CN104232511A - 用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌BS04(Bacillus subtilis BS04)，属农业病害生物防治技术领域，其特征在于分离自辣椒根际土壤中，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO:M 2014294。本发明的枯草芽孢杆菌BS04对辣椒疫病菌、烟草黑胫病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和莴苣灰霉病菌的病原真菌具有抑菌作用，对原菌抑菌率在40％-80％之间，对辣椒疫病菌的抑菌率达80％以上。本发明的枯草芽孢杆菌BS04从健康植物根际的土壤中分离获得，无生态毒性，安全性高，抑菌谱广，且培养简单，周期短，在植物病害的生物防治中具有十分广泛的应用前景。

Description

用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌

技术领域：

本发明涉及一种用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌，属农业病害生物防治技术领域。

背景技术：

辣椒疫病俗称“死秧病”，由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起，是主要的辣椒根茎病害之一，在我国及世界其他国家的辣椒生产区都严重发生，给辣椒生产造成巨大的经济损失。

辣椒疫霉菌通常分布在土壤中，致病性变异强，易产生抗药性。目前，对于辣椒疫病的防治大多采用化学防治，而大量使用化学药剂导致了环境的严重污染，破坏了农业的生态平衡，对人类的身体健康产生了不利影响。同时，由于辣椒抗疫病品种较少，且多为中抗或耐病品种，难以有效地控制辣椒疫病。因此，寻找安全有效的防治措施成为控制辣椒疫病的一个亟待解决的问题。

在采用化学防治和培育抗病品种难以有效控制辣椒疫病发生的情况下，生物防治是目前辣椒疫病防治中重要的途径。在植物病害的防治上，生物防治具有对人畜安全，不污染环境，不产生抗性，以及由于仅杀伤或抑制防治对象，能参与生态环境调控，保持生态平衡，起到长效的作用，具有广阔的发展前景。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为目前应用较为普遍的生防菌，具有显著的生防能力，又是自然界中广泛存在的非致病细菌，且对人畜无害、不污染环境，备受各国研究工作者的青睐。

发明内容：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌，从健康植物根际的土壤中分离获得，对辣椒疫病具有较高的防治效果，同时也对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、烟草黑胫病菌等多种病原菌具有拮抗作用，无生态毒性，安全性高，抑菌谱广。

本发明的技术方案如下：

本发明的一种用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌BS04(Bacillussubtilis BS04)，分离自湖北省荆州市辣椒根际土壤中，已于2014年6月26日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO:M2014294。

本发明采用平板稀释法从辣椒根际土壤中分离得到若干株根际细菌，并测定了对辣椒疫病菌的拮抗作用，筛选得到拮抗作用较强的BS04菌株，根据其菌落形态特征、生理生化特性及16S rDNA的序列测定，确定BS04菌株为枯草芽孢杆菌。

本发明采用平板对峙法测定了BS04菌株对辣椒疫病菌、烟草黑胫病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和莴苣灰霉病菌等病原真菌的拮抗作用，抑菌率在40％-80％之间，其中对辣椒疫病菌的抑菌率达80％以上。

本发明提供了BS04菌株培养液处理辣椒疫病菌后，辣椒病原菌的菌丝分支增多，顶端出现畸形，生长缓慢，还出现了细胞壁加厚，原生质浓缩呈球形或椭圆形的现象，表明BS04菌株对辣椒疫病菌的菌丝生长具有明显的抑制作用。

本发明还通过对BS04菌株抗性的筛选，获得了卡那霉素抗性BS04突变株。将6叶期的辣椒幼苗在浓度为2×10⁸cfu/mL的菌悬液中浸根处理，检测BS04菌株在辣椒根际的定殖规律。结果表明BS04菌株能够在辣椒根际定殖，处理后35天内定殖密度比较稳定。

本发明还测定了BS04菌株对辣椒疫病的应用防治效果，对辣椒疫病的防治效果可以达到85.81％。

中国典型培养物保藏中心用于专利程序的培养物保藏受理通知书(收据)

分类命名枯草芽孢杆菌BS04

保藏日期2014年6月26日

保藏单位中国典型培养物保藏中心地址：中国.武汉.武汉大学

保藏编号CCTCC NO：M2014294

本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：

1、本发明的枯草芽孢杆菌BS04从健康植物根际的土壤中分离获得，无生态毒性，安全性高。

2、本发明的枯草芽孢杆菌BS04具有较广的抑菌谱，对常见的土传病原真菌(辣椒疫病菌、烟草黑胫病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌)及莴苣灰霉病菌等具有较好的抑制效果。

3、本发明的枯草芽孢杆菌BS04菌株对辣椒疫病具有较高的防治效果，且培养简单，周期短，在植物病害的生物防治中具有十分广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明的BS04菌株的16S rDNA扩增电泳图。

图2为本发明的BS04菌株的16S rDNA的系统进化树图。

图3为本发明的BS04菌株处理辣椒疫病菌后的菌丝形态图。

图a：无菌水处理后辣椒疫病菌的菌丝形态图；

图b-d：BS04菌株处理后辣椒疫病菌的菌丝形态图。

图4为本发明的BS04菌株对不同病原真菌的抑制作用图。

图A：辣椒疫病菌；图B：烟草黑胫病菌；图C：棉花黄萎病菌；图D：棉花枯萎病菌；图E：油菜菌核病菌；图F：莴苣灰霉病菌。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：枯草芽孢杆菌BS04的分离、筛选与鉴定

(1)分离与筛选：从湖北武汉、荆州、宜昌和荆门等辣椒种植区疫病发生严重的田地，利用五点采样法从健康辣椒根际采集土样。采样时铲去表层5cm的土层，取新鲜土样500g，用保鲜袋带回。

称取土样10g加入装有90mL无菌水的三角瓶中，三角瓶中装有玻璃珠若干，28℃、120r/min振荡30min，静止后获得土壤悬液。

将土壤悬液稀释成10^-5、10^-6、10^-7，吸取不同稀释度的土壤悬液100μL涂布于NA培养基上，置于28℃培养48小时，挑取颜色、形态等不同的细菌单菌落并纯化、保存。

采用平板对峙法测定分离到的细菌对辣椒疫病菌的抑菌活性。将辣椒疫病菌在PDA平板上活化，用打孔器在菌落边缘打取菌块(直径5mm)，接种到PDA平板中央。培养1天后，在距离辣椒疫病菌块2cm处的4个对接点接种待测细菌，28℃培养，5天后观察抑菌结果，每个处理重复3次。试验结果表明，BS04菌株对辣椒疫病菌的拮抗作用较强。

(2)鉴定：将筛选到的抑菌效果较好的BS04菌株进行形态学、生理生化特征和16S rDNA序列测定鉴定。

形态学观察：将BS04菌株在NA培养基平板上划线接种，28℃培养1-3天，观察菌落特征。菌落初为圆形，边缘整齐，白色不透明，隆起。随着培养时间延长，菌落边缘不整齐，出现褶皱状；菌体为杆状，有芽孢。

生理生化特征：菌株BS04的生理生化特征见表1。

表1：BS04菌株的生理生化特征

特征	结果
		革兰氏染色	阳性
芽孢位置	中生
		明胶液化	+
V.P试验	+
		柠檬酸盐	+
接触酶	+
		M.R试验	－
水解淀粉	+
		7％NaCl生长	+
运动性	+

表中：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

16S rDNA序列测定：采用CTAB法提取BS04菌株的基因组DNA，根据已报道的枯草芽孢杆菌16S rDNA的保守区序列设计引物BsF(5'-TGCACACACCGCCCGT-3')和BsR(5'-GGGTTGCCCCATTCG-3')进行PCR扩增。

PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min，54℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物经试剂盒纯化后送上海博尚生物科技有限公司测序。经过测序，BS04菌株的16S rDNA序列长度为1519bp，上传至Genebank，获得基因序列号为KF725636，具体序列如下：

将测序结果在NCBI Genebank上进行序列比对(比对号：lcl|28017)，发现其与枯草芽孢杆菌16S rDNA序列的相似性高达99％，初步确定拮抗菌株BS04为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。利用MEGA4.1软件进行聚类分析，构建进化树。结果表明，B.subtilis(KF725636)与B.subtilis(KC506778.1)处于一个小分支，同时与另外两个枯草芽孢杆菌位于一个大分支。由此，结合形态及生理生化特征，进一步说明BS04菌株为枯草芽孢杆菌。实施例2：枯草芽孢杆菌BS04菌株的抑菌谱测定

枯草芽孢杆菌BS04菌株对辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)、烟草黑胫病菌(P.parasitica var.nicotiana)、棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vesinfectum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和莴苣灰霉病菌(Botrytis cinerea)等病原真菌的拮抗作用均采用平板对峙法。

将各病原菌在PDA平板上活化，用打孔器在菌落边缘打取菌块(直径5mm)，接种到PDA平板中央。培养1天后，在距离病原真菌菌块2cm处的4个对接点接种待测细菌，以无菌水为对照，28℃培养，5天后测量菌落半径，计算BS04菌株对病原真菌生长的抑菌率，每个处理重复3次。

采用下列公式计算抑菌率：对病菌生长的抑菌率(％)＝(各对照菌落半径－各处理菌落半径)/各对照菌落半径×100％。

试验结果见表2，BS04菌株对各供试病原菌抑菌率在40％-80％之间，其中对辣椒疫病菌的抑菌率达80％以上。

表2：BS04菌株对不同病原真菌的抑制作用

实施例3：枯草芽孢杆菌BS04菌株对辣椒疫病的防病机理

(1)BS04菌株对辣椒疫病菌菌丝生长的影响

将辣椒疫病菌在PDA培养基上接种培养3天后，用打孔器打取直径5mm的菌块置于盛有20mL PD培养基的无菌培养皿中，28℃培养2天。将培养好的辣椒疫病菌菌块分别用BS04菌株的无菌培养滤液和菌体悬浮液处理24小时，以无菌水处理为对照，挑取菌丝在倒置显微镜下观察其形态,每处理重复3次。

试验结果表明，辣椒疫病菌经菌株BS04菌体悬浮液和无菌滤液处理后，菌丝分支增多，顶端出现畸形，生长缓慢，还出现了细胞壁加厚，原生质浓缩呈球形或椭圆形的现象，说明BS04菌株对辣椒疫病菌的菌丝生长具有明显的抑制作用。

(2)BS04菌株在辣椒根际的定殖规律

将BS04菌株接种到NA培养基平板上，待长出菌落后用紫外线照射30秒后，再将其转接到卡那霉素浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL和4.0μg/mL的NA平板上，得到具有卡那霉素2.0μg/mL抗性的BS04突变株。

将上述试验中得到的卡那霉素抗性BS04突变株接种到至卡那霉素2.0μg/mL的NA液体培养基中，28℃,200r/m振荡培养24小时，配制成浓度为2×10⁸cfu/mL的菌悬液。将生长至6叶期的辣椒幼苗在上述菌悬液中浸根1小时后移栽至盆钵中，温室中管理，每隔7天取样检测BS04菌株在辣椒根际的定殖情况。

测定方法如下：轻轻拔出辣椒幼苗，清水冲洗根部，并用吸水纸吸去根表水，剪下根系，称重，研磨，无菌水稀释，涂在含有卡那霉素的NA培养基平板上，28℃培养48小时后计算菌落的数量。

试验结果见表3，BS04菌株能够在辣椒根际定殖，处理后35天内定殖密度比较稳定。

表3：BS04菌株在辣椒根际的定殖情况。

测定时间(d)

定殖密度(cfu/g)

7	5.89×105
		14	5.66×105
21	5.82×105
		28	5.58×105
35	5.12×105

(3)BS04菌株对辣椒疫病的防效

选取6叶期的健康辣椒幼苗60株，每盆(直径10cm)1株，平均分为两组。一组将浓度为2×10⁸cfu/mL的BS04菌悬液20mL浇灌到栽有辣椒幼苗的盆钵中，7天后采用灌根法接种辣椒疫霉游动孢子悬浮液(5×10³个/mL)10mL；另一组以无菌水处理为对照，7天后用辣椒疫霉游动孢子悬浮液(5×10³个/mL)10mL灌根。10天后调查病情指数，并计算防治效果。

参照Hartman的方法进行辣椒疫病病情分级：0级：不发病；1级：根茎变黑褐色，病部长度不超过茎长1/3；2级：根茎变黑褐色，病部长度超过茎长1/3；3级：全株萎蔫，但未死亡，病部长度超过茎长1/2；4级：全株变黑褐色，死亡。

防治效果＝100％-(试验组病情指数/对照组病情指数)×100％。

试验结果见表4，BS04菌株对辣椒疫病的防治效果可以达到85.81％。

表4：BS04菌株对辣椒疫病的防效

	病情指数	防治效果
			试验组	9.58	85.81％
对照组	67.54

Claims (2)

1.一种用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌BS04(Bacillus subtilisBS04)，其特征在于分离自辣椒根际土壤中，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO:M2014294。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BS04，其特征在于对辣椒疫病菌、烟草黑胫病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和莴苣灰霉病菌的病原真菌的抑菌应用，对原菌抑菌率在40％-80％之间，对辣椒疫病菌的抑菌率达80％以上。