CN105519582A - 一种防治烟草番茄根结线虫制剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种防治烟草番茄根结线虫制剂和应用。所述防治烟草或番茄根结线虫制剂的活性成分为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)YN2010-KC？CGMCC？No.5722的发酵液。本发明制剂不仅是一种微生物肥料，可显著促进植物生长，而且还是一种生物农药，对烟草根结线虫病的平均相对防效达78.32％；对番茄根结线虫病防效达74.50％以上，防治效果显著。本发明制剂生产成本低，施用方法简单易行，可直接拌种、灌根、且无毒、无污染、无残留、对人畜安全。

Description

一种防治烟草番茄根结线虫制剂和应用
技术领域
本发明涉及烟草和番茄根结线虫的防治，具体的说是一株解淀粉芽孢杆菌及其对烟草和番茄根结线虫的防治应用。
背景技术
根结线虫(Meloidogynespp.)病是一种危害严重的病害，主要发生在热带和温带地区。其寄主范围非常广泛，超过5500种作物，其中包括单子叶植物、双子叶植物、草本植物和木本植物。植物被根结线虫侵害后，在根系产生巨细胞和根结，根结线虫从中汲取养分，完成生活史。植物受根结线虫危害后，易导致减产，植株萎蔫，并很容易被其他土传性病害侵染。
烟草根结线虫(Meloidogynespp.)是许多国家烟草生产的限制因素之一，不仅直接危害烟草，造成烟株萎蔫黄化，发育迟缓，甚至整株死亡，而且还会导致烟草黑胫病、青枯病等病害发生，降低烟草品种的抗性。在我国云南、河南、山东等13个主要产烟区都有发生，造成严重危害，且日趋严重，仅云南省发病面积就达40余万亩，病株造成烟叶减产30％～50％。由于生产上缺乏抗性品种，复种指数高，化学杀线剂会造成烟叶中农药残留的增加，致使烟叶农药残留超标。烟草作为吸食品，其农药残留问题更应重视，生物防治烟草根结线虫作为一种安全、有效的方法而越来越受到重视。
番茄根结线虫(Meloidogynespp.)是番茄重要病害之一，随着保护地蔬菜生产面积增加，特别是日光温室大面积推广以来，复种指数增加，加之重茬严重，导致根结线虫危害日趋严重，一般可造成减产10％～20％，严重可达30％～40％，甚至绝产。目前国内尚无抗线虫番茄品种用于生产，防治该病害多采用化学防治，但化学杀线虫剂对环境污染严重，使用过程中对人畜也不安全，很多高毒的化学杀线剂已被禁用。
在土壤中尤其是在植物根际存在着大量具有生防潜力的有益微生物，其种类多、数量大、繁殖快；不仅可以对病原菌进行有效的拮抗抑制而且还有促进植物生长和增产的作用，所以利用土壤有益微生物防治植物病害具有巨大的应用潜力。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是芽孢杆菌属中的一个种，是土壤和植物微生态的优势群，也是一种有益微生物。具有较强的次级代谢产物的生产能力，可分泌植物生长激素(如吲哚乙酸)，促进植物生长；可分泌植酸酶和有机酸，降解土壤中植酸及矿质磷；可以产生多种抑菌相关的代谢产物(如蛋白酶，杆菌素、杆菌烯、风齐素，大环内酯等)，对真菌和细菌都具有强烈的抑制作用，具有实际应用的潜力。
发明内容
本发明目的是提供一种生产成本低、无毒、无污染、无残留、对人畜安全、对植物根结线虫防治效果高的防治烟草或番茄根结线虫的制剂和应用。
本发明技术方案如下：
1.一种防治烟草番茄根结线虫制剂，它的活性成分为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液。
2.根据技术方案1所述的防治烟草番茄根结线虫制剂，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液通过以下方法制备得到：
(1)将所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722活化后，按5～10％接种量，将活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养36～48h，得到一级种子液，所述种子培养基为液体LB培养基，pH7.0～7.2；
(2)按10～12％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养36～48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：淀粉1.5～3％，麸皮粉1～2％，酵母膏0.05～0.3％，蛋白胨0.5～1％，磷矿粉1～2％，MgSO4·7H2O0.01～0.05％，CaCl20.1～0.4％，(NH4)2SO40.01～0.04％，余量为水，pH7.0～7.2；
(3)按10～12％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数≧1×1010cfu/ml时，该发酵液即为所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液，所述发酵培养基与步骤(2)所述二级种子培养基相同。
3.技术方案1或2所述的防治烟草番茄根结线虫制剂在防治烟草根结线虫的应用。
4.技术方案1或2所述的防治烟草番茄根结线虫制剂在防治番茄根结线虫的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明制剂不仅是一种微生物肥料，可显著促进植物生长，而且还是一种生物农药，对烟草根结线虫病的平均相对防效达78.32％；对番茄根结线虫病防效达74.50％以上，防治效果显著。
2、本发明制剂生产成本低，施用方法简单易行，可直接拌种、灌根，较易推广应用。
3、本发明制剂无毒、无污染、无残留、对人畜安全。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensYN2010-KC于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.5722，并于2012年1月12日检测为存活。该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明，各实施例无特殊说明为常规方法。
实施例1本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KC的获得、鉴定和保藏
1、本发明解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的获得
1.1材料
采自云南农业大学后山农场玉米根际周围的土壤。
1.2培养基制备
将LB固体培养基和PSA培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成LB和PSA平板。
1.3分离培养
采用稀释平皿分离法和平板划线分离，将分离纯化所得的一菌株命名为YN2010-KC。
2、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的鉴定
2.1、形态学鉴定
取菌株YN2010-KC在LB培养基上培养，37℃培养36小时，进行形态观察鉴定，菌体为杆状、端圆，周生鞭毛、具运动性，产生椭圆形芽孢；在LB和PSA平板上菌落圆形、淡茶褐色、菌落中央颜色略深、隆起、表面干燥有褶皱。与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社，2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株YN2010-KC属于芽孢杆菌(Bacillusspp.)。
2.2、生理生化鉴定
菌株革兰氏染色、芽孢染色、淀粉水解、葡萄糖利用、柠檬酸盐利用、V-P反应、接触酶反应、硝酸盐还原、明胶液化等均呈阳性。
3、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的保藏
经上述鉴定表明所分离获得的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，其代号为YN2010-KC，所述的解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensYN2010-KC于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.5722，并于2012年1月12日检测为存活。该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。
实施例2本发明防治烟草番茄根结线虫制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种在液体LB培养基上，28～37℃培养24-36h，得活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722，按10％接种量，将活化的所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养36h，得到一级种子液，所述种子培养基为液体LB培养基，pH7.0～7.2；
(2)按10％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在35℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养36～48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：淀粉2％，麸皮粉1％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.5％，磷矿粉1％，MgSO4·7H2O0.02％，CaCl20.25％，(NH4)2SO40.03％，余量为水，pH7.0～7.2，所述二级种子培养基于121℃灭菌30min，待降温至30℃，接入一级种子液。
(3)按10％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在35℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数为1×1010cfu/ml时，将发酵液用医用塑料瓶包装，即为所述防治烟草番茄根结线虫制剂，所述发酵培养基与步骤(2)所述二级种子培养基相同。
本发明防治烟草番茄根结线虫制剂通过实施例2所述的防治烟草番茄根结线虫制剂的制备方法制备得到。本发明防治烟草番茄根结线虫制剂以下简称：本发明制剂。
实施例3本发明制剂对番茄根结线虫的防治试验
1、盆栽试验
1)供试材料：供试为番茄品种云杂8号(易感根结线虫番茄品种，市售)，对照药剂为1.8％阿维菌素水乳剂(购自山东中农联合生物科技有限公司)，接种线虫为南方根结线虫(Meloidogyneincognita)。
南方根结线虫(Meloidogyneincognita)按贝尔曼漏斗法(BaermannFunnel法)从土壤中分离，并按形态学，根据头部形态及会阴花纹进行鉴定。鉴定为南方根结线虫(Meloidogyneincognita)后用于试验。
2)试验设计：盆栽种植番茄，苗于4片真叶时进行移栽。取大小相同的塑料盆放经高温下燥灭菌后的土壤，每盆移入4株番茄幼苗，接种南方根结线虫二龄幼虫100条左右。试验设3个处理，A为本发明制剂500倍液，B为1.8％阿维菌素10倍液，C为空白对照无菌水。3个处理共20盆，每处理4个重复。
3)调查方法：在处理后2个月，每盆取4株番茄的全部根系，进行根结线虫危害分级，按照以下方法进行根结分级：0级：根系无根结；l级：10％及以下的根系有根结；3级：11～25％根系有根结；5级：26～50％根系有根结；7级：51～75％根系有根结；9级：75％以上根系有根结，计算病株率，根结指数和防治效果。
4)试验结果：番茄植株经过60d的生长，对其生物性状统计，见表1，本发明制剂在促生长和防治根结线虫效果优于1.8％阿维菌素水乳剂，1.8％阿维菌素水乳剂10倍稀释液对番茄植株有明显伤害作用，植株生长较小，且根变黑。
表1本发明制剂防治番茄根结线虫病和促进生长盆栽试验效果
2、田间试验
1)供试材料：供试为云杂8号(易感根结线虫番茄品种，市售)，对照药剂为1.8％阿维菌素水乳剂(购自山东中农联合生物科技有限公司产品)。
2)试验地点：试验地选择在常年种植番茄的大棚中，根结线虫发生严重且比较均匀，土质为沙壤土，肥力中等。
3)试验设计：2种药剂的使用剂量分别为：本发明制剂500倍液，1.8％阿维菌素10倍液，另设不施药处理对照(CK)，3个处理每，每个处理3次重复，每个区面积为10m2，随机区组排列。用清水稀释后，浇灌于定植穴中，番茄定植后，覆土浇透水。
4)调查指标和方法：病情指数调查：分别在番茄定植90天和150天，每个小区随机调查20株，挖出番茄植株全部根系，调查病株及根系受侵染程度，计算病情指数及防治效果。
5)试验结果：3个处理之间存在显著与极显著差异，见表2，本发明制剂防治线虫效果优于1.8％阿维菌素水乳剂。
表2本发明制剂防治番茄根结线虫病田间试验效果
实施例3表明：本发明制剂对番茄根结线虫的防治效果达到74.50～84.50％，其防效比1.8％阿维菌素提高2.51～5.78％，而且具有促进植物生长的效果，其植株株高比施用1.8％阿维菌素后增高48.06％，比对照CK增高136.33％，地上部分植株鲜重比施用1.8％阿维菌素后增加181.65％，比对照CK增加293.68％，根鲜重比施用1.8％阿维菌素后增加167.65％，比对照CK增加250.00％，产生了显著的技术效果。
实施例4：本发明制剂对烟草根结线虫的防治试验
1、供试材料：地点在云南楚雄根结线虫病常发的烟田。供试烟草品种为红花大金元(市售)，为烟草根结线虫病感病品种。供试药剂：本发明制剂500倍液，5％阿维菌素颗粒剂(购自泰山现代农业科技有限公司)，施用剂量5g/亩；15％铁灭克颗粒剂(美国产，市售)，施用剂量700g/亩。施药方法均为移栽时一次性穴施。
2、试验设计：小区试验设置在根结线虫病发病重田块，小区试验采用随机区组排列，3个处理，3次重复；每小区栽烟50株，行距1.1m，株距0.6m。
按当地优质烟叶生产技术规范进行试验田的栽培管理，但不施用供试药物之外的任何药剂。
3、调查方法：采用5点取样法，每点定株调查5株，分别于烟草移栽后30d(线虫病发病初期)、90d(线虫病发病高峰期)、采收末期调查烟草根结线虫病的病株率，并计算病情指数。采收末期烟株拔根调查计算根结指数。根据病株率、病情指数或根结指数计算相对防效。
收获期根结严重度的分级标准：0级：根部正常，无可见根结；1级：1/3以下根系上有少量根结；2级：1/3—1/2根系上有根结；3级：1/2以上根系上有根结，少量根结上再产生根结；4级：几乎所有根系上长满根结，甚至连结成根结团块。
4、试验结果：小区试验调查及其显著性检验结果见表3。表3表明，与其他试验药剂比较，本发明制剂对烟草根结线虫病的防效高，平均相对防效达78.32％。15％铁灭克水溶性强，残留毒性对水流有污染，施药地块应远离鱼池和人畜饮水水源处200m外。本发明制剂对烟草根结线虫的防效，比常用杀线虫农药5％阿维菌素颗粒剂提高6.80％，比常用杀线虫农药15％铁灭克颗粒剂提高32.70％，产生了显著的技术效果。
表3本发明制剂防治烟草根结线虫病效果

Claims (4)

1.一种防治烟草番茄根结线虫制剂，其特征在于：它的活性成分为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液。
2.根据权利要求1所述的防治烟草番茄根结线虫制剂，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液通过以下方法制备得到：
(1)按5～10％接种量，将活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养36～48h，得到一级种子液，所述种子培养基为液体LB培养基，pH7.0～7.2；
(2)按10～12％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养36～48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：淀粉1.5～3％，麸皮粉1～2％，酵母膏0.05～0.3％，蛋白胨0.5～1％，磷矿粉1～2％，MgSO4·7H2O0.01～0.05％，CaCl20.1～0.4％，(NH4)2SO40.01～0.04％，余量为水，pH7.0～7.2；
(3)按10～12％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.02～0.03MPa条件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数≧1×1010cfu/ml时，该发酵液即为所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液，所述发酵培养基与步骤(2)所述二级种子培养基相同。
3.权利要求1或2所述的防治烟草番茄根结线虫制剂在防治烟草根结线虫的应用。
4.权利要求1或2所述的防治烟草番茄根结线虫制剂在防治番茄根结线虫的应用。
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