CN106222121B - 一种巨大芽孢杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种巨大芽孢杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物保护技术领域，公开了一种巨大芽孢杆菌菌株wdcjxq2015，该菌株于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.11668。本发明还公开了由菌株wdcjxq2015经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到的活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL生防菌剂。本发明还公开了利用该菌株生产的生防菌剂在防治番茄根腐病、在增加番茄产量中的应用。抑菌效果非常明显，经过试验证明，本发明提供的生防菌剂在温室条件下对番茄根腐病的防效达到89.68％，大田防效达到88.13％，对番茄的增产幅度达到19.38％。

Description

一种巨大芽孢杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，涉及一种巨大芽孢杆菌菌株wdcjxq2015，利用该菌株生产的生防菌剂，以及该菌株和生防菌剂在防治番茄根腐病中的应用。
背景技术
番茄是世界范围内广泛种植的经济作物之一，以其品种多、适应范围广、产量高、营养丰富、食用品质好、用途广泛，而受到栽培者和消费者青睐，是广泛分布于世界不同地区的重要蔬菜作物。番茄含有丰富的维生素、碳水化合物、矿物质、有机酸及少量的蛋白质，不仅可以作为果蔬食用，还可以作为重要的加工原料，在消费领域中有广泛的用途。但是番茄的各种病害一直是番茄产量和经济效益的一个主要限制因素，如何提高番茄的抗病性已成为番茄育种的重要课题。
番茄根腐病，俗称“烂脖根死棵病”，是由鞭毛菌亚门卵菌纲霜霉目疫霉属真菌侵染所致，病原菌为番茄疫霉(Phytophthora capsici)和寄生疫霉(Phytophthoraparacitica)。番茄根腐病是世界许多国家保护地和露地番茄生产的重要病害之一，严重影响番茄的产量和品质。近年来，番茄疫霉根腐病已成为冬春大棚番茄的主要病害之一，严重制约着番茄生产的发展，特别是在番茄定植后期至结果初期发病严重，甚至毁秧绝收，必须找到一种行之有效的方法来预防和控制该病害的流行，减少损失。
化学农药防治虽见效快，但由于农药的大量使用、滥用以及其不可降解性，导致环境污染、生态破坏、食品污染及人畜中毒等事件频发，并引发严重的“3R”(Residue、Resisitance和Resurgence)问题。生物农药防治植物病害效果好、对人畜无毒、不污染环境、无残留、能保持农产品的优良品质、对害虫天敌和有益生物安全，有助于保持生态平衡，是解决番茄根腐病经济而有效的途径。
开发新的、更为高效和安全的微生物菌剂控制番茄根腐病的发生是实现农业安全可持续发展的需要，符合社会发展要求。
发明内容
本发明针对现有技术中防治番茄根腐病的制剂防治效果不理想、易造成环境污染的问题，提供一种巨大芽孢杆菌菌株、包括该菌株的生防菌剂及该生防菌剂的制备方法，以及二者在防治番茄根腐病上的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现
一种巨大芽孢杆菌菌株，所述的巨大芽孢杆菌菌株(Bacillus megaterium)的名称为wdcjxq2015，于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC NO.11668。生物学特性：杆状，末端圆；单个或呈短链排列，单个细胞1.2～1.5×2.0～4.0微米；能运动；革兰氏阳性；芽孢1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形，中生或次端生；液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉、不还原硝酸。
一种生防菌剂，所述的生防菌剂包括本发明所述的巨大芽孢杆菌菌株wdcjxq2015。
所述的生防菌剂中活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL。
所述的生防菌剂由本发明提供的巨大芽孢杆菌菌株wdcjxq2015经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到的。
所述的生防菌剂的制备方法，包括：将巨大芽孢杆菌菌株wdcjxq2015在LB培养液25～30℃、150～200rpm振荡培养12～24h，获得种子液；将种子液以1％的接种量接种于发酵培养液，于25～30℃、150～200rpm振荡培养，获得活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL的菌剂成品。
LB液体培养基为：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L。
发酵培养液为：蔗糖2g/L、玉米粉15g/L、黄豆粉10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、酵母膏0.4g/L、氯化钙1g/L、氯化铁0.005g/L、pH值为6。
本发明所述的巨大芽孢杆菌菌株在防治番茄根腐病中的应用。
本发明所述的生防菌剂在防治番茄根腐病中的应用。
本发明所述的生防菌剂在防治番茄根腐病中的应用，该应用方法为，在使用前，将制得的生防菌剂稀释5-100倍，在番茄种植时浸种处理或/和在移栽时进行灌根处理达到防治番茄根腐病的作用。
本发明所述的生防菌剂在增加番茄产量中的应用。
本发明的有益效果：
1.生防菌剂中含有抑制番茄根腐病病原菌生长的专一性菌株巨大芽孢杆菌菌株wdcjxq2015，其抑菌效果非常明显，经过试验证明，本发明提供的生防制剂在室温条件下对番茄根腐病的防效可以达到89.68％，田间对番茄根腐病的防效可达到88.13％。
2.本发明的芽孢杆菌菌株wdcjxq2015，生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治番茄根腐病的生防制剂。
3.本发明提供的生防制剂为微生物防治剂，无公害，不产生环境污染，可以不用或减少其他相应化学农药的用量，不仅节省农民开支，而且有利于蔬菜的出口。
4.经过试验证明，本发明提供的生防制剂，具有抗病、增产作用，可为农民增加收入。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1生防菌株wdcjxq2015的分离纯化与鉴定
本发明涉及一种防治番茄根腐病的生防菌株wdcjxq2015，为2013年在江苏南京市郊病田健株上分离得到。
分离方法：采用5点取样法将生长至成熟期的番茄根腐病病株的根、茎、叶和根部粘附土分别装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室。在分离番茄根腐病生境相关细菌前用自来水冲洗采集到的番茄根腐病根，直到冲洗干净，然后在灭菌水中润洗3遍。采集到的茎和叶采取同样的处理方法。分别称取植物的根、茎、叶放入含有27mL 0.85％的NaCl无菌溶液的三角瓶中，加入少许直径2mm的玻璃珠，200rpm 30℃振荡30min后，分别移于灭菌培养皿中，先用1.5％次氯酸钠溶液(NaClO)浸泡5min，再用灭菌水润洗5次，将组织剪成2-3cm长的小块，用镊子分别把根、茎和叶各自接入R2A平板、KBA平板(金氏B培养基)上，置于30℃培养箱中培养，5d后把没有任何污染的组织用剪刀剪碎后研细，浸软组织，灭菌棉布过滤，再用0.85％的NaCl无菌溶液以10倍梯度稀释，分别取梯度稀释液0.1mL各自涂在R2A平板、KBA平板上(根部稀释液涂10-2、10-3、10-4和10-5四个浓度，茎、叶部稀释液涂10-1、10-2、10-3和10-4四个浓度)，30℃培养箱中培养，进行根内、茎内、叶内细菌的分离。根据平板上菌落大小及形态进行分离纯化。细菌种群密度以CFU/g表示。将纯化好的细菌进行编号，用80％灭菌甘油保存，放入-70℃备用。
按照平板拮抗活性、蛋白酶活性、几丁质酶活性、纤维素酶活性、葡聚糖酶活性以及产嗜铁素活性，采用赋值法，选择出综合得分较高菌株，通过温室试验最终筛选出防治效果最好的菌株wdcjxq2015。
生物学特性：杆状，末端圆；单个或呈短链排列，单个细胞1.2～1.5×2.0～4.0微米；能运动；革兰氏阳性；芽孢1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形，中生或次端生；液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉、不还原硝酸。
参照《细菌鉴定手册》，根据生物学特性鉴定为巨大芽孢杆菌菌株(Bacillusmegaterium)，于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC NO.11668。
实施例2生防菌剂的制备
将分离出的wdcjxq2015单菌落于LB液体培养基，28℃、180rpm摇床振荡培养20h，获得种子液，种子液中活菌总浓度约为106CFU/mL；将种子液以1％的接种量接种于发酵培养液，装量30mL(250mL三角瓶)，于30℃、180rpm摇床振荡培养72h，生防菌剂成品中活菌总浓度为1×109CFU/mL，芽孢形成率达95％。
LB液体培养基为：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L。
发酵培养液为：蔗糖2g/L、玉米粉15g/L、黄豆粉10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、酵母膏0.4g/L、氯化钙1g/L、氯化铁0.005g/L、pH值为6。
实施例3平板对峙试验检测wdcjxq2015生防菌剂对番茄疫霉的防效
将实施例2制得的生防菌剂稀释5倍得到活菌总浓度为2×108CFU/mL的生防菌剂，采用菌丝生长速率法，将番茄根腐病菌(Phytophthora capsici)转接到PDA平板中，在25℃下活化96h，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5mm的菌饼，并转接到含有0.1mL活菌总浓度为2×108CFU/mL生防菌剂的PDA平板中作为处理组，对照组为直接将番茄根腐病菌转接到PDA平板中，处理组、对照组均在25℃培养，待对照组菌落长至约平板直径的4/5时，采用十字交叉法量取菌落直径。计算菌落直径均值，按照下列公式计算菌丝生长平均抑制率。
菌丝生长平均抑制率＝[(对照组菌落直径均值-处理组菌落直径均值)/(对照组菌落直径均值-接种菌饼直径)]×100％。
表1生物菌剂对番茄根腐病菌菌丝生长的抑制效果
结果表明，由巨大芽孢杆菌菌株wdcjxq2015制备的生防菌剂对番茄根腐病菌菌丝生长的抑制效果达96.61％。
实施例4温室盆钵试验检测wdcjxq2015生防菌剂对番茄根腐病的防效
处理组：移栽之前，用wdcjxq2015生防菌剂(活菌中浓度107CFU/mL，由实施例2制得的生防菌剂稀释100倍得到)浸种处理番茄幼苗30min；移栽时采用20mL 107CFU/mL生防菌剂灌根处理，移栽7天后接种105个/mL番茄根腐病游动孢子悬液20mL。
对照组：不用wdcjxq2015生防菌剂处理，直接接种等量番茄根腐病菌游动孢子悬液。
处理组和对照组均为24株，三次重复。在温度25～28℃，相对湿度50％，光照12h/12h条件下，培养4周后，每株取根及随机10片叶片进行调查，按照0级(无病)、1级(病斑占叶、根的1/4以下，出现水渍状褐色斑点，没有出现腐烂状况)、2级(病斑占叶、根的1/4～1/2以下，主根开始腐烂，茎基部出现缢缩，但有新生的侧根，地上无明显症状)、3级(病斑占叶、根的1/2～3/4以下，主根大部分腐烂，同时茎基部缢缩，侧根不在新生，地上部叶片枯萎)、4级(病斑占叶、根的3/4以上，根茎部位缢缩成线状，植株几乎死亡)的分级标准记载，计算病情指数和防效。
病情指数＝∑(病级株数×该病级数)/(总植株数×最高病级数)
防效＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％
表2温室中生防菌剂wdcjxq2015对番茄根腐病的生防效果
调查结果显示，温室盆栽实验中，wdcjxq2015生防菌剂对番茄根腐病的防效达到89.68％。
实施例5田间试验检测wdcjxq2015生防菌剂对番茄根腐病的防效和增产效果
本试验设在日光温室内，种植面积660m2，该温室前两年种植番茄，根腐病发生严重。肥水条件中等，排灌条件良好。
处理组：定植前，将实施例2制得的wdcjxq2015生防菌剂稀释100倍(稀释后浓度为107CFU/mL)，用稀释后的生防菌剂浸种处理番茄幼苗30min；定植时采用稀释后浓度为107CFU/mL的生防菌剂灌根处理，每株30mL；采用等量消毒蒸馏水处理作为对照组。处理组和对照组(CK)重复3次，随机区组排列。采用高垄种植，垄高20cm，垄宽33cm，株距25cm。试验区管理水平一致，处理前施纯鸡粪500kg/亩，硫酸钾复合肥和进口氮磷钾复合肥各35kg/亩。正常管理。
对处理组和对照组以棋盘取样方式各取5点，每点取10株。在盛果期测定平均株高、整株叶片面积、整株鲜重；调查并计算病株率；每株取根及随机10片叶片进行调查，计算病情指数和防效，比较两区抗病性；统计处理组和对照组的产量及效益。
表3wdcjxq2015生防菌剂对番茄根腐病防效和增产效果
由表3可以看出，wdcjxq2015生防菌剂处理使番茄产量增加了19.38％，对根腐病的防效达到了88.13％，增产效果和对根腐病的防治效果明显。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种巨大芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述的巨大芽孢杆菌菌株(Bacillusmegaterium)的名称为wdcjxq2015，于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.11668。
2.一种生防菌剂，其特征在于：所述的生防菌剂含有权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株wdcjxq2015。
3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于：所述的生防菌剂中活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL。
4.根据权利要求3所述的生防菌剂，其特征在于：所述的生防菌剂由权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株wdcjxq2015经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到的。
5.权利要求2-4任一项所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于：包括：将巨大芽孢杆菌菌株wdcjxq2015在LB培养液25～30℃、150～200rpm振荡培养12～24h，获得种子液；将种子液以1％的接种量接种于发酵培养液，于25～30℃、150～200rpm振荡培养，获得活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL的菌剂成品。
6.根据权利要求5所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于：发酵培养液为：蔗糖2g/L、玉米粉15g/L、黄豆粉10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、酵母膏0.4g/L、氯化钙1g/L、氯化铁0.005g/L、pH值为6。
7.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株在防治番茄根腐病中的应用。
8.权利要求2所述的生防菌剂在防治番茄根腐病中的应用。
9.权利要求8所述的应用，其特征在于：在使用前，将制得的生防菌剂稀释5-100倍，在番茄种植时浸种处理或/和在移栽时进行灌根处理。
10.权利要求2所述的生防菌剂在增加番茄产量中的应用。
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Biocontrol of Phytophthora capsici on pepper plants by Bacillus Megaterium strains;D.S.Akgul et al.;《Journal of Plant Pathology》;20081231;摘要 *
番茄疫霉根腐病的发生规律及防治技术;于凌春等;《植保技术与推广》;20011231;25-26 *
番茄疫霉病的研究;张祥林等;《新疆农垦科技》;19921231;23-24 *
秦岭森林土壤芽孢杆菌的分离筛选、鉴定及抑菌作用研究;陈太春;《中国优秀硕士学位论文 全文数据库 农业科技辑》;20130115;全文 *

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