CN107099467B - 一株铜绿假单胞菌xcs007及其在防治烟草黑胫病中的应用 - Google Patents

Abstract

一株铜绿假单胞菌XCS007，分类名为Pseudomonas aeruginosa，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月5日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12330。铜绿假单胞菌XCS007可高效产生几丁质酶，最高活性达到12.25U/mL，对烟草黑胫病菌有优良的拮抗作用：菌液及菌液粗提物对烟草黑胫病菌菌丝抑制率达到91％以上。生防效果好：对接种烟草黑胫病菌的烟草植株，菌液及菌液粗提物的防治效果均能达到80％以上。用于生物防治对环境友好、不易产生抗药性、对人畜安全，为烟草绿色防控发展创造条件。

Description

一株铜绿假单胞菌XCS007及其在防治烟草黑胫病中的应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一株铜绿假单胞菌XCS007及其在防治烟草黑胫病中的应用。

背景技术

烟草黑胫病是一种重要的真菌性土传病害，由寄生疫霉烟草致病变种(Phytophthora parasitica var.nicotianae)引起。烟草黑胫病可以侵染和危害烟草任何生长阶段和现有栽培品种，平均发病率高达10％以上，常表现为黑胫、穿大褂、黑膏药、碟片状、烂腰等症状。防治烟草黑胫病通常采用抗病品种的选育、化学防治、生物防治、加强栽培管理等措施，但是化学农药的滥用易诱发病原菌产生抗药性，烟草抗病品种随着使用年限的增加抗病性逐渐丧失等问题突出。生物防治具有对环境友好、不易产生抗药性以及对人畜安全等优势，可为烟草绿色防控发展创造条件，尤其是生防菌(拮抗菌)的筛选与应用作为其重要内容成为发展的必然趋势，具有巨大的潜在应用和推广价值。

研究表明，生防菌主要通过产生多种抗生代谢产物和酶类、竞争病原菌的营养和空间位点、诱导植物系统抗病性等多种方式来保护植物免受病原菌的危害。防治烟草黑胫病的生防菌广泛存在于植物体内或土壤中，主要包括细菌(如芽胞杆菌属、假单孢菌属)、真菌(如木霉属、青霉菌属)和放线菌(如链霉菌属)等，其中芽胞杆菌和假单胞菌研究和应用的较多。

几丁质(Chitin)是多数病原真菌的细胞壁和昆虫体壁的主要组成成分，但不存在于植物细胞壁中。在1905年，Benecke首次发现贝内克氏菌内的几丁质酶能够降解几丁质后，对几丁质酶的研究得到长足发展。现已有研究表明，几丁质酶能在体外抑制木霉(Trichoderma viride)、指状青霉(Penicillium digitatum)，炭疽菌(Colletitrochumlindemuthianum)、寄生隐从赤孢菌(Cryphonectria parasitica)、茄链格孢、TMV等的生长，可增强植物抗真菌病害的能力。另外，几丁质酶的活性底物还有其它物质活性，包括溶菌酶活性、抑制昆虫淀粉酶活性、核糖体失活蛋白的活性、肌动蛋白结合活性、脱乙酰壳多糖酶活性、参与催化转糖基反应等。同时，几丁质降解产物-几丁寡糖在离体条件下对烟草黑胫病具有显著防治效果，能显著提高烟草体内的SOD、POD、PPO和几丁质酶活性。

目前虽有生防菌的相关研究，但是其防治烟草黑胫病的效果较差，很少产生几丁质酶，且即使产生几丁质酶，其活性也较低。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提供一株高几丁质酶活性的生防菌，能有效防治烟草的黑胫病。

一株铜绿假单胞菌XCS007，分类名为Pseudomonas aeruginosa，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月5日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12330。

进一步地，铜绿假单胞菌XCS007的菌体呈棒状，革兰氏染色显阴性。

进一步地，所述铜绿假单胞菌XCS007的培养基组份为：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L。

进一步地，所述铜绿假单胞菌XCS007的培养条件为：27-33℃、pH6.5-7.5、100-200r/min恒温震荡培养24-72h。优选30℃、pH7.0、150r/min恒温震荡培养48h。

上述铜绿假单胞菌XCS007在防治烟草黑胫病中的应用。

进一步地，铜绿假单胞菌XCS007应用的形式为菌液，应用方式为灌根，每株烟苗灌根量共1×10⁷-9×10⁷个菌体。更进一步地，灌根采用分2-3次灌根的形式，第一次在烟株生长到8-10片真叶时，以后每隔7天灌根一次。更进一步地，每次灌根量相同。

进一步地，铜绿假单胞菌XCS007应用的形式为菌液粗提物，应用方式为灌根，每株烟苗灌根所用粗体物的总量来自于1×10⁹-9×10⁹个菌体。更进一步地，灌根采用分2-3次灌根的形式，第一次在烟株生长到8-10片真叶时，以后每隔7天灌根一次。更进一步地，每次灌根量相同。

本发明从烟草根际土壤中分离筛选到1株对烟草黑胫病菌具有较好拮抗活性的铜绿假单胞菌XCS007，具有以下优势：

(1)可高效产生几丁质酶，最高活性达到12.25U/mL，由于几丁质酶广泛存在于动、植物、真菌、病毒、细菌、放线菌中，参与多种生理过程，植物防卫和抗逆反应，因此对烟草真菌性病害的防治提供了新的途径。

(2)对烟草黑胫病菌有优良的拮抗作用：菌液对烟草黑胫病菌菌丝抑制率达91.80％，菌液粗提物对烟草黑胫病菌菌丝抑制率达97.11％。

(3)生防效果好：在盆栽试验中，分别用菌液及菌液粗提物处理接种烟草黑胫病菌的烟草植株，防治效果分别达到83.18％和83.55％；在大田试验中，分别用菌液及菌液粗提物处理接种烟草黑胫病菌的烟草植株，防治效果分别达到78.64％、79.54％；和58％甲霜·锰锌防治效果相当，且优于生物制剂枯草芽胞杆菌，在烟草黑胫病的生物防治方面具有潜在的应用价值，发展和应用前景良好。

(4)生物防治对环境友好、不易产生抗药性、对人畜安全，为烟草绿色防控发展创造条件。

附图说明

图1在对峙培养中，菌株XCS007对黑胫病菌的抑制效果(处理组中箭头所指为抑菌带)；

图2利用牛津杯法，菌株XCS007粗提物对黑胫病菌的抑制效果；

图3菌株XCS007对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制作用(400×)；

图4菌株XCS007培养滤液的几丁质酶活性变化；

图5在扫描电镜下菌株XCS007的形态

图6根据16S rRNA基因序列构建的菌株XCS007系统发育树；

图7温度、pH和培养时间对菌株XCS007生长量的影响。

生物材料样品保藏信息：

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)XCS007，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年4月5日，保藏编号为CGMCC No.12330。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

所有实施例中用到的材料如下：

主要试剂和材料如下：

DNA快速提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，货号EE161-01)；

几丁质(Sigma，货号C7170-100G)；

N-乙酰-D-氨基葡萄糖(北京索莱宝科技有限公司，货号N8420)；

革兰氏染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号G1060)；

58％甲霜·锰锌可湿性粉剂(江苏宝灵化工股份有限公司)；

枯草芽胞杆菌可湿性粉剂(德强生物股份有限公司)；

其他药剂均为国药分析纯(AR)。

烟草品种：红花大金元(易感品种)，由国家烟草改良中心提供。

烟草黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)：由国家烟草改良中心提供。

数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司，KQ500DA型。

旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂，SY-5000型。

拮抗菌分离、培养和测定所用的培养基如下：

拮抗菌的培养和分离选用营养琼脂培养基NA(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L，调节pH6.8)，和营养肉汤培养基NB(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1L)。

抑菌活性测定选用燕麦培养基OA(燕麦片18g，琼脂18.0g，蒸馏水1L，调节pH6.8)。

生理生化性状测定选用运动型培养基(明胶80g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂4g，蒸馏水1L，调节pH6.8)。

柠檬酸盐利用情况选用柠檬酸盐琼脂培养基(MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄H₂PO₄ 1g，K₂HPO₄，柠檬酸钠2g，溴麝香草酚蓝80mg，琼脂15g，蒸馏水1L，调节pH6.8)。

淀粉分解情况选用淀粉水解培养基(含有0.2wt％的可溶性淀粉的NA培养基)。

明胶液化情况选用明胶培养基(在NA培养液中加10wt％的明胶，调节pH7.0)。

产几丁质酶能力分析选用几丁质酶培养基(质量比：0.1％蛋白胨，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.1％KH₂PO₄，0.2％NaCl，0.2％1％胶体几丁质，调节pH 6.8)。

实施例1铜绿假单胞菌XCS007的筛选及其对黑胫病菌的拮抗作用

1.1拮抗菌的分离和筛选

从山东省诸城市烟草试验站有黑胫病病株的烟田中采集土样，选取典型发病植株和相邻的健康植株作为对象，取5-10cm深处的根际土壤，以期获得对烟草黑胫病菌具有高效拮抗性的拮抗菌株。称取1g病土放到10mL带塞试管中，加入9mL灭菌水，室温下，200r/min，震荡1h。取上清液1mL梯度稀释至10^-4、10^-5、10^-6倍，分别用涂布器在NA培养基上均匀涂布，放于37℃培养箱恒温培养3d。挑取生长性状不同的单菌落21株，作为拮抗菌的候选菌，进行纯化培养(用接种环挑取单菌落，在NA固体培养基上划线，封口后，放于37℃培养箱恒温培养48h，按照上述步骤重复1-2次，获得纯化的单菌落)并保存。

1.2拮抗菌候选菌对黑胫病菌的拮抗作用

采用对峙培养法，用灭菌的打孔器(直径5mm)将烟草黑胫病菌接种到燕麦平板培养基(OA)上，候选菌在离烟草黑胫病菌饼2.5cm处平行两侧划两条短线(用接种环沾取少量菌液后，在培养基上划两道，长度约0.5cm)，此为处理组，对照组采用不含候选菌的空白OA培养液。然后倒置放入28℃恒温箱中培养5d，检查黑胫病菌菌落周围有无抑菌带，并利用十字交叉法测量其抑菌直径d₁(mm)，抑菌率(％)＝(对照组菌落直径d₀-处理组菌落直径d₁)/处理组菌落直径d₁]×100％。

经验证，21株候选菌对黑胫病菌的抑制率在50-90％之间，其中菌株XCS007的拮抗效果最为明显，利用对峙培养法，28℃培养5d后，对烟草黑胫病的抑菌直径达到78.68±1.22mm，抑菌率达到91.80±1.00％，见图1。

1.3拮抗菌粗提物对黑胫病菌的拮抗作用

利用牛津杯法并稍加改动，将21株候选菌分别接种于装有1L液体燕麦培养基的三角瓶中，28℃、120r/min振荡培养48h，经计数调整使每份菌液中菌体的含量均为1×10⁸个菌/mL。向200mL菌液中按体积比2:1的比例加入乙酸乙酯溶液进行萃取，混匀后放入数控超声波清洗器进行超声30min，超声能量为90(功率)，每8小时一次，共超声3次。超声震荡完毕后，收集上层萃取液，于旋转蒸发仪中收集拮抗菌的粗提物2.5mL。将粗提物用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在培养基平板上与黑胫病菌块等距离2.5cm处平行放置2个牛津杯，每杯中接入无菌粗提物100μL，28℃培养72h，以乙酸乙酯溶液作为空白对照，利用十字交叉法测量抑菌圈直径d₂(mm)，计算抑菌率，抑菌率(％)＝(对照组菌落直径d₀-处理组菌落直径d₂)/处理组菌落直径d₂]×100％。结果显示，XCS007菌株粗提物对烟草黑胫病菌的抑菌直径达到82.54±1.05mm，抑制率达到97.11±0.58％，与其它20株候选菌差异显著。表明拮抗菌XCS007对黑胫病菌具有显著的抑制效果，见图2。

用灭菌的接种环挑取抑菌圈边缘菌丝，在显微镜(10×40)下观察粗提物对黑胫病菌丝形态的作用。拮抗菌的生防功能由一种或多种机制决定，包括拮抗作用、营养与生态位点的竞争、诱导抗病性等机理。菌株XCS007粗提物可有效抑制黑胫病菌，通过显微镜观察可知，烟草黑胫病菌的菌丝形态、细胞原生质体未产生明显影响，表明菌株XCS007粗提物未使菌丝产生畸形(图3)。由此推论，菌株XCS007粗提物中可能含有某种或多种抗生素或水解酶(如几丁质酶)类，对黑胫病菌丝起到了溶解作用。

1.4菌株XCS007产几丁质酶能力分析

100mL锥形瓶内加入50mL液体几丁质酶培养基，pH值为6.8，1×10⁵Pa灭菌30min备用。将活化的XCS007细菌培养液以1％接种量接种于几丁质酶培养基内，37℃、120rpm摇培，3次重复；于0d、0.5d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d分别取样，供几丁质酶活性测定。酶促反应体系包括：0.1mL菌培养滤液、0.5mL 1.0％胶体几丁质、0.4mL 0.1mol/l pH7.0磷酸缓冲液)。3次重复，以反应前加200μl 1mol/l NaOH不发生酶促反应为对照，置于摇床中37℃，150rpm反应2h，反应后立即加200μl 1mol/l NaOH终止反应，11000rpm离心10min，分别取上清液500μl于1mL Schales’液中，沸水显色反应15min，420nm波长测其吸光度。以1h产生1μmolNAG量计算为1个酶活单位(U)。

几丁质酶活性测定依据NAG法，根据已知含量N-乙酰葡萄糖胺(NAG)制作标准曲线，1个酶活单位(U)为1h产生1μmol NAG的量。

王海东等(王海东,陈飚,伦镜盛,王成,胡忠.产几丁质酶菌株SWCH-6的筛选、鉴定及其产酶条件的优化研究[J].微生物学通报,2008,(05):705-711.)人筛选出一株嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophlilla)，酶活力达0.39U/mL，赵洋等(赵洋.渐狭蜡蚧菌对南方根结线虫卵孵化抑制及其几丁质酶基因LACHI1的克隆[D].青岛农业大学,2014.)发现渐狭蜡蚧菌(Lecanicilliumattenuatum)酶活力达16.9U/mL，可有效防治根结线虫。本发明以0.2％胶体几丁质作为主要C源和N源的培养基内，分别于0d、0.5d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d取样，运用NAG法测定几丁质酶活性。由图4可见，菌株XCS007从第0.5d开始产生几丁质酶，之后迅速上升，第5d达到酶活最高峰，为12.25U/mL，之后逐渐下降，并逐渐趋于稳定。综上所述，菌株XCS007可以分泌较高活性的几丁质酶。

1.5菌株XCS007的形态观察

1.5.1革兰氏染色：涂片固定，菌液涂片，干燥，通过火焰1-2次进行固定。经过结晶紫和碘液媒染，95％的乙醇脱色1min，再经番红复染制作薄片，干燥，油镜镜检。菌株XCS007呈红色，为革兰氏阴性菌。

1.5.2电子显微镜下的菌体形态：将培养好的菌株XCS007进行充分离心后，固定、脱水处理、冷冻干燥处理后，最后喷施Pt粉，按照操作要求，分别在扫描电子显微镜和透射电子显微镜下，从不同角度观察菌株XCS007。图5显示菌体呈棒杆状，无芽胞和荚膜，大小为0.4-0.8×1.2-3.0μm。

1.6生理生化性状鉴定

参考《植病研究方法》(方中达编著，中国农业出版社出版)，包括对氧化酶、明胶液化、柠檬酸盐、硝酸盐产N₂、V-P试验、甲基红、吲哚乙酸、葡萄糖、蔗糖、淀粉水解、D-半乳糖、果聚糖、4℃和41℃生长状况等鉴定。

结果显示，浸有XCS007新鲜菌液的滤纸均匀涂抹1.5％二甲基对苯撑二胺，8.5s时，由无色变成红色，表明该拮抗菌产生氧化酶，显阳性；在明胶培养基中穿刺接种该拮抗菌，明胶液化明显，呈阳性；柠檬酸盐培养基接种该菌，3d后变蓝色，表明柠檬酸盐被利用，呈阳性；利用格里斯(Griess-llosvary)试剂法，菌液呈深红色，表明产生亚硝酸盐和N₂；在V-P试验中，菌液不变红色，呈阴性；以甲基红作指示剂，菌液不显红色，呈阴性；利用柯伐克斯(Kovacs)法测定吲哚乙酸的产生，不显红色，表明呈阴性；以溴百里酚蓝作指示剂，探究碳素化合物的利用和分解，表明XCS007拮抗菌能够分解葡萄糖、蔗糖，不分解D-半乳糖、果聚糖、淀粉，均不产气。在41℃，该拮抗菌能够缓慢生长，在4℃下不生长。

1.7菌株XCS007的最适培养条件

1.7.1温度(℃)对菌株XCS007生长量的影响：采用单因素变量，将等量等浓度的XCS007菌液加到相同条件下的NB培养基中，分别在20℃、25℃、27.5℃、30℃、32.5℃、35℃、40℃、45℃下，放在恒温培养箱中150r/min发酵48h，取样测定其OD₆₀₀值，来衡量其生长量大小。如图6所示，菌株XCS007随着温度的增加，生长量呈“先增加后降低”的趋势，其最适温度在30℃。

1.7.2初始pH对菌株XCS007生长量的影响：将等量等浓度的XCS007菌液加到NB培养基中，调节初始pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，在28℃恒温培养箱中150r/min发酵48h，取样测定其OD₆₀₀值。如图7所示，菌株XCS007随着pH的增加，生长量呈“先迅速增加后降低”的趋势，其最适pH在7.0。

1.7.3培养时间(d)对菌株XCS007生长量的影响：将等量等浓度的XCS007菌液加到相同条件下的NB培养基中，在28℃恒温培养箱中150r/min发酵，分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取样测定其OD₆₀₀值。如图7所示，菌株XCS007随着发酵时间的增加，拮抗菌的生长量“先增加后缓慢降低，最后趋于稳定”的趋势，XCS007的最适培养时间为48h。

1.8菌株XCS007的16S rDNA鉴定

(1)挑取纯化培养的XCS007单菌落，接种于5mL NB液体培养基，28℃震荡培养24h，参照DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA。(2)以菌株XCS007基因组DNA为模板，利用799F(5'-AACAGGATTAGATACCCTG-3')和R1492(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')为通用引物扩增拮抗菌16S rDNA。PCR产物经凝胶电泳检测后进行序列测定，测得该菌的16S rDNA核苷酸序列长度为672bp，序列信息见序列表中SEQ ID No.3，GenBank登录号是KX663828。(3)对测序结果进行Blast分析，选取同源序列利用系统进化分析软件MEGA(版本号5.1)中的Neighbor-Joining算法构建系统发育树。由图7可知，菌株XCS007与铜绿假单胞菌(KU041528.1)进化关系最近，同源性近100％。综合菌株的形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析结果，初步鉴定菌株XCS007为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

实施例2铜绿假单胞菌XCS007防治烟草黑胫病的盆栽试验

黑胫病菌的培养：用煮熟的米谷进行培养，28℃培养5d后，黑胫病菌丝长满米谷周围，得到感染用黑胫病菌。

铜绿假单胞菌XCS007的培养：在NB培养基中，28℃，120r/min，震荡培养48h，获得XCS007菌液(用于后面的抗病处理)，测定菌液每毫升约含有2.8-5.3×10⁸个菌体。取200mL菌液，按体积比乙酸乙酯：菌液＝2:1的比例向菌液中加入乙酸乙酯溶液进行萃取，混匀后放入数控超声波清洗器进行超声30min，超声能量为90(功率)，每8小时一次，共超声3次。超声震荡完毕后，收集上层萃取液，于旋转蒸发仪(温度80℃、110转/min，2h，此时旋转蒸发仪处于负压状态，密封减压至500毫米汞柱)中蒸馏，浓缩萃取液，收集XCS007的粗提物2mL(用于后面的抗病处理)。

烟草感染：当盆栽烟株生长到8-10片真叶时，接种黑胫病菌，烟株的茎基部用刀片轻微划伤，将黑胫病菌接种在烟株伤口处(每棵烟苗接种2g黑胫病菌米谷)。

烟草抗病处理：烟草植株接种黑胫病菌24h后，分别将XCS007菌液和粗提物稀释100倍，然后用100倍稀释液进行灌根处理，每棵10mL，7天后进行第二次灌根处理，也是每棵10mL。对照药剂用58％甲霜·锰锌可湿性粉剂和1000亿/g枯草芽胞杆菌粉剂分别500倍液喷雾接种黑胫病菌的烟株，空白对照用等量的无菌水处理，其他均相同。每个处理12株，3次重复。分别于第二次施药处理后第7天调查对照组和处理组的发病率(％)、病情指数和相对防治效果(％)。

发病率＝病株数/烟株总数×100％。

病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)。

以株为单位分级调查。

0级：全株无病。

1级：茎部病斑不超过茎围的1/3，或1/3以下叶片凋萎。

3级：茎部病斑环绕茎围1/3～1/2，或1/3～1/2叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑。

5级：茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围，或1/2～2/3叶片凋萎。

7级：茎部病斑全部环绕茎围，或2/3以上叶片凋萎。

9级：病株基本枯死。

相对防治效果(％)＝(对照组病情指数—处理组病情指数)/对照组病情指数×100％。

以上数据采用DPS数据处理系统Duncan新复极差法进行方差分析计算。

由表1可知，XCS007菌液及其粗提物处理的烟株发病率分别为22.22％、18.52％，与58％甲霜·锰锌差异不显著，与空白对照差异极显著。它们的病情指数分别为8.64、8.23，与58％甲霜·锰锌、枯草芽胞杆菌差异不显著，与空白对照差异极显著。其防治效果分别为83.18％、83.55％，防治效果和58％甲霜·锰锌相当，但好于枯草芽胞杆菌，且差异性显著。通过盆栽试验表明，菌株XCS007及其粗提物对烟草黑胫病具有较好的防治效果。

表1菌株XCS007对烟草黑胫病的温室防治效果

标注：数据表示平均值±标准误，数据采用Duncan氏新复极差法，不同小写字母和大写字母分别表示在P<0.05和P＜0.01水平上差异显著，下同。

实施例3铜绿假单胞菌XCS007防治烟草黑胫病的大田试验

2016年5月-8月，将纯化培养的XCS007拮抗菌液及其粗提物分别施用在贵阳市开阳县和修文县两处常年发生烟草黑胫病严重的试验田，菌液及粗体物每次的株灌根量与实施例2的盆栽试验相同。分别在烟苗移栽后7天、14天、21天喷施或灌根药剂，共施药3次，3次重复，15个小区，每小区100m²，共1500m²。在烟草打顶前期，每小区随机选取具有代表性的30株烟进行病害统计，计算其发病率(％)、病情指数和相对防治效果(％)。

XCS007菌液及其粗提物处理的烟株发病率分别为3.33％、4.44％，与空白对照差异极显著，与58％甲霜·锰锌差异不显著；其中XCS007菌液和58％甲霜·锰锌处理的烟株发病率最低，与枯草芽胞杆菌差异显著。它们的病情指数分别为3.58、3.45，与58％甲霜·锰锌差异不显著，与枯草芽胞杆菌和空白对照差异极显著。其防治效果分别为78.64％、79.54％，和58％甲霜·锰锌防治效果相当，差异不显著，但优于枯草芽胞杆菌，差异极显著。上述分析表明，XCS007菌液、粗提物和化学药剂58％甲霜·锰锌对烟草黑胫病的防治效果相当，且优于生物制剂枯草芽胞杆菌，发展和应用前景良好。

表2菌株XCS007对烟草黑胫病的大田防治效果

菌株XCS007的几丁质酶产量极高，由于几丁质酶与多种生理过程相关，包括发育调控、抑制真菌、细菌、抗虫、参与共生固氮等作用，参与植物防卫、抗逆反应，因此提高了烟草对黑胫病菌的防治效果，也由此拓展了该拮抗菌的作用，为进一步探究该菌提供更多可能性。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州省烟草公司贵阳市公司；中国农业科学院烟草研究所

<120> 一株铜绿假单胞菌XCS007及其在防治烟草黑胫病中的应用

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 799F

<400> 1

aacaggatta gataccctg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1492

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 672

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 3

tagtccacgc cgtaaacgat gtcgactagc cgttgggatc cttgagatct tagtggcgca 60

gctaacgcga taagtcgacc gcctggggag tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat 120

tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 180

ttacctggcc ttgacatgct gagaactttc cagagatgga ttggtgcctt cgggaactca 240

gacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgt 300

aacgagcgca acccttgtcc ttagttacca gcacctcggg tgggcactct aaggagactg 360

ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc ttacggccag 420

ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca aagggttgcc aagccgcgag gtggagctaa 480

tcccataaaa ccgatcgtag tccggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagtcggaa 540

tcgctagtaa tcgtgaatca gaatgtcacg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 600

gcccgtcaca ccatgggagt gggttgctcc agaagtagct agtctaaccg caagggggac 660

ggttaccacg ga 672

Claims (6)

1.一株铜绿假单胞菌XCS007，分类名为Pseudomonas aeruginosa，其特征在于，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月5日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12330。

2.权利要求1所述的铜绿假单胞菌XCS007在防治烟草黑胫病中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，铜绿假单胞菌XCS007应用的形式为菌液，应用方式为灌根，每株烟苗灌根量共1×10⁷-9×10⁷个菌体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，灌根采用分2-3次灌根的形式，第一次在烟株生长到8-10片真叶时，以后每隔7天灌根一次，每次灌根量相同。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，铜绿假单胞菌XCS007应用的形式为菌液粗提物，应用方式为灌根，每株烟苗灌根所用粗提物的总量来自于1×10⁹-9×10⁹个菌体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，灌根采用分2-3次灌根的形式，第一次在烟株生长到8-10片真叶时，以后每隔7天灌根一次，每次灌根量相同。

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