CN105132334A - 一种防治烟草黑胫病的短短芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一种防治烟草青枯病的短短芽孢杆菌及其应用，属于微生物及微生物应用领域。分类命名：<i>Brevibacillus</i><i>？brevis</i>，该菌<i>B.？brevis</i>？GB6-1的16S？rRNA序列（1031bp）已上传至NCBI的GenBank数据库（序列号：KP715564），于2015年7月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC？No:11135。通过大量的生物学实验证明，本发明的短短芽孢杆菌具有高效分泌几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶特性，对烟草黑胫病菌具有明显的抑制作用。

Description

一种防治烟草黑胫病的短短芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及农作物病害的生物防治，具体说是一株高效产生几丁质酶且对烟草黑胫病具有明显抑制作用的短短芽孢杆菌，属于微生物及微生物应用领域。

背景技术

烟草黑胫病Phytophthoraparasiticaf.sp.nicotianae是威胁我国烟草生产的主要病害，主要为害植株的根茎，严重降低烟草产量和品质。传统的防治措施主要采用化学防治、栽培防治和抗病品种选育等。烟草为叶用经济作物，长期大规模使用化学杀菌剂防治烟草黑胫病可引致农药残留、抗药性和环境污染，使烟叶的品质下降，同时也限制烟叶的国内外贸易。而栽培防治和抗病品种选育措施具有局限性，该病害的防治尚无理想的安全有效控制措施。筛选和鉴定具有高效生防效果和光谱杀菌能力的微生物菌株是植物病害生物防治研究的重要内容，特别是具有高效产生几丁质酶和葡聚糖酶的菌株（PrasannaL,EijsinkVGH,MeadowR,GaseidnesS.2013.AnovelstrainofBrevibacilluslaterosporusproduceschitinasesthatcontributetoitsbiocontrolpotential.ApplMicrobiolBiotechnol,97:1601-1611.）。高效生物微生物释放和土壤生态调控相结合有望成为烟草黑胫病可持续治理的重要途径之一。通过合理的施用土壤添加剂如有机质和几丁质类物质增强生防微生物活性和诱导寄主植物抗性，可以明显提高病害控制的稳定性。

几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶已被证明为消解植物病原真菌和细菌细胞壁的主要降解酶系，其中几丁质酶作为生防因子由于其具有广泛的杀菌谱，并与如蛋白酶和β-1,3葡聚糖酶具有协同抗菌活性，而备受关注(LoritoM,HarmanGE,HayesCK,BroadwayRM,TronsmoA,WooSL,DiPietroA.1993.ChitinolyticenzymesproducedbyTrichodemaharzianum—antifungalactivityofpurifiedendochitinaseandchitobiosidase.Phytopathology,83:302-307.;AroraNK,KimMJ,KangSC,MaheshwariDK.2007.Roleofchitinaseandβ-1,3-glucanaseactivitiesproducedbyafluorescentpseudomonadandinvitroinhibitionofPhytophthoracapsiciandRhizoctoniasolani.CanJMicrobiol,53:207-212.;SomeyaN,TsuchiyaK,YoshidaT,NoguchiMT,AkutsuRK,SawadaH.2007.Fungalcellwalldegradingenzyme-producingbacteriumenhancesthebiocontrolefficacyofantibiotic-producingbacteriumagainstcabbageyellows.JPlantDisProtect,114:108-112.)。某些微生物如细小芽孢杆菌Bacilluscereus和哈茨木霉Trichodermaharzianum等产生的几丁质酶具有广谱抑制病原真菌（LoritoM,HarmanGE,HayesCK,BroadwayRM,TronsmoA,WooSL,DiPietroA.1993.ChitinolyticenzymesproducedbyTrichodemaharzianum—antifungalactivityofpurifiedendochitinaseandchitobiosidase.Phytopathology,83:302-307.;HuangCJ,WangTK,ChungSC,ChenCY.2005.Identificationofanantifungalchitinasefromapotentialbiocontrolagent,Bacilluscereus28-9.JBiochemMolBiol38:82-88.）；荧光假单孢杆菌产生几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶对大雄疫霉菌和立枯丝核菌的细胞壁具有明显的消解作用。虽然几丁质酶广谱杀菌能力的重要性，短短芽孢杆菌及其产生的几丁质酶对烟草黑胫病的生物防治研究尚未见系统报道。本项研究应用筛选具有高效产生几丁质酶的短短芽孢杆菌GB6-1，在离体条件下测定其对烟草黑胫病菌的抑制作用，评价该菌对烟草黑胫病的生物防治潜力，为进一步开发和利用该菌提供理论依据。

Shida等人（1996）将短芽孢杆菌属Brevibacillus从芽孢杆菌属中分离出来建立一个新属，短短芽孢杆菌B.brevis为其模式种（ShidaO,TakagiH,KadowakiK,KomagataK.1996.Proposalfortwonewgenera.Brevibacillusgen.nov.andPaenibacillusgen.nov.InternationalJournalofSystematicBacteriology,46:939-946.）。短短芽孢杆菌通过分泌短杆菌肽抑制植物tiscin病原菌（EdwardsSG,SeddonB.2001.ModeofantagonismofBrevibacillusbrevisagainstBotryereainvitro.JournalofAppliedMicrobiology,91:652-659.;ZhouQ,ChenW,WangY,LiD,LiL,XiaoQ.2012.DraftgenomesequenceofBrevibacillusbrevisstrainX23,abiocontrolagentagainstbacterialwilt.JournalofBacteriology,194:6634-6642.），杀菌谱广(Song,Z,LiuQ,GuoH,JuR,ZhaoY，LiJ,LiuX.2012.Tostadin,anovelantibacterialpeptidefromanantagonisticmicroorganismBrevibacillusbrevisXDH.BioresourceTechnology,111:504-506.)，合成如吲哚乙酸等植物生长调节物质促进植物生长发育（VivasA,BareaJM,AzconR.2005.InteractiveeffectofBrevibacillusbrevisandGlomusmosseae,bothisolatedfromCdcontaminatedsoil,onplantgrowth,physiologicalmycorrhizalfungalcharacteristicsandsoilenzymaticactivitiesinCdpollutedsoil.EnvironmentPollution,134:257-266.），对烟草的生长发育具有促进作用，能够诱导系统抗性，增强烟草的抗病能力(朱忠彬，吴秉奇，丁延芹，陈晓明，张长华，杜秉海，王玉军.2012.短短芽孢杆菌DZQ3对烟草的促生及系统抗性诱导作用.中国烟草科学,33(3):92-96.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种短短芽孢杆菌菌株，该菌株对烟草黑胫病菌具有高效生物防治功能。

本发明采用的技术方案是：

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种短短芽孢杆菌菌株，分类命名：Brevibacillusbrevis，该菌B.brevisGB6-1的16SrRNA序列（1031bp）已上传至NCBI的GenBank数据库（序列号：KP715564），于2015年7月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo:11135。

本发明的基本技术方案为，将2013年8月13日采自贵州省毕节市大方县发生烟草黑胫病的烟田土壤，依据16SrRNA序列分析和培养形状等，确定该菌为短短芽孢杆菌。

通过大量的生物学实验证明，本发明的短短芽孢杆菌具有高效分泌几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶特性，对烟草黑胫病菌具有明显的抑制作用。

短短芽孢杆菌菌株的分离：土壤样品经无菌水梯度稀释至10^-5，37℃接种至平板培养基（0.1%K2HPO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.2%胶体几丁质，pH6.8）培养2-3d后，挑取周围有透明圈的菌落，在含0.2%胶体几丁质的平板上纯化，获得此产几丁质酶的菌株。

菌株的培养性状鉴定：将纯化好的菌株移入到几丁质和营养（NA）培养基中，37℃培养箱培养。第3d分别观看菌落颜色及是否具有透明圈，测量菌落大小及透明圈直径。革兰氏染色法染色。鉴别细菌，经初染、媒染、脱色、复染四步制作薄片，干燥，镜检。

菌株的分子生物学鉴定，16SrRNA基因片段序列比对，系统发育分析。

短短芽孢杆菌产生的几丁质降解酶系测定：几丁质降解酶系活性依据胶体几丁质生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG,N-acetyglucosamine)含量测定。

短短芽孢杆菌产生的β-1,3-葡聚糖酶活性测定：β-1,3-葡聚糖酶活性依据昆布多糖降解生成的葡萄糖含量测定。

短短芽孢杆菌对烟草黑胫病菌的抑制作用：采用菌液对烟草黑胫病菌的消解作用。

本发明的一个方面，一种包含短短芽孢杆菌菌株的菌剂，所述菌剂可以是本领域技术人员所知任何技术手段制备任何形式的菌剂，例如通过发酵培养后进行冻干获得的干菌剂，也可以是液体形式的浓缩液态菌剂。

本发明的一个方面，所述包含短短芽孢杆菌菌株的菌剂在抑制烟草黑胫病菌应用。

本发明的有益效果和优点是：本发明的短短芽孢杆菌菌株烟草黑胫病菌具有明显的抑制作用；并具有高效产生几丁质酶β-1,3-葡聚糖酶活性，本发明的短短芽孢杆菌菌株对烟草黑胫病的生物防治具有很大的应用潜力。

附图说明

图1为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1在NA培养基上培养产生的菌落形态图。

图2为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1在含0.2%几丁质的培养基上产生的菌落形态图。

图3为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1的透射电镜照片。

图4为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1的16SrRNA特异性序列。

图5为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1的系统发育树。

图6为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1在产酶培养基上5d内的产酶活性变化。

图7为本发明中短短芽孢杆菌GB6-1对烟草黑胫病具有明显抑制作用的效果图。

图8为短短芽孢杆菌GB6-1培养滤液对烟草黑胫病菌抑菌效果图。

具体实施方式

实施例1：本发明的短短芽孢杆菌菌株的分离

分离培养基：诱导产酶培养基，0.1%Polypeptone，0.05%MgSO₄7H₂O，0.1%KH₂PO₄，0.2%NaCl，0.2%1%胶体几丁质，PH调制6.8。1%胶体几丁质制作：称取10g几丁质（Sigma,St.Louis,MO,USA）于100mL85%的H₃PO₄中，充分溶解，4℃过夜，加入500mL超纯水，电动搅拌使其充分分散，用超纯水洗至pH5.0左右，4℃保存备用。

扩繁培养基：MRS液体培养基，10g酪蛋白胨；10g牛肉浸提取物；5g酵母提取物；20g葡萄糖，定容1000mL，供抑菌测定用。

分离方法：称取1g病土放到15mL带塞试管中，加入9mL水，室温下在摇床上200r/min,摇晃1h。取上清液1mL梯度稀释至10^-5倍，在诱导产酶培养基（0.1%K₂HPO₄、0.05%MgSO₄·7H₂O、0.2%胶体几丁质，pH6.8）上划线，放于37℃培养箱3d。挑取周围有透明圈的菌落，在含0.2%胶体几丁质的平板上纯化，获得此产几丁质酶的菌株。观察菌落生长情况，挑取有透明圈的菌落纯化培养并保存。

实施例2：本发明的短短芽孢杆菌菌株的培养性状

将纯化好的菌株移入到几丁质和营养（NA）培养基中，37℃培养箱培养。第3d分别观看菌落颜色及是否具有透明圈，测量菌落大小及透明圈直径。革兰氏染色法染色。鉴别细菌，经初染、媒染、脱色、复染四步制作薄片，干燥，镜检。

短短芽孢杆菌GB6-1在NA培养基上培养，产生可溶性的红褐色菌落（图1），在含0.2%几丁质的培养基中菌落周围出现透明圈（图2）。短短芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，椭圆形1.63-2.60（±1.99）*0.78-1.47（±1.03）（图3）。

实施例3：本发明的短短芽孢杆菌菌株的分子生物学鉴定、16SrRNA基因片段序列比对及其系统发育分析

扩增引物的合成：由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

通用引物：

27F：5′′

1429R：5′′

基因组DNA提取：利用划线法在PDA培养基上培养细菌，于37℃恒温培养箱中培养3d。之后将细菌转移至MRS培养液中，置于摇床中，在37℃，230r/min条件下培养36h，扩繁。扩繁好后，取1ml培养液加入到诱导产酶培养基中，置于摇床中，同样条件下培养2d。利用抽滤器抽去培养液，将菌体收集到研钵中加入液氮研磨成粉末，供DNA提取使用。

采用DNA提取试剂盒（TakaraDV811A）进行DNA的提取。严格按说明进行操作。将提取到的DNA进行电泳检测。

基因组DNA电泳检测

TBE缓冲液的制备：将5×TBE缓冲液（硼酸27.5g，TrisBase54g，0.5mol/LEDTA20mL，充分溶解）稀释5倍，制成1×TBE的缓冲液。

1%琼脂糖凝胶制备：1×TBE20mL加0.2g琼脂糖，微波加热至沸腾，溶解完全，冷却至不烫手后加入Goldview1.5μL，倒入治胶板槽中。

上样：5μLDNA样品和1μLLoadingbuffer混匀后向吸取5μL样品加入上样孔中。电泳20min，紫外灯下检测并照相。

16SrRNA序列的扩增和测定

PCR反应体系（20μL）：模板DNA1μL、PCRMasterMix（ThermoFisherScientific）、引物各1μL，补充去离子水至20μL。反应条件：94℃4min；94℃1min，55℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min。PCR产物经1%凝胶电泳检测后送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将所得序列与GenBank中已登录序列进行BIAST分析。

经电泳检测，从基因组DNA中扩增出一条16SrRNA特异性序列，测定结果显示长度为1031bp（图4）。

分子系统发育分析：将测试好得到的16SrRNA序列在NCBI数据库中进行BLAST比对并申请GenBank登录号。下载相关菌株的16SrRNA序列，使用MEGA5.0软件ClustalX方法进行系统发育分析，以邻接法(Neighbour-joining)法构建分子系统发育树。通过GenBank比对分析，所得序列与已知菌株Brevibacillusbrevis相应同源性高达99%。通过邻接法构建系统发育树（图5）该菌与Brevibacillusbrevis属于同一类群，上传序列号：KP715564。

实施例4：本发明的短短芽孢杆菌菌株的几丁质酶活性测定

细菌产几丁质酶培养条件：250mL锥形瓶内加入100mL液体培养基（0.2%胶体几丁质，0.1%蛋白胨，0.2%NaCl，0.2%K₂HPO₄，0.05%MgSO₄·7H₂O），调pH值为6.8，121℃灭菌30min备用。将活化的细菌培养液以1%接种量接种于产酶培养基内，37℃、200rpm摇培，3次重复；于0、0.5、1、2、3、4、5d分别取样，供几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性测定。

几丁质降解酶系活性测定：几丁质降解酶系活性依据胶体几丁质生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG,N-acetyglucosamine)含量测定。酶促反应体系包括:0.1mL几丁质酶粗提液、0.5mL1.0%胶体几丁质、0.4mL0.1MpH6.0磷酸缓冲液，3次重复，以反应前加200μl1MNaOH不发生酶促反应为对照，置于摇床中37℃，150rpm反应1h，反应后立即加200μl1MNaOH终止反应，11000rpm离心10min，分别取上清液500μl于1mLSchales’液中，沸水显色反应15min，420nm波长测其吸光度。以已知含量N-乙酰葡萄糖胺(NAG)(0~100μg)制作标准曲线，以1h产生1μmolNAG量计算为1个酶活单位(U)。

短短芽孢杆菌在产酶培养基上5d内的产酶活性变化（图6）。由图6可以看出，短短芽孢杆菌从第1天开始产酶，几丁质降解酶系活性在第2天时达到产酶最高峰0.50umolh^-1ml^-1，随后下降。

实施例5：本发明的短短芽孢杆菌菌株的β-1,3-葡聚糖酶活性测定

β-1,3-葡聚糖酶活性依据昆布多糖降解生成的葡萄糖含量测定。酶促反应体系包括:0.5mLβ-1,3-葡聚糖酶粗提液、0.5mL0.2%昆布多糖（溶解于0.1M，pH5.0乙酸缓冲液），3次重复，以反应前加200μl1MNaOH不发生酶促反应为对照，置于摇床中50℃，轻微震荡，反应2h，反应后立即加200μl1M/lNaOH终止反应，11000rpm离心10min，分别取上清液0.5mL于0.5mLDNS液中，沸水显色反应5min，540nm波长测其吸光度。以已知含量葡萄糖(0~100μg)制作标准曲线，以1h产生1μmol葡萄糖量计算为1个酶活单位(U)。

短短芽孢杆菌在产酶培养基上5d内的产酶活性变化（图6）。由图6可以看出，短短芽孢杆菌从0.5天开始产酶，β-1,3-葡聚糖酶活性在第2天时达到产酶最高峰0.70umolh^-1ml^-1，随后保持相对较高的活性水平。

实施例6：本发明的短短芽孢杆菌对烟草黑胫病的抑制作用测定

对峙培养

测定培养基（TSM）：葡萄糖15g、酵母膏2g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O5g、CaCO₃5g、蛋白胨5g，定容至1000mL，调节PH至7.2左右。

首先将50μL细菌培养滤液(1.2-1.3×10⁸个菌体/mL)加入90mm直径的TSM平板的中央孔中，后把2个5d菌龄7mm直径的烟草黑胫病菌块平行放置2cm的位置。27℃温度下培养，每天记录菌系间抑菌带的距离，连续记载7d，5次重复。抑菌率计算公式：抑菌率(%)=（对照菌落半径—抑菌带距离）/对照菌落半径）×100。

对峙培养测定结果表明，短短芽孢杆菌对烟草黑胫病病原菌菌丝生长具有较强抑制活性，处理组中间有明显的菌脓且抑菌带明显（图7），而对照组菌丝长满整个培养皿中间打孔处可看到明显的菌丝。与对照比较，5d的抑菌率为63.25%。

短短芽孢杆菌培养滤液对烟草黑胫病菌的生长抑制

将2mL拮抗菌培养滤液粗酶提取液混合于18mL熔化的TSM培养基内制成平板培养基，接种烟草黑胫病菌于中央。2７℃温度下培养，以100℃处理10min的培养滤液的失活酶液为对照。每天记录菌落的直径，连续记载7d，5次重复，计算抑菌率。

短短芽孢杆菌培养滤液抑菌试验结果表明，培养滤液原液对烟草黑胫病菌具有明显的抑制作用，黑胫病菌的菌丝几乎不能生长，且畸变（图8A）。而热处理的培养滤液处理，烟草黑胫病菌生长正常（图8B），与空白对照无明显差异。培养滤液原液与灭活液和空白对照比较，5d的抑菌率分别为80.21%和83.19%。说明短短芽孢杆菌代谢产物中，细胞壁降解酶系在抑菌过程中发挥重要作用。

Claims (4)

1.一种短短芽孢杆菌，其特征在于：分类命名：Brevibacillusbrevis，于2015年7月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCCNo:11135。

2.如权利要求1所述短短芽孢杆菌在抑制烟草黑胫病菌应用，其特征在于：所述短短芽孢杆菌具有分泌几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶特性，对烟草黑胫病菌具有抑制作用。

3.一种短短芽孢杆菌的菌剂，其特征在于，所述菌剂中包含如权利要求1所述短短芽孢杆菌。

4.如权利要求3所述的一种短短芽孢杆菌的菌剂在抑制烟草黑胫病应用，其特征在于：,所述短短芽孢杆菌的菌剂具有分泌几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶特性，对烟草黑胫病菌具有抑制作用。