CN111793571B - 一株耐盐碱的巨大芽孢杆菌fjw1及在制备植物病原菌抑菌剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株巨大芽孢杆菌FJW1及在制备植物病原菌抑菌剂中的应用，本发明涉及到的巨大芽孢杆菌FJW1，保藏编号为CCTCC M 2019660，该菌株具有耐碱，环境适应性强，抗植物病原菌等功能；能在pH6‑pH8，13%盐浓度中生长，对多种镰刀菌属的病原菌抑制效果较好，抑菌率高达95%，对香蕉枯萎病的抑制率为97%以上，对青霉和毛霉的抑制率为93%以上，对根霉的抑制率为91%以上，对枝孢菌的抑制为82%以上，对灰葡萄孢霉、漆斑菌的抑制率为51%以上，对细极链格孢的抑制率为27%以上，具备制备成生防菌的潜在应用价值。

Description

一株耐盐碱的巨大芽孢杆菌FJW1及在制备植物病原菌抑菌剂 中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株巨大芽孢杆菌FJW1及在制备抑菌剂中的应用。
背景技术
开发和利用微生物肥料，是我国农业持续发展的重要途径。现阶段农药过量使用所产生的环境污染问题及病虫害的抗药性问题、农药残留带来的粮食安全问题越发严重。微生物农药因其具备绿色防控的优点，具备环境友好型、促进和谐生态、保障食品安全等突出特点而备受关注。
芽孢杆菌类制剂由于抗逆性强和能长久储存越来越受到大家的重视。相对于细菌的营养体，芽胞具有更强的耐受性，所以其产品在生产加工、保藏运输、应用范围等方面更具优势，是开发微生物农药的首选菌。例如苏云金芽胞杆菌可制成杀虫剂，巨大芽胞杆菌可制备解磷菌肥。但研究核心仍然是对性能优异的菌种的筛选。
巨大芽孢杆菌的研究早在一百多年前就开始了，其在工业和农业上的用途非常广泛。在养殖业中，巨大芽孢杆菌可以抑制恶臭气体的产生、提高营养饲料吸收率、增强机体消化酶活性并改善肠道形态[1]、能提高牛羊标准产奶量、促进纤维分解和益生菌繁殖[2]等；在环境净化上，巨大芽孢杆菌可以修复水体富营养化、促进原油降解、可分泌生物絮凝剂去除水中的金属离子[3]、可以帮助植物联合修复重金属污染[4]；在生物肥料应用方面，巨大芽孢杆菌是一种根际促生菌[5]、可以有效解磷促钾[6]、提高土壤肥力；在工业生产上，巨大芽孢杆菌可以用于生产抗菌肽酯、生产谷氨酸脱羧酶[7]和苯基乳酸等产品；在生物防治方面，巨大芽孢杆菌是一种广谱生防菌，可防治不同植物的细菌和真菌病害，如烟草灰霉病、水稻纹枯病、毛竹枯梢病、香蕉灰斑病等，还能防治引起胡萝卜软腐病的欧文氏菌[8]、魔芋软腐病[9]、线虫病[10]等。
巨大芽孢杆菌抑菌原理尚不是特别明确。报道中巨大芽孢杆菌可以产生一些活性物质如苯乙酸甲酯、亚油酸已酯、苯乙酸乙酯[11]，有的巨大芽孢杆菌也能产生抗菌肽酯或者诱导植物产生抗菌活性物质[10]。但目前报道的可作为生防菌的巨大芽孢杆菌，对病菌的抑制种类只有一两种，严重限制了其应用范围。
针对上述问题，本发明筛选出了一株耐盐碱的巨大芽孢杆菌，该菌株不但对十几种致病菌均有广谱性抑制效果，且抑菌率也非常高；同时该菌株对盐碱也具有良好的耐受性，具有极大的开发成生防菌的潜力。
参考文献
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[11]宋美仙.抗萝卜细菌性软腐病的银杏内生细菌的初步研究_宋美仙[D].[出版地不详]:福建农林大学,2011.
发明内容
本发明的目的在于提供一株耐盐碱的巨大芽孢杆菌FJW1，该细菌保藏在中国典型培养物保藏中心，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)FJW1，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019660。
本发明的另一个目的在于提供一株耐盐碱的巨大芽孢杆菌FJW1在制备成植物病原菌抑菌剂中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人自陕西渭南市蒲城县土样中，分离出一株耐盐碱，对多种病原菌具有抑菌作用，且抑菌率高的细菌，经鉴定为巨大芽孢杆菌，该细菌已于2019年8月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名：巨大芽孢杆菌(Bacillusmagaterium)FJW1，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019660。
分离得到的耐盐碱的巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)FJW1，在LB固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落形态不规则，边缘褶皱，粗糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黄色。生理生化表现为革兰氏染色显示呈阳性，可水解淀粉，能与硝酸盐反应产生还原反应，甲基红试验为阴性，过氧化氢酶阳性，不产生硫化氢，具备分解明胶的能力。
一株耐盐碱的巨大芽孢杆菌FJW1在制备成植物病原菌抑菌剂中的应用，所述的植物病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、厚垣镰刀菌(Fusarium chlamydosporum)、青霉菌(Penicilliumglaucum)、毛霉菌(Rhizomucor variabilis)、香蕉枯萎病菌、根霉菌(Rhizopusnigricans)、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、细极链格孢(Alternaria tenuissima)、漆斑菌(Myrothecium roridum)、枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)，或黑曲霉(Aspergillus niger)。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
本发明中的巨大芽孢杆菌生长迅速，耐盐碱能力强，环境适应能力强。
本发明中的巨大芽孢杆菌对导致植物枯萎病的多种致病菌均有较好的抑菌效果。
附图说明
图1为巨大芽孢杆菌FJW1培养性状图。
图2为巨大芽孢杆菌FJW1的革兰氏染色(呈蓝紫色)示意图。
图3为巨大芽孢杆菌FJW1的对不同真菌的抑菌率示意图。
图4为巨大芽孢杆菌FJW1的对不同真菌的抑菌率示意图。
图5为巨大芽孢杆菌FJW1对腐皮镰刀菌的抑制作用示意图。
图6为巨大芽孢杆菌FJW1对厚垣镰刀菌的抑制作用示意图。
图7为巨大芽孢杆菌FJW1对尖孢镰刀菌的抑制作用示意图。
图8为巨大芽孢杆菌FJW1对茄病镰刀菌的抑制作用示意图。
图9为巨大芽孢杆菌FJW1对香蕉枯萎病病原菌的抑制作用示意图。
图10为巨大芽孢杆菌FJW1对毛霉的抑制作用示意图。
图11为巨大芽孢杆菌FJW1对青霉的抑制作用示意图。
图12为巨大芽孢杆菌FJW1对灰葡萄孢霉的抑制作用示意图。
图13为巨大芽孢杆菌FJW1对根霉的抑制作用示意图。
图14为巨大芽孢杆菌FJW1对漆斑菌的抑制作用示意图。
图15为巨大芽孢杆菌FJW1对细极链格孢的抑制作用示意图。
图16为巨大芽孢杆菌FJW1对枝孢菌的抑制作用示意图。
图17为巨大芽孢杆菌FJW1对黑曲霉的抑制作用示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
巨大芽孢杆菌FJW1的分离及鉴定：
来自于陕西渭南市蒲城县土样2.5g置于50ml的无菌水中，30℃250rpm摇1h，之后取500μl土壤悬液在装有4.5ml无菌水的PA瓶中进行梯度稀释。取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5这几个稀释度的土壤悬液分别加在培养基中进行涂布，培养24h、48h、72h、96h后观察平板菌落生长情况，将所有长出来的菌落分别挑出来，进行抑菌活性实验；选择抑菌率高且抑菌谱广的细菌，再进一步进行耐盐碱的筛选；最终筛选出了巨大芽孢杆菌FJW1。
(1)形态特征
分离得到的耐盐碱的巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)FJW1，在LB固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落形态不规则，边缘褶皱，粗糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黄色。
(2)生理生化实验
生理生化表现为革兰氏染色显示呈阳性，如图2所示，可水解淀粉，能与硝酸盐反应产生还原反应，甲基红试验为阴性，过氧化氢酶阳性，不产生硫化氢，具备分解明胶的能力。
(3)巨大芽孢杆菌FJW1的基因鉴定
用细菌DNA抽提试剂盒提取待测菌株的基因组DNA，具体操作步骤参照说明书。以提取的细菌基组DNA作为模板，对细菌进行扩增，扩增16S rRNA的引物：
27F:5＇-GTTTGATCCTGGCTCAG-3＇
1492R:5＇-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3＇；
序列经Blast同源序列检索发现其属于一株巨大芽孢杆菌，该菌株已于2019年8月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名：巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)FJW1，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019660。
实施例2：
巨大芽孢杆菌FJW1的耐受性测试：
(1)耐pH范围实验：
将巨大芽孢杆菌种子液按照1％的接种量分别接种于初始pH不同的LB培养基中，在37℃、200r/min条件下培养，培养14h后取样测OD600。培养基的初始pH梯度设置为3、4、5、6、7、8、9、10。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
pH 3 4 5 6 7 8 9 10
OD<sub>600</sub> 0.043 0.052 0.139 4.361 5.764 4.415 0.19 0.016
(2)耐盐浓度试验：
将巨大芽孢杆菌种子液按照1％的量分别接种于盐浓度不同的LB培养基中，在37℃、200r/min条件下培养，培养14h后取样测OD600。培养基的盐浓度梯度设置为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％；以上百分比，如1％就是100ml溶液中有1g氯化钠。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
盐浓度(％) 1 2 3 4 5 6 7
OD<sub>600</sub> 5.28 4.42 4.50 4.00 3.71 2.51 2.91
盐浓度(％) 8 9 10 11 12 13
OD<sub>600</sub> 2.25 1.03 0.81 0.47 0.20 0.02
(3)生长温度实验：
将巨大芽孢杆菌种子液按照1％的量接种于LB培养基中，在不同温度条件下、200r/min条件下培养，培养14h后取样测OD600。培养基的温度梯度设置为20℃、28℃、37℃、40℃、45℃。
Figure BDA0002208605840000051
实施例3：
巨大芽孢杆菌FJW1对植物病原菌的抑制作用：
采用抑菌圈法测定巨大芽孢杆菌对病原菌的抑制能力。将活化好的巨大芽孢杆菌种子液适当稀释后涂布到PDA平板上，以涂布无菌水作为对照试验组。在长满病原真菌的PDA平板上进行打孔，挑取菌块倒置接种在凃有巨大芽孢杆菌的PDA平板上，使长有真菌的一侧接触平板，将平板置于37℃培养5d。随后测量真菌菌落直径，计算抑菌率，从而分析抑菌的效果。
本实验选取的植物病原菌有香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporumF.sp.Cubense)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、厚垣镰刀菌(Fusarium chlamydosporum)、青霉菌(Penicillium glaucum)、毛霉菌(Rhizomucor variabilis)、香蕉枯萎病菌、根霉菌(Rhizopus nigricans)、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、细极链格孢(Alternariatenuissima)、漆斑菌(Myrothecium roridum)、枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)，黑曲霉(Aspergillus niger)。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1 000mL，pH为自然pH，115℃高压蒸汽灭菌30min。
Figure BDA0002208605840000061
注：D，对照平板菌落直径(mm)；d，实验平板菌落直径(mm)。
巨大芽孢杆菌FJW1对常见的香蕉枯萎病菌、青霉和毛霉有非常好的防治效果，对引起这三种植物病害的致病菌的抑制率均能达到93％以上；该菌株对引起作物腐根病的镰刀菌也表现出非常好的抑制效果，抑菌率均达到87％以上；特别是对腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、厚垣镰刀菌的抑制效果更是达到91％以上；对引起瓜果软腐病的根霉的抑制率达到91％以上；对引起灰霉病的灰葡萄孢霉和引起大豆叶斑病、棉花焦斑病的漆斑霉的抑制率达到51％以上；对引起铁皮石斛黑斑病的细极链格孢的抑制率虽然27％左右，但能明显看出对其生长数量的抑制非常明显；对引起玉米穗腐病的枝孢菌的抑制率为82％以上，且对黑曲霉也有明显的抑制效果(图17)。综上看出巨大芽孢杆菌FJW1对多种植物治病菌都有良好的抑制率，具有广谱抑制性。对各菌的抑菌率如下表所示。
Figure BDA0002208605840000062
Figure BDA0002208605840000071
由以上实施例可知，本发明提供了一株巨大芽孢杆菌菌株FJW1，该菌株耐盐浓度高，对于防治镰刀菌引起的植物枯萎病和青霉毛霉、根霉引起的瓜果软腐病、枝孢菌引起的玉米穗腐病、灰葡萄孢霉引起的灰霉病、漆斑菌引起的大豆叶斑病具有较好的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术邻域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一株分离的巨大芽孢杆菌（Bacillus magaterium），所述巨大 芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌FJW1，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019660。
2.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌在制备植物病原菌抑菌剂中的应用，所述的植物病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、厚垣镰刀菌（Fusarium chlamydosporum）、灰绿青霉（Penicillium glaucum）、多变根毛霉（Rhizomucor variabilis）、黑根霉（Rhizopus nigricans）、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、细极链格孢（Alternaria tenuissima）、露湿漆斑菌（Myrothecium roridum）、枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）或黑曲霉（Aspergillus niger）。
3.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌在制备同时抑制尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、厚垣镰刀菌（Fusarium chlamydosporum）、灰绿青霉（Penicillium glaucum）、多变根毛霉（Rhizomucor variabilis）、黑根霉（Rhizopus nigricans）、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、细极链格孢（Alternaria tenuissima）、露湿漆斑菌（Myrothecium roridum）、枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）和黑曲霉（Aspergillus niger）抑菌剂中的应用。
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