CN110734876B - 一种巨大芽胞杆菌fjw1生防制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种巨大芽胞杆菌fjw1生防制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种巨大芽胞杆菌FJW1生防制剂及其制备方法和应用，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019660；本发明的巨大芽孢杆菌对多种植物致病菌有较好的抑菌作用，在田间实验中发现施用此株巨大芽孢杆菌的番茄植株长势较好，植株的高度和宽度明显高于仅接种致病菌的对照组。因巨大芽胞杆菌在发酵过程中分泌有机酸，导致该菌在发酵上很难做出高含量的芽胞数，本发明针对该菌株提供了高密度发酵方法，该方法突破了目前市场巨大芽胞发酵水平和菌粉芽胞数最高的水平，使其放罐时的芽孢数至少有1010CFU/ml。

Description

一种巨大芽胞杆菌FJW1生防制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一种巨大芽胞杆菌FJW1生防制剂及其制备方法和应用。
技术背景
农业生产长期依赖化学肥料，不仅浪费大量不可再生资源，还导致土质变差、农产品品质下降和环境污染等环境问题，极大影响了人类的健康生存。随着人们环保意识的逐渐提高，生物防治作为一种无毒无害、无污染的处理方法，在防治植物病害方面已经得到了广泛的应用。由于芽孢杆菌具有生长迅速繁殖快，营养要求简单，抗逆性强，且绿色无污染等优点，多年来一直是生防微生物的研究热点。例如枯草芽孢杆菌F2923能有效抑制丝状真菌的生长，淀粉解芽孢杆菌LP-5能抑制梨黑斑病菌孢子萌发和菌丝生长，从而可以防治梨黑斑病害的发生，还有多种芽孢杆菌能促进植物生长。
巨大芽胞杆菌是一种植物根系促生细菌，也是微生物肥料中的常用菌种；它是一种解磷促钾细菌，研究表明其结卵磷脂土壤中植物无法直接利用的吸附态有机磷和无机磷有明显的分解作用，能提高土壤肥力，对固氮具有增效作用，能促进作物增产，具有生物防治功能，可降低水体中氰化物等；对水体环境的生态平衡起到一定的促进作用；对无机磷、有机磷、磷矿粉等均有一定程度的分解能力，其中分解无机磷的能力较明显，同时固定空气中的氮气，促进作物增产。
发明内容
本发明的目的是提供巨大芽胞杆菌FJW1在制备生防制剂中的应用，所述的巨大芽胞杆菌FJW1的保藏编号为CCTCC NO:M 2019660。
本发明的另一个目的在于提供巨大芽胞杆菌FJW1生防制剂的制备方法，利用液体高密度分批发酵技术；高效的芽胞提取回收工艺，产品活芽胞数高。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人自陕西渭南市蒲城县土壤中筛选出一株对多种菌有良好抑制作用的，耐盐碱的菌株，该菌株可制备成生防菌用于农业，该菌株已于2019年8月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名：巨大芽孢杆菌(Bacillusmagaterium) FJW1，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019660。
巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)FJW1在制备成生防菌剂中的应用，包括以本发明的菌株为唯一有效成分，或者有效成分之一，用于制备成生防菌剂或是抑菌剂。
巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)FJW1的高密度发酵方法也为本发明的保护范围，该方法包括下述步骤：
1)巨大芽孢杆菌FJW1活化后集中于种子培养基，搅拌转速180-240r/min，通气量2-5m3/h，培养温度为20-40℃；
所述的种子培养基组成为，g/L：玉米淀粉15.00-20.00，酵母抽提物4.00-6.00，豆粕粉 5.00-10.00，K2HPO43.00-5.00，KH2PO40.5-2.5，NaCl5.00-6.00，pH6.0-8.0。
2)种子液接种于发酵培养基，发酵培养条件为：搅拌转速180-240r/min，通气量2-5m3/h，培养温度为20-40℃，在培养过程中根据泡沫的高涨情况进行消泡，当90％以上的菌体已形成成熟的芽胞时，即可放罐结束培养，
发酵培养基组成为g/L：玉粉淀粉14.00-16.00，玉粉粉13.00-16.00，豆粕粉4.00-6.00，玉米浆5.00-8.00，酵母抽提物3.00-6.00，硫酸铵0.30-1.00，七水硫酸镁1.00-3.00，碳酸钙 1.00-4.00，磷酸氢二钾0.20-1.00，氯化锰0.10-1.00，pH6.0-8.0。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明提供的巨大芽孢杆菌FJW1(CCTCC NO：M 2019660)对多种植物病原菌有较强的抑制效果，可作为一种优良的生防制剂。
2.本发明提供了巨大芽孢杆菌FJW1种子培养基、发酵培养基的配方及高密度发酵方法，使其放罐时的芽孢数至少有1010CFU/ml，适合大规模生产。
附图说明
图1为巨大芽孢杆菌FJW1对黑曲霉的抑制作用示意图。
具体实施方式
本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均为本领域的常规方案。
实施例1：
巨大芽孢杆菌FJW1的分离及鉴定：
来自于陕西渭南市蒲城县土样2.5g置于50ml的无菌水中，30℃250rpm摇1h，之后取500μl 土壤悬液在装有4.5ml无菌水的PA瓶中进行梯度稀释。取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5这几个稀释度的土壤悬液分别加在培养基中进行涂布，培养24h、48h、72h、96h后观察平板菌落生长情况，将所有长出来的菌落分别挑出来，进行抑菌活性实验；选择抑菌率高且抑菌谱广的细菌，再进一步进行耐盐碱的筛选；最终筛选出了巨大芽孢杆菌FJW1。
(1)形态特征
分离得到的耐盐碱的巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)FJW1，在LB固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落形态不规则，边缘褶皱，粗糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黄色。
(2)生理生化实验
生理生化表现为革兰氏染色显示呈阳性，可水解淀粉，能与硝酸盐反应产生还原反应，甲基红试验为阴性，过氧化氢酶阳性，不产生硫化氢，具备分解明胶的能力。
(3)巨大芽孢杆菌FJW1的基因鉴定
用细菌DNA抽提试剂盒提取待测菌株的基因组DNA，具体操作步骤参照说明书。以提取的细菌基组DNA作为模板，对细菌进行扩增，扩增16S rRNA的引物：
27F:5＇-GTTTGATCCTGGCTCAG-3＇
1492R:5＇-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3＇；
序列经Blast同源序列检索发现其属于一株巨大芽孢杆菌，该菌株已于2019年8月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名：巨大芽孢杆菌 (Bacillus magaterium)FJW1，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019660。
实施例2：
巨大芽孢杆菌FJW1的耐受性测试：
(1)耐pH范围实验：
将巨大芽孢杆菌种子液按照1％的接种量分别接种于初始pH不同的LB培养基中，在 37℃、200r/min条件下培养，培养14h后取样测OD600。培养基的初始pH梯度设置为3、4、5、6、7、8、9、10。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
pH 3 4 5 6 7 8 9 10
OD<sub>600</sub> 0.043 0.052 0.139 4.361 5.764 4.415 0.19 0.016
(2)耐盐浓度试验：
将巨大芽孢杆菌种子液按照1％的量分别接种于盐浓度不同的LB培养基中，在37℃、 200r/min条件下培养，培养14h后取样测OD600。培养基的盐浓度梯度设置为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％；以上百分比，如1％就是100ml溶液中有1g氯化钠。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
Figure RE-GDA0002321656450000041
(3)生长温度实验：
将巨大芽孢杆菌种子液按照1％的量接种于LB培养基中，在不同温度条件下、200r/min 条件下培养，培养14h后取样测OD600。培养基的温度梯度设置为20℃、28℃、37℃、40℃、 45℃。
Figure RE-GDA0002321656450000042
实施例3：
巨大芽孢杆菌FJW1对植物病原菌的抑制作用：
采用抑菌圈法测定巨大芽孢杆菌对病原菌的抑制能力。将活化好的巨大芽孢杆菌种子液适当稀释后涂布到PDA平板上，以涂布无菌水作为对照试验组。在长满病原真菌的PDA平板上进行打孔，挑取菌块倒置接种在凃有巨大芽孢杆菌的PDA平板上，使长有真菌的一侧接触平板，将平板置于37℃培养5d。随后测量真菌菌落直径，计算抑菌率，从而分析抑菌的效果。
本实验选取的植物病原菌有香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporumF.sp.Cubense)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、厚垣镰刀菌(Fusariumchlamydosporum)、青霉菌(Penicilliumglaucum)、毛霉菌 (Rhizomucor variabilis)、香蕉枯萎病菌、根霉菌(Rhizopusnigricans)、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、细极链格孢(Alternaria tenuissima)、漆斑菌(Myrothecium roridum)、枝孢菌 (Cladosporium cladosporioides)，黑曲霉(Aspergillus niger)。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1 000mL，pH为自然pH，115℃高压蒸汽灭菌30min。
Figure RE-GDA0002321656450000051
注：D，对照平板菌落直径(mm)；d，实验平板菌落直径(mm)。
巨大芽孢杆菌FJW1对常见的香蕉枯萎病菌、青霉和毛霉有非常好的防治效果，对引起这三种植物病害的致病菌的抑制率均能达到93％以上；该菌株对引起作物腐根病的镰刀菌也表现出非常好的抑制效果，抑菌率均达到87％以上；特别是对腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、厚垣镰刀菌的抑制效果更是达到91％以上；对引起瓜果软腐病的根霉的抑制率达到91％以上；对引起灰霉病的灰葡萄孢霉和引起大豆叶斑病、棉花焦斑病的漆斑霉的抑制率达到51％以上；对引起铁皮石斛黑斑病的细极链格孢的抑制率虽然27％左右，但能明显看出对其生长数量的抑制非常明显；对引起玉米穗腐病的枝孢菌的抑制率为82％以上，且对黑曲霉也有明显的抑制效果(图1)。综上看出巨大芽孢杆菌FJW1对多种植物治病菌都有良好的抑制率，具有广谱抑制性。对各菌的抑菌率如下表所示。
序号 病原菌 D d 抑菌率(％)
1 茄病镰刀菌 89.03 31.15 87.76
2 腐皮镰刀菌 66.62 19.98 91
3 厚垣镰刀菌 61.88 11.76 96.39
4 尖孢镰刀菌 76.31 13.37 96.95
5 香蕉枯萎病菌 71 10.76 97.7
6 青霉 87.39 8.94 98.95
7 毛霉 70.32 17.65 93.7
8 根霉 86.61 25.6 91.26
9 灰葡萄孢霉 65.36 43.21 56.29
10 细极链格孢 69.3 59.1 27.27
11 漆斑菌 65.37 45.33 51.91
12 枝孢菌 40.82 17.28 82.08
实施例4：
巨大芽孢杆菌FJW1在制备成生防制剂中的应用：
巨大芽孢杆菌FJW1在LB液体培养基中，37℃摇床培养20h后，离心除去LB培养基，再将沉淀用无菌水稀释到2.7*10^8CFU/ml。将番茄幼苗培育10天后，挑取12盆生长情况基本一致的健康幼苗进行实验,土壤为黄土：营养土：鸡粪＝4：2：1，原始土PH＝6.96，浇过巨大后的土壤PH＝7.38,一组6盆，其中3盆为实验组，3盆为对照组。实验组每隔2天浇一次致病菌,每次施加量为10ml，每毫升的致病菌浓度为：香蕉枯萎病菌C＝0.042g/ml,厚垣镰刀菌C＝0.064g/ml，每隔4天浇一次巨大芽孢杆菌FJW1，使实验土壤中的巨大芽孢杆菌数量为9*10^6CFU/g干土(原始土壤中巨大芽孢杆菌数量2*10^3CFU/g干土)，对照组每隔两天和实验组同时浇致病菌。此实验中用到的致病菌为:厚垣镰刀菌 (Fusariumchlamydosporum)和香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporumF.sp.Cubense)。将这两组番茄植株放置室外培养80d，室外温度为20℃-35℃，测量两组番茄植株的高度和宽度。
结果表明经巨大芽孢杆菌处理后的番茄长势较好，植株的高度和宽度明显高于仅接种致病菌的对照组。因此巨大芽孢杆菌对植株枯萎病菌有很好的防控作用。
巨大芽孢杆菌对厚垣镰刀菌感染的番茄植株的防治
Figure RE-GDA0002321656450000061
Figure RE-GDA0002321656450000062
巨大芽孢杆菌对香蕉枯萎病感染的番茄植株的防治
Figure RE-GDA0002321656450000071
Figure RE-GDA0002321656450000072
实施例4：
巨大芽孢杆菌FJW1高密度发酵：
1、菌种的活化
巨大芽孢杆菌FJW1划线接种于茄形瓶营养琼脂斜面，斜面培养基组成以g/L计为：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠(NaCl)10，琼脂粉15，pH7.0～7.2；32℃培养24～48h；然后划线转接于LB营养琼脂茄子瓶斜面，32℃培养48～72h，镜检，当90％以上菌体形成芽胞时，即为成熟，准备移种。
2、100L种子罐培养
准备一个内装玻璃珠的无菌本角瓶，用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌苔刮洗下来，装入三角瓶，振荡分散菌苔，获得均匀的菌悬液。将菌悬液在80℃水浴中水浴10分钟，以体积比2％的接种量接入100L种子罐，种子罐的装量系数为70％(v/v)，即100L种子罐装培养基70L。
种子培养基组成为g/L：玉米淀粉15.32，酵母抽提物4.81，豆粕粉5.34，K2HPO43.11， KH2PO4 1.00，NaCl 5.13，pH7.2～7.5。
种子罐培养条件为：搅拌转速200r/min，通气量2-3m3/h，培养温度为30±1℃，培养时间为15h，菌种镜检未见染菌，菌体形态较好，再进行下一步操作。
3、1吨发酵罐培养
上述种子罐种子培养液以体积比10％的接种量移入1吨发酵罐，发酵罐装量系数为65％ (v/v)，即1吨发酵罐装培养基650L。
发酵培养基组成为g/L：玉粉淀粉15.32，玉粉粉14.57，豆粕粉5.34，玉米浆6.82，酵母抽提物4.81，硫酸铵0.333，七水硫酸镁2，碳酸钙2，磷酸氢二钾0.2，氯化锰0.1，pH7.2-7.5。
发酵培养条件为：搅拌转速200r/min，通气量2m3/h，培养温度为31±1℃，，在培养过程中根据泡沫的高涨情况加豆油或泡敌进行消泡，防止因泡沫逃逸出发酵罐而引起杂菌污染；在发酵过程中取发酵液进行镜检，当90％以上的菌体已形成成熟的芽胞时，即可放罐结束培养，在本实施例中，结束培养历经的时间是35h，取样测芽胞数。
放罐芽胞数的检测培养基组成以g/L计为：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠(NaCl)10，琼脂粉15，pH7.0～7.2；
发酵结束后，测得发酵液芽胞数为1.1×1010CFU/ml。
4、离心浓缩菌液
放罐的发酵液通过用盐酸酸化至pH4.5，100目砂网过程除出培养基中大颗粒残渣；滤液通过6000r/min的碟式离心机，离心浓缩650L发酵液通过离心浓缩最终可得300L浓缩液。
5、喷雾干燥
将上述浓缩好的菌液用喷雾干燥塔进行喷粉干燥，进口风温度控制在200℃，出口风温控制在85℃，喷塔出口收粉处带有降温系统，保证在收集粉时，温度降到常温。
通过喷粉后测得菌粉的芽胞数在2，800亿/克。
尾气处理：干燥塔尾气通过收集系统收集，然后通过化学洗涤塔，与化学氧化剂如双氧水、次氯酸钠发生气液接触，这个过程中气相中的臭味成分转移到液相，并被化学氧化剂氧化，从而达到去味、去粉尘等目的，然后达标排放。
实施例5：
巨大芽孢杆菌FJW1高密度发酵：
1、菌种的活化
巨大芽孢杆菌FJW1划线接种于茄形瓶营养琼脂斜面，斜面培养基组成以g/L计为：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠(NaCl)10，琼脂粉15，pH7.0～7.2；32℃培养24～48h；然后划线转接于LB营养琼脂茄子瓶斜面，32℃培养48～72h，镜检，当90％以上菌体形成芽胞时，即为成熟，准备移种。
2、100L种子罐培养
准备一个内装玻璃珠的无菌本角瓶，用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌苔刮洗下来，装入三角瓶，振荡分散菌苔，获得均匀的菌悬液。将菌悬液在80℃水浴中水浴10分钟，以体积比 2％的接种量接入100L种子罐，种子罐的装量系数为60％(v/v)，即100L种子罐装培养基 60L。
种子培养基组成为g/L：玉米淀粉15.32，酵母抽提物4.81，豆粕粉5.34，K2HPO43.11， KH2PO4 1.00，NaCl 5.13，pH7.2～7.5。
种子罐培养条件为：搅拌转速150r/min，通气量2m3/h，培养温度为30±1℃，培养时间为12-16h，菌种镜检未见染菌，菌体形态较好，再进行下一步操作。
3、1吨发酵罐培养
上述种子罐种子培养液以体积比5％的接种量移入1吨发酵罐，发酵罐装量系数为60％ (v/v)，即1吨发酵罐装培养基600L。
发酵培养基组成为g/L：玉粉淀粉15.32，玉粉粉14.57，豆粕粉5.34，玉米浆6.82，酵母抽提物4.81，硫酸铵0.333，七水硫酸镁2，碳酸钙2，磷酸氢二钾0.2，氯化锰0.1，pH7.2-7.5。
发酵培养条件为：搅拌转速200r/min，通气量3m3/h，培养温度为31±1℃，培养时间为 36h。在培养过程中根据泡沫的高涨情况加豆油或泡敌进行消泡，防止因泡沫逃逸出发酵罐而引起杂菌污染；在发酵过程中取发酵液进行镜检，当90％以上的菌体已形成成熟的芽胞时，即可放罐结束培养，发酵时间在35小时；取样测芽胞数。
放罐芽胞数的检测培养基组成以g/L计为：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠(NaCl)10，琼脂粉15，pH7.0～7.2；
发酵结束后，测得发酵液芽胞数达1.22×1010CFU/ml。
4、离心浓缩菌液
放罐的发酵液通过用盐酸酸化至pH4.5，100目砂网过程除出培养基中大颗粒残渣；滤液通过6000r/min的碟式离心机，离心浓缩发酵液，600L发酵液通过离心浓缩最终可得300L 浓缩液。
5、喷雾干燥
将上述浓缩好的菌液用喷雾干燥塔进行喷粉干燥，进口风温度控制在200℃，出口风温控制在85℃，喷塔出口收粉处带有降温系统，保证在收集粉时，温度降到常温。
通过喷粉后测得菌粉的芽胞数在3，100亿/克。
尾气处理：干燥塔尾气通过收集系统收集，然后通过化学洗涤塔，与化学氧化剂如双氧水、次氯酸钠发生气液接触，这个过程中气相中的臭味成分转移到液相，并被化学氧化剂氧化，从而达到去味、去粉尘等目的，然后达标排放。

Claims (1)

1.巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）在制备成生防菌剂中的应用，所述的巨大芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2019660；
所述生防菌剂由高密度发酵方法制备得到，所述高密度发酵方法包括下述步骤：
1）巨大芽孢杆菌活化后接种于种子培养基，搅拌转速180-240r/min，通气量2-5m3/h，培养温度为20-40℃；
所述的种子培养基组成为，g/L：玉米淀粉15.00-20.00，酵母抽提物4.00-6.00，豆粕粉5.00-10.00，K2HPO43.00-5.00，KH2PO40.5-2.5， NaCl 5.00-6.00，pH6.0-8.0；
2）种子液接种于发酵培养基，发酵培养条件为：搅拌转速180-240r/min，通气量2-5m3/h，培养温度为20-40℃，在培养过程中根据泡沫的高涨情况进行消泡，当90%以上的菌体已形成成熟的芽孢时，放罐结束培养；
发酵培养基组成为，g/L：玉米淀粉14.00-16.00，玉米粉13.00-16.00，豆粕粉4.00-6.00，玉米浆5.00-8.00，酵母抽提物3.00-6.00，硫酸铵0.30-1.00，七水硫酸镁1.00-3.00，碳酸钙1.00-4.00，磷酸氢二钾0.20-1.00，氯化锰0.10-1.00，pH6.0-8.0；
所述生防菌剂用于抑制尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、厚垣镰刀菌（Fusarium chlamydosporum）、灰绿青霉（Penicillium glaucum）、多变根毛霉（Rhizomucor variabilis）、黑根霉（Rhizopus nigricans）、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、细极链格孢（Alternaria tenuissima）、露湿漆斑菌（Myrothecium roridum）、枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）或黑曲霉（Aspergillus niger）。
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