为活性成分制成的农药属于新型环保型生物农药，对人畜安全，保护环境，具有良好的开发前景。

Description

一种抗菌蛋白PBR1及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及分子生物学以及生物农药技术领域，具体地说是一种来自微生物的新抗菌蛋白PBR1和应用。
背景技术
化学农药防治农作物病虫害长期以来对农业生产起了十分重要的作用，但由于化学农药的大量使用，却带来了很多负面作用，如污染环境、危害人畜、易产生抗药性，严重影响了人类健康和生态平衡。生物防治作为防治植物病害的重要措施已经成为农业发展的必然趋势。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性杆状细菌，可以产生内生芽孢，耐热抗逆性强，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境。由于它生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖与繁殖，而且生产枯草芽孢杆菌制剂的工艺简单，制剂稳定，施用方便，储存期长，因此是一种理想的生防微生物。关于枯草芽孢杆菌在防治十字花科根肿病方面有报道，见中国专利200810058919.0（授权公告号CN 101416641 B，授权公告日2011年8月17日）公开了一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1，对十字花科根肿病具有防治和增产作用。
芽孢杆菌的生防机理包括竞争作用、拮抗作用、诱导植物抗性等方面，尤以产生抗生素、抑菌蛋白和挥发性抗菌物质的拮抗作用为最主要防病机理。对于植物基因工程来说，拮抗蛋白尤其具有重要意义，因为编码这些蛋白质的细菌基因可以作为转导基因的候选对象，寻找高活力的拮抗蛋白并克隆其基因，已成为植物基因工程领域的一项重要的基础性工作。抗菌蛋白是广泛存在于动植物种的抗生物质，是生物一种重要的防卫物质。它具有广谱高效对人畜无害无污染的优良特性，且长期使用不易产生抗性。迄今为止，大多数抑制植物病原菌和腐生真菌的离体的蛋白质都是从植物材料中鉴别出来的。芽孢杆菌中普遍存在着抗微生物活性的蛋白，这些蛋白质可以在体外直接抑制或杀死病原菌。刘永峰等（刘永峰等. 枯草芽孢杆菌 B-916 胞外抗菌蛋白的性质. 江苏农业学报, 2005,21 (4): 288-293.）从土壤中获得的枯草芽孢杆菌菌株 B-916 的分泌液室内测定对西瓜枯萎病菌的抑制率为 49.7%，对水稻纹枯病菌、水稻白叶枯病菌和水稻恶苗病菌的抑制率可达 100%，近几年应用于大面积防治水稻纹枯病取得了比较理想的防治效果，其中起着重要拮抗作用的物质经研究证明就是该菌株分泌的一种蛋白。邱思鑫（邱思鑫.防病,促生植物内生芽孢杆菌.福建农林大学硕士学位论文, 2004. ）从辣椒内生芽孢杆菌中分离出的 TB2 菌株产生的蛋白类物质对辣椒炭疽病和西瓜枯萎病都有强烈的抑制作用。 
筛选抑制病原菌的拮抗菌，研究其分泌的抗菌蛋白，在分离纯化这些蛋白质并确定了其理化性质和抗菌作用之后，就可以从芽孢杆菌中得到编码抗菌蛋白的基因。运用基因工程的方法将抗菌蛋白基因作为目的基因转入植物进行表达即可获得抗菌的基因工程植物，还可导入植物附生菌或内生菌中以构建高效生防工程菌，以及通过遗传工程的手段改造生防菌提高其定殖能力、生防效率和扩大抗菌谱等，是植物病害控制的一条有效途径。因此，寻找抑菌效果好的微生物及其衍生物，开发新型农药是防治植物病害的有效解决途径。 
发明内容
本发明的目的是提供一种对植物病害具有广谱抗菌的抗菌蛋白及应用，从而开发新型的微生物农药，来满足绿色农业的生产要求。
本发明提供的一种抗菌蛋白PBR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的抗菌蛋白PBR1的分子量为 25KD，长度：239，类型：氨基酸，链型：单链，形态：线性，分子类型：蛋白质。在温度≤100℃的条件下具有抑菌活性；经过蛋白酶K、胰蛋白酶和RNase I处理及紫外照射仍具有抑菌活性。
所述的抗菌蛋白PBR1具有广谱的抑菌活性，所述的抗菌是对半知菌亚门的镰刀菌属（Fusarium）、子囊菌亚门的长喙壳属（Ceratocystis）、或半知菌亚门的葡萄孢属（Botrytis）的病菌等具有抑制作用。
抗菌蛋白PBR1所述的抗菌是对十字花科根肿菌孢子、水稻稻瘟菌（M. grisea）、玉米弯孢弯霉叶斑病菌（C. lunata）、康乃馨枯萎病菌（F.oxysporum）、棉花枯萎病菌（F. oxysporum）、魔芋基腐病菌（F. solani）、三七根腐病菌（F. solani）、石榴枯萎病菌（C. fimbriata）、小麦全蚀病菌（G. graminis）、苹果斑点病菌（A. alternate）、烟草赤星病菌（A. alternate）和/或番茄灰霉病菌（B.cinerea）的抑制作用。
本发明还提供了抗菌蛋白PBR1在防治植物病害方面的应用。
所述的抗菌蛋白PBR 1在防治植物病害方面的应用是对十字花科根肿病菌、水稻稻瘟病菌、玉米弯孢弯霉叶斑病菌、康乃馨枯萎病菌、棉花枯萎病菌、魔芋基腐病菌、三七根腐病菌、石榴枯萎病菌、小麦全蚀病菌、苹果斑点病菌、烟草赤星病菌和/或番茄灰霉病菌的防治。
本发明还提供了一种防治植物病原真菌的农药，所述农药的活性成分为抗菌蛋白PBR1，该抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的一种防治植物病原真菌的农药，所述的植物病原真菌为十字花科根肿病菌、水稻稻瘟病菌、玉米弯孢弯霉叶斑病菌、康乃馨枯萎病菌、棉花枯萎病菌、魔芋基腐病菌、三七根腐病菌、石榴枯萎病菌、小麦全蚀病菌、苹果斑点病菌、烟草赤星病菌和/或番茄灰霉病菌。
本发明还提供了上述抗菌蛋白PBR1的制备方法，包括以下步骤：
（1）取解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357接种于LB液体培养基中，于30℃，170rpm振荡培养48h后，得到发酵液；
（2）将步骤（1）得到的发酵液分离纯化，即得到目的蛋白；所述分离纯化方法为：
①硫酸铵沉淀：取步骤（1）得到的发酵液，于4℃，8000rpm 离心10min 后，收集上清液，采用盐析法，向发酵液中加入80% 饱和度的固体硫酸铵，4℃沉淀 24h左右，于12000 rpm冷冻高速离心30min，收集沉淀。
②透析：将收集的沉淀经灭菌水溶解后装入透析袋，透析袋截留分子量为3000 Da，在冰上用灭菌水进行透析，透析时间24h～36h ，期间换灭菌水2～3 次，把经过透析的样品转移到冷冻浓缩干燥仪进行粗蛋白浓缩得浓缩的粗蛋白。
③LP 层析仪层析：用pH7.0浓度为0.02M/L的磷酸缓冲液溶胀胶体48h，待胶体溶胀后，再用pH7.0浓度为0.02M/L的磷酸缓冲液平衡凝胶柱过夜；取浓缩的粗蛋白2mL加到凝胶柱上，然后用相同的缓冲液进行洗脱，流速为1mL/min，利用LP层析仪中紫外分光光度计检测流出蛋白的OD值并调零，当 OD值上升时开始收集蛋白，每3min一管分步收集洗脱液，以三七根腐病菌为指示菌，进行抑菌活性的检测，收集具有抑菌活性的粗蛋白。
④Sephadex-G75 凝胶柱层析：将Sephendex-G75超纯水溶胀72小时装柱，将收集的具有抑菌活性的粗蛋白上样，纯水溶洗脱，流速为0.5mL /min，280nm下检测，每5 min收集一管，根据洗脱曲线，分别取各收集峰液体，以三七根腐病菌为指示菌，检测抑菌活性，收集活性峰后峰的洗脱液，冷冻干燥备用。
⑤几丁质亲和层析：将步骤（2）④收集到的后峰洗脱液，进行几丁质亲和层析；将制备好的胶体几丁质装柱后，用pH4.0浓度0.02mol/L的乙酸钠缓冲液冲洗平衡亲和柱，调节流速1.0mol/ min流出液体达4倍时上样，由柱的上端加入40mL的后峰洗脱液样品，同时收集流出液，当样品液靠近几丁质顶端时，立即加pH4.0浓度0.02mol/L的乙酸钠缓冲液洗涤，后再加入pH7.4 浓度0.02mol/L 的磷酸缓冲液冲洗样品，使非亲和蛋白质洗脱下来，待缓冲液面靠近几丁质柱时加入 0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠，同时用梯度浓度为0-1.0mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，根据层析曲线，收集的吸收峰液即为所述的抗菌蛋白PBR1。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明首次提供了上述抗菌蛋白PBR1，该抗菌蛋白PBR1对植物病害具有广谱的抑制作用。十字花科根肿病是一种极其难防的土传病害，目前，国内外对根肿病尚无有效的防治方法，用于根肿病这类特殊病害防治一直停滞不前，而该抗菌蛋白PBR1对十字花科根肿菌孢子具有很强的裂解作用，防治效果显著。该抗菌蛋白PBR1不仅对重大气传病害水稻稻瘟病菌有很好的抑制作用，而且对番茄灰霉病菌、小麦全蚀病、石榴枯萎病也有很好的抑制作用。这些病原菌包括半知菌亚门的镰刀菌属（Fusarium）、子囊菌亚门的长喙壳属（Ceratocystis）、以及半知菌亚门的葡萄孢属（Botrytis）。
2、本发明首次提供一种对10多种对病原菌具有广谱的抑制作用的防治植
物病原真菌的农药，该农药的活性成份即本发明所述的抗菌蛋白PBR1的性质稳定，具有热稳定、pH稳定、紫外稳定等优点。该农药属于新型环保型生物农药，能保护环境，对人畜安全，具有良好的开发前景。在工业生产中，只需较简单的发酵设备，就能进行规模化推广应用，用于植物病害无公害防治，其市场前景广阔。 
序列表中SEQ ID NO：1所示的是本发明抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列。
所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357的保藏号：CGMCC NO.2357，保藏日：2008年1月24日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）。地址：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。该菌株获取时间：2006 年3 月，采集地：中国云南省昆明市大板桥镇大白菜根际土（原始来源）。
所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357也是在中国专利200810058919.0（授权公告号CN 101416641 B，授权公告日2011年8月17日）授权的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF-1。
附图说明
图1是Sephendex-G75凝胶层析柱分离XF1的粗蛋白的层析图；图中横坐标表示时间，纵坐标表示蛋白浓度。（XF1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357的简称）。
图2 是图1中前、后峰蛋白液对三七根腐病菌的抑制作用。
图3是几丁质亲和层析图谱，图中横坐标表示时间，纵坐标表示蛋白浓度；第1、2个为穿透峰，第3个为吸收峰。
图4是SDS-PAGE电泳图，图中M为标准分子量蛋白 Marker；1，2表示粗蛋白样品。
图5是蛋白酶K、胰蛋白酶和RNA酶处理后的抗菌蛋白PBR1对康乃馨枯萎病菌抑菌作用，Ⅰ代表蛋白酶K处理、Ⅱ代表胰蛋白酶处理、Ⅲ代表RNA酶处理。
图6是抗菌蛋白PBR1对根肿菌孢子的裂解作用，图中A为未处理，B为处理后立即制片观察，C为处理6h，D为处理24h。
图7 是水对根肿菌孢子的抑制作用，图中A为未处理，B为处理后立即制片观察，C为处理6h，D为处理24h。
具体实施方式
下面实施例仅用于对本发明做进一步的描述，并不是用来限制本发明的范围。以下实施例的实验方法无特殊说明为常规方法。以下实验所用的菌株均为市售，可通过如中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心等微生物保藏机构购买到。
实施例1：本发明抗菌蛋白PBR1的制备及其性质
1、抗菌蛋白PBR1的制备
（1）取解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357接种于LB液体培养基中，于30℃，170rpm振荡培养48h后，得到发酵液。
（2）将步骤（1）得到的发酵液分离纯化，即得到目的蛋白；所述分离纯化方法为：
①硫酸铵沉淀：取步骤（1）得到的发酵液，于4℃，8000rpm 离心10min 后，收集上清液，采用盐析法，向发酵液中加入80% 饱和度的固体硫酸铵，4℃沉淀 24h左右，于12000 rpm冷冻高速离心30min，收集沉淀。
②透析：将步骤收集的沉淀经灭菌水溶解后装入透析袋，截留分子量为3000 Da，在冰上用灭菌水进行透析，透析时间30h，期间换灭菌水3次，透析袋内液即为粗蛋白，将获得的粗蛋白转移到已灭菌的适当的培养皿或烧杯中，用干净的薄膜封口后用针头在薄膜上均匀扎出一定量的孔洞。将培养皿放入-80℃冰箱，开启冷冻浓缩干燥仪，进行24h浓缩处理，即得浓缩的粗蛋白。
③LP 层析仪层析
用pH7.0浓度为0.02M/L的磷酸缓冲液溶胀胶体48h，待胶体充分溶胀好后，再用pH7.0浓度为0.02M/L的磷酸缓冲液平衡凝胶柱过夜；取浓缩的粗蛋白2mL轻轻加到凝胶柱上，然后用pH7.0浓度为0.02M/L的缓冲液进行洗脱（即用相同的缓冲液进行洗脱），流速为 1mL/min，利用LP层析仪中紫外分光光度计检测流出蛋白的OD值并调零，当 OD值上升时开始收集蛋白，每3min一管分步收集洗脱液，以三七根腐病菌为指示菌，进行抑菌活性的检测，收集具有抑菌活性的粗蛋白。
④Sephadex-G75 凝胶柱层析
将Sephendex-G75超纯水溶胀72小时装柱，将收集的具有抑菌活性的粗蛋白上样，纯水溶洗脱，流速为0.5mL /min，280nm下检测，每5 min收集一管，根据洗脱曲线，分别取各收集峰液体，以三七根腐病菌为指示菌，检测抑菌活性，分别收集活性峰的洗脱液，冷冻干燥备用。
具有抑菌活性的粗蛋白上Sephendex-G75 凝胶柱层析，其检测结果如图 1 所示，得到明显的2个吸收峰。将收集得到的 2 个峰的试管中的蛋白进行抑菌活性检测。前峰流出的组分与后峰流出的组分均具有抑菌作用（见图2）。后峰的抑菌圈为1.8cm，前峰的抑菌圈为1.5cm。
⑤几丁质亲和层析
将步骤（2）④收集到的后峰洗脱液，进行几丁质亲和层析。将制备好的胶体几丁质装柱（1.5×50cm）后，用pH4.0浓度0.02mol/L的乙酸钠缓冲液冲洗平衡亲和柱。调节流速1.0mol/ min，流出液体达4倍时上样，由柱的上端加入40mL的后峰洗脱液样品，同时收集流出液，当样品液靠近几丁质顶端时，立即加pH4.0浓度0.02mol/L的乙酸钠缓冲液洗涤，后再加入pH7.4 浓度0.02mol/L 的磷酸缓冲液冲洗样品，使非亲和蛋白质洗脱下来。待缓冲液面靠近几丁质柱时加入 0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠，同时用梯度浓度为0-1.0mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，根据层析曲线如图3所示，亲和层析后出现3个峰，第1、2个为穿透峰，第3个为吸收峰，收集吸收峰液即为收集液冷冻备用。
2、SDS-PAGE分析
经过乙酸钠缓冲液以及磷酸缓冲液洗脱掉经步骤（2）⑤几丁质亲和层析的吸收峰杂蛋白后，最后用NaOH-甘氨酸缓冲液洗脱出的蛋白经过SDS-PAGE检测，可见一条单一的蛋白条带，分子量约25KD左右，初步判断纯化后的蛋白组分为单一蛋白，如图4所示。将该清晰条带小心挖出，放入干净的离心管中，编号送往上海生工作氨基酸序列测定，既是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。将该序列同XF-1基因组比对后与其中的一个蛋白的序列同源性为40%，初步确定该蛋白的碱基与氨基酸序列，并将该蛋白暂时命名为PBR1（Plasmodiophora brassicae resistance 1）。因此，步骤（2）④收集液（吸收峰液）即为本发明所述的抗菌蛋白PBR1。
3、抗菌蛋白PBR1的理化性质
（1）热稳定性的测定
将上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1液分别置于30℃、50℃、70℃、100℃下保温10min，用三七根腐菌做抑菌实验，在30℃、50℃、70℃三个温度下其抑菌圈半径没有区别，约为1.2cm。而在100℃处理下，抑菌活性有所减弱，抑菌圈半径约为0.8cm。说明该蛋白具有一定的热稳定性。
（2）对蛋白酶的稳定性
将上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1液分别用蛋白酶K、胰蛋白酶和RNase I处理，每种酶使用浓度500μg/mL，37℃水浴中处理1h。以康乃馨枯萎病菌（Fusarium oxysporum）为指示菌，以未经处理的上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1液为对照，进行抑菌活性测定。
当用蛋白酶K、胰蛋白酶和RNA酶处理上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1液后，该抗菌蛋白PBR1液对康乃馨枯萎病菌的抑菌活性基本不变（图5）。围绕着牛津杯周围有两个不同的圆圈，内圈为抑菌圈，外圈为促进生长的垫状菌丝圈。表明上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1及扩散到外圈的物质对这3种酶都不敏感。
（3）对紫外线的稳定性
将上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1分别经紫外照射（20W，距离40cm）10min、30min和60min后，以康乃馨枯萎病菌为指示菌，进行抑菌活性测定，以不经紫外照射处理的为对照。
随着紫外线光照时间的增长，该抗菌蛋白PBR1对康乃馨枯萎病菌的抑菌活性没有明显降低，扩散较远的成份促进菌株生长的作用也未改变，表明抗菌蛋白PBR1对紫外照射不敏感。
实施例2：抗菌蛋白PBR1对根肿菌孢子的抑制作用
抗菌蛋白PBR1对根肿菌孢子具有很强的裂解作用，加入抗菌蛋白PBR1后，可见孢子聚集成链状或团状（图6B）。6h后可见根肿菌孢子的细胞壁明显变薄且孢子的形态开始变为畸形（图6C），24h后已经可见孢子裂解，细胞内涵物外渗（图6D）。而对照中（水、缓冲液）孢子均未发生变化（图7）。
实施例3：抗菌蛋白PBR1抑菌谱的测定
通过对11个真菌菌株的抑制作用来看，分离的抗菌蛋白PBR1对病原菌具有广谱的抑制作用（见表1），它不仅对重大气传病害水稻稻瘟病菌有很好的抑制作用，而且对番茄灰霉病菌、小麦全蚀病、石榴枯萎病也有很好的抑制作用。这些病原菌包括半知菌亚门的镰刀菌属（Fusarium）、子囊菌亚门的长喙壳属（Ceratocystis）、以及半知菌亚门的葡萄孢属（Botrytis）。
Figure 2013106605198100002DEST_PATH_IMAGE001
 
                    
<110>   云南农业大学 
<120> 一种抗菌蛋白PBR1及其制备方法与应用
 
<130>  /
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  239
<212>  PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357
 
<400>  1
 
Met Lys Lys Val Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe
1                      5                         10                        15     
Gly Thr Leu Ser Ser Gly Val Leu Gly Leu Pro Ala Ala Asp Thr Gln
                  20                         25                         30         
Val Ala Lys Ala Ala Ser Gln Leu Pro Lys Gly Ile Gly Gly Arg Ala
          35                     40                     45               
Tyr Leu Asn Ser Thr Gly Ala Val Phe Thr Ala Lys Ile Lys Leu Pro
     50                      55                     60                   
Asp Thr Val Lys Asn Asp Asp Ser Val Ser Thr Pro Tyr Ile Tyr Ser
65                      70                      75                    80   
Gly Phe Arg Ala Thr Ser Gly Thr Glu Ala Asp Ile Gly Leu Gln Tyr
                     85                      90                     95     
Ser Lys Gln Tyr Asn Val Trp Lys Pro Leu Met Lys Val Gly Ala Lys
              100                     105                    110          
Asn Glu Glu Thr Tyr Thr Glu Gly Lys Asp Lys Phe Thr Tyr Lys Lys
           115                    120                     125            
 
Gly Phe Arg Pro Gly Ser Thr Val Gln Met Thr Ile Tyr Lys Asn Leu
     130                    135                    140                
Asn Gly Asn Thr Arg Met Thr Leu Trp Gly Thr Asn Asn Asp Gly Tyr
145                      150                     155                     160  
Thr Gly Arg Ile Ile Thr Glu Ile Gln Gly Thr Asn Ile Gly Thr Ile
                   165                   170                   175      
Ser Lys Trp Lys Thr Leu Ala Thr Ala Ala Val Ser Tyr Glu Ser Gln
              180                     185                   190        
Arg Asn Ser Ile Lys Ala Thr Phe Ser Thr Ala Phe Asn Asn Ile Thr
          195                   200                    205            
Ile Asp Asn Lys Ala Val Thr Pro Val Val Asp Thr Gln Asp Phe Ala
   210                     215                    220                
Lys Val Ser Val Ser Gly Asn Asn Val Thr Ile Ser Val Asn Lys
225                   230                     235                 

Claims (6)

1.一种抗菌蛋白PBR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的抗菌蛋白PBR1在防治植物病害方面的应用。
3.根据权利要求2所述的抗菌蛋白PBR 1在防治植物病害方面的应用是对十字花科根肿病菌、水稻稻瘟病菌、玉米弯孢弯霉叶斑病菌、康乃馨枯萎病菌、棉花枯萎病菌、魔芋基腐病菌、三七根腐病菌、石榴枯萎病菌、小麦全蚀病菌、苹果斑点病菌、烟草赤星病菌和/或番茄灰霉病菌的防治。
4.一种防治植物病原真菌的农药，其特征在于，所述农药的活性成分为权利要求1所述的抗菌蛋白PBR1。
5.根据权利要求4所述的防治植物病原真菌的农药，所述的植物病原真菌为十字花科根肿病菌、水稻稻瘟病菌、玉米弯孢弯霉叶斑病菌、康乃馨枯萎病菌、棉花枯萎病菌、魔芋基腐病菌、三七根腐病菌、石榴枯萎病菌、小麦全蚀病菌、苹果斑点病菌、烟草赤星病菌和/或番茄灰霉病菌。
6.权利要求1所述的抗菌蛋白PBR1的制备方法，包括以下步骤：
（1）取解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357接种于LB液体培养基中，于30℃，170rpm振荡培养48h后，得到发酵液；
（2）将步骤（1）得到的发酵液分离纯化，即得到目的蛋白；所述分离纯化方法为：
①硫酸铵沉淀：取步骤（1）得到的发酵液，于4℃，8000rpm 离心10min 后，收集上清液，采用盐析法，向发酵液中加入80% 饱和度的固体硫酸铵，4℃沉淀 24h，于12000 rpm冷冻高速离心30min，收集沉淀；
②透析：将收集的沉淀经灭菌水溶解后装入透析袋，透析袋截留分子量为3000 Da，在冰上用灭菌水进行透析，透析时间24h～36h ，期间换灭菌水2～3 次，把经过透析的样品转移到冷冻浓缩干燥仪进行粗蛋白浓缩得浓缩的粗蛋白；
③LP 层析仪层析：用pH7.0浓度为0.02M/L的磷酸缓冲液溶胀胶体48h，待胶体溶胀后，再用pH7.0浓度为0.02M/L的磷酸缓冲液平衡凝胶柱过夜；取浓缩的粗蛋白2mL加到凝胶柱上，然后用相同的缓冲液进行洗脱，流速为1mL/min，利用LP层析仪中紫外分光光度计检测流出蛋白的OD值并调零，当 OD值上升时开始收集蛋白，每3min一管分步收集洗脱液，以三七根腐病菌为指示菌，进行抑菌活性的检测，收集具有抑菌活性的粗蛋白；
④Sephadex-G75 凝胶柱层析：将Sephendex-G75超纯水溶胀72小时装柱，将收集的具有抑菌活性的粗蛋白上样，纯水溶洗脱，流速为0.5mL /min，280nm下检测，每5min收集一管，根据洗脱曲线，分别取各收集峰液体，以三七根腐病菌为指示菌，检测抑菌活性，收集活性峰后峰的洗脱液，冷冻干燥备用；
⑤几丁质亲和层析：将步骤（2）④收集到的后峰洗脱液，进行几丁质亲和层析；将制备好的胶体几丁质装柱后，用pH4.0浓度0.02mol/L的乙酸钠缓冲液冲洗平衡亲和柱，调节流速1.0mol/ min流出液体达4倍时上样，由柱的上端加入40mL的后峰洗脱液样品，同时收集流出液，当样品液靠近几丁质顶端时，加pH4.0浓度0.02mol/L的乙酸钠缓冲液洗涤，后再加入pH7.4 浓度0.02mol/L 的磷酸缓冲液冲洗样品，使非亲和蛋白质洗脱下来，待缓冲液面靠近几丁质柱时加入 0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠，同时用梯度浓度为0-1.0mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，根据层析曲线，收集的吸收峰液即为所述的抗菌蛋白PBR1。
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