CN105296381A - 一株枯草芽孢杆菌cyy-25及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌CYY-25，属于微生物领域。该枯草芽孢杆菌CYY-25命名为Bacillus？subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.8995。并且该菌株在盐浓度为0％～15％的条件下均可产生纤维素酶。本发明枯草芽孢杆菌CYY-25可以合成IAA、嗜铁素，溶解难溶无机磷，能够促进植物生长，对尖孢镰刀菌、稻梨孢菌、核盘菌、串珠镰刀菌、油菜菌核病菌等多种植物病原真菌都具有较好的抑制作用，且对苜蓿根腐病的防治具有重要意义，适于作为农业菌剂加以开发利用。

Description

一株枯草芽孢杆菌CYY-25及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌CYY-25及其应用。

背景技术

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是目前世界上种植最早、栽培最广的优质多年生豆科牧草，具有产草量高、再生性强、利用年限长、适口性强、营养丰富等优点。至今，紫花苜蓿在我国的种植历史已超过两千年，其亦是我国种植面积最大的牧草。然而紫花苜蓿的一种世界性病害，根腐病(Rootrot)，会危害紫花苜蓿的各个生长时期，主要症状表现为根部出现坏死斑，甚至腐烂、死亡，茎叶全部枯死，严重影响紫花苜蓿的品质和产量，这种病害还会随着种植面积和年限的增长而加重。虽然紫花苜蓿根腐病病原复杂，但据研究表明多与镰刀菌有关。

近年来，植物根际促生细菌(Plantgrowth-promotingrhizobacteria，PGPR)的研究日益受到人们的关注。芽孢杆菌(Bacillusspp.)是PGPR重要的组成部分，既可以促进植物生长，还有生物防治作用。PGPR主要通过合成IAA和嗜铁素，溶解土壤中难溶的磷，促进植物营养物质的吸收，从而促进植物生长；PGPR主要产生的抑菌物质为脂肽化合物，包括丰原素(Fengycin)、伊枯草菌素(Ituin)和表面活性素(Surfactin)等，其在防治植物病害方面起着重要作用。因此，开发能够促进植物生长且能够有效防治植物病害的PGPR是目前研究工作的重点。

发明内容

本发明的目的在于提供一株枯草芽孢杆菌CYY-25及其应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌CYY-25，该枯草芽孢杆菌CYY-25命名为Bacillussubtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.8995。

该菌能够合成吲哚乙酸、嗜铁素，还能够溶解无机磷。本发明公开了枯草芽孢杆菌CYY-25作为促进植物生长菌剂的应用。所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。

本发明还公开了枯草芽孢杆菌CYY-25在制备用于促进植物生长的菌剂中的应用。

所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。

本发明公开了枯草芽孢杆菌CYY-25作为防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂的应用。

本发明公开了枯草芽孢杆菌CYY-25在制备用于防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂中的应用。

所述的菌剂为防治苜蓿根腐病的菌剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CYY-25于2014年4月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCCNo.8995。

本发明枯草芽孢杆菌CYY-25可以合成IAA、嗜铁素，溶解难溶无机磷，能够促进植物生长，对尖孢镰刀菌、稻梨孢菌、核盘菌、串珠镰刀菌、油菜菌核病菌等多种植物病原真菌都具有较好的抑制作用，且对苜蓿根腐病的防治具有重要意义，适于作为农业菌剂加以开发利用。

保藏说明

本发明对所述的枯草芽孢杆菌CYY-25进行了下述保藏：

保藏时间：2014年4月3日，保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏号为CGMCCNo.8995。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)在PDA培养基上的生长状况。

图2为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)在不同浓度L-Trp存在下IAA合成量的变化。

图3为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)对紫花苜蓿(农牧803)促生30d时盆栽效果。

图4为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)对11种植物病原真菌的抑制作用，其中：a：尖孢镰刀菌；b：稻梨孢菌；c：金黄壳囊孢菌；d：核盘菌；e：串珠镰刀菌；f：灰葡萄孢菌；g：禾谷镰孢菌；h：茄链格孢菌；i：立枯丝核菌；j：禾旋孢腔菌；k：油菜菌核病菌；

图5为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)的发酵液对尖孢镰刀菌菌丝和孢子生长的抑制作用(40×)；

图6为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)对紫花苜蓿根腐病的防治作用；

其中，对照1是仅破坏紫花苜蓿植株根部；对照2是破坏紫花苜蓿植株根部，且用尖孢镰刀菌浸根；实验组是破坏紫花苜蓿植株根部，用尖孢镰刀菌浸根，同时用CYY-25菌悬液灌根；

图7为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)的系统发育树图谱。

具体实施方式

下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次以上重复实验，结果取平均值。

一、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)的分离鉴定

1、一、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)的分离

1)土样采集

供试土样取于哈尔滨师范大学试验田种植的紫花苜蓿的根际，将植物根际土壤装入事先准备好的干净保鲜袋中，带回实验室4℃保存备用。

2)菌株的筛选和纯化

称取5g土样，加入盛有玻璃珠和45mL无菌水的锥形瓶中，在培养摇床上剧烈振荡30min(37℃)后于80℃的水浴锅中保持15min。然后用无菌水进行梯度稀释后涂布于PDA平板，37℃培养1-2d，取培养基上生长的菌落，纯化并得到纯培养的菌株。将得到的一株芽孢杆菌命名为CYY-25。

2、菌株CYY-25的鉴定

1)分子鉴定

对菌株CYY-25进行基因组DNA提取，然后进行16SrDNA的PCR扩增和测序。

PCR扩增所采用的引物为：

F8：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

F1541：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR扩增条件为：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃90s，30个循环；72℃10min，4℃无限循环。

对PCR扩增产物进行测序，测序结果如序列表SEQIDNO.1所示。

2)形态鉴定

参见图1，菌株CYY-25在PDA培养基上形成圆形或不规则形，乳白色，边缘不整齐，表面粗糙的菌落。

3)生理生化鉴定结果如表1：

表1

注：+，阳性；-，阴性。

参见图7，通过鉴定，菌株CYY-25属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

二、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)产吲哚乙酸(IAA)的能力

采用Salkowski比色法测定菌株CYY-25分泌IAA的能力。CYY-25先在DF液体培养基中培养2d，再微量转入添加0、200和500μgL-Trp/mL的DF液体培养基中继续培养2d，测OD₆₀₀值，其余培养液离心后，取500μL上清液，加入2mLSalkowski试剂迅速充分混合，室温暗培养20min后，测OD₅₃₅值。IAA标准曲线平行2次，样品重复3次。得到标准曲线方程如下：y＝0.0717x-0.0007(R²＝0.999)，其中x代表OD₅₃₅值，y代表IAA浓度(μg/mL)。

如图2所示，即为CYY-25菌株的IAA合成量。由图可知，CYY-25在L-Trp浓度为0、200和500μg/mL时，合成IAA量分别为0.363、6.765和9.349μg/mL。该菌株不仅能够利用L-Trp产生IAA，而且随着L-Trp浓度的增加，其IAA的合成量也增加。

三、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)溶解无机磷的能力

将CYY-25菌株点接种于NBRIP培养基上，28℃培养2-3d，观察菌落周围是否产生无色透明晕圈。

参照钼锑抗显色法来测量CYY-25菌株溶解无机磷的能力。标准曲线平行2次，样品重复5次。根据测得的OD₆₆₀值，绘制标准曲线，得到标准曲线方程如下：y＝1.0104x+0.0047(R²＝0.9974)，其中x代表OD₆₆₀值，y代表磷的质量浓度(μg/mL)。查标准曲线，按如下公式进行计算：

发酵液内有效磷含量(μg/mL)＝(p·V·ts)/v

式中p为工作曲线上查得磷的质量浓度(μg/mL)；V为显色液定容体积(mL)；ts为分取倍数；v为测定发酵液的体积。

检测结果表明，枯草芽孢杆菌CYY-25的菌落周围能形成无色透明晕圈。发酵液内有效磷含量为455.55±10.50μg/mL，说明CYY-25菌株具有溶解无机磷的能力。

四、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)生产嗜铁素的能力

参照Schwyn和Neilands的方法，将CYY-25菌株点接种于铬奥醇CAS(Chromeazurolsulphonate)培养基上，28℃培养3d，观察菌落周围是否产生橘黄色的透明晕圈。

定量测定采用王平等描述的水溶性色素产生菌铁载体的定量检测法，样品中嗜铁素的相对含量为A/Ar，该值越小，说明合成嗜铁素能力越强。

检测结果表明，枯草芽孢杆菌CYY-25的菌落周围有橘黄色的透明晕圈产生。A/Ar值为1.189±0.013，说明CYY-25菌株具有合成嗜铁素的能力。

五、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)在盐碱环境下对紫花苜蓿(农牧803)的促生效果

将CYY-25菌株于LB培养基过夜培养，离心收集菌体，重悬于无菌水中，调节菌浓度OD₆₀₀＝0.5±0.04。挑选饱满、大小一致、无病害的健康紫花苜蓿种子，75％乙醇浸泡4min后，无菌水冲洗5次，然后将种子浸于2％次氯酸钠溶液中5min，再用无菌水冲洗5次，将表面杀菌的种子用菌悬液处理，对照组只用无菌水处理，室温培养至种子萌发后，种于盆中。

供试盐碱土壤采自黑龙江省农科院兰西基地，每盆装500g土，种15粒发芽的种子，每处理设5次重复。实验组每7d浇一次CYY-25菌悬液，对照组浇等量无菌水。温室培养，适当补充水分。种植30d后取样，分别测植株的株高、根长、鲜重和干重，结果如下表2：

表2

注：同列不同字母表示在0.05水平上的显著差异。

结果表明，用CYY-25菌悬液处理的紫花苜蓿植株与对照组相比，植株高、根长、植株鲜重和根鲜重均显著增加，分别增加了53.31％、56.69％、107.45％和64.81％。植株干重增加了83％，根干重增加了1倍。由此可见，促生效果显著。

六、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)对植物病原真菌的抑制作用

1、分离菌株拮抗植物病原真菌的平板对峙试验

枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)在PDA培养基上37℃活化后，将植物病原真菌(尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、稻梨孢菌(Pyriculariaoryzae)、金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、茄链格孢菌(Alternariasolani)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus)、油菜菌核病菌(Sclertiniasclerotiorum))置于PDA培养基中央，在距平皿边缘2cm处接种菌株CYY-25，培养皿置28℃下培养3-5d，观察菌落周围是否产生抑菌圈。

由图4可见，枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)对11种植物病原真菌均有不同程度的抑制作用。

2、发酵液对病原菌丝及孢子生长的抑制作用

PDA板活化尖孢镰刀菌，刮取培养基表面菌丝，接种于50mLPDA液体培养基中。同时，取200μL过夜培养的细菌发酵液也接入PDA液体培养基中。对照组不接种细菌发酵液，28℃震荡培养2d。显微镜下观察，不同处理尖孢镰刀菌菌丝及孢子的生长情况。

如图5所示，菌株CYY-25的发酵液对尖孢镰刀菌菌丝和孢子生长均有明显的抑制作用。在电子显微镜下观察，对照组(CK)菌丝大量生长，边缘光滑，可见清晰的分支结构，并伴有大量孢子生成。与对照组相比，菌株CYY-25处理过的病原菌菌丝明显减少，菌丝体扭曲、断裂、顶端膨大，菌丝量和孢子量也明显减少。

3、分离菌株防治紫花苜蓿根腐病的盆栽实验

按照郝晓娟等的方法，将紫花苜蓿种子经表面杀菌后密播于无菌蛭石中，45d后，将植株根部用石英砂揉搓制造伤口，浸入培养2d的尖孢镰刀菌菌丝体悬浮液40min，再将苜蓿重新种回无菌蛭石中，立即用CYY-25菌悬液对重新种回蛭石中的紫花苜蓿植株进行灌根。以只破坏根不接菌为对照1，只接种病原菌不接种拮抗菌为对照2，每处理4个重复。实验组每2d用CYY-25菌悬液灌根，对照组浇灌等量的无菌水。接种10d后调查记录病情。参照陈雅君等的病情指数分级标准，将紫花苜蓿根腐病分为5级：0级为健康植株，无枯萎或腐烂症状；1级为主根或根茎局部出现病斑，面积低于10％，地上部分生长良好；2级为主根及根茎出现连片病斑，面积在10％～30％间，地上部分生长较好；3级为30％～50％主根及根茎出现病斑，地上生长很差；4级为主根及根茎部病斑面积超过50％，全株枯死。根据病情指数分级标准计算不同处理的病情指数及其防治效果。

由图6可见，尖孢镰刀菌能够引起紫花苜蓿根腐病，紫花苜蓿根及根茎部出现黑色坏死斑，甚至腐烂、死亡，茎和叶逐渐枯死。菌株CYY-25对由尖孢镰刀菌引发的紫花苜蓿根腐病有明显的防治效果。对照1健康无病株；对照2在接种尖孢镰刀菌10d后，植株几乎全部发病，病情指数达到86.88％；而实验组接种CYY-25菌悬液10d后有部分植株表现出发病症状，但发病率低，症状轻，与对照2相比差异明显，病情指数为40％，相对防效为53.96％。

综上所述，本发明公开的枯草芽孢杆菌CYY-25能够合成吲哚乙酸，能够合成嗜铁素。而且，该菌能够溶解无机磷。

所以，该菌的应用包括：

所述枯草芽孢杆菌CYY-25在促植物生长的应用。

所述枯草芽孢杆菌CYY-25在制备促植物生长菌剂的应用。

所述的菌剂为促吲哚乙酸合成、促嗜铁素合成、溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。

所述枯草芽孢杆菌CYY-25抑制多种植物病原真菌生长的应用。

所述枯草芽孢杆菌CYY-25防治多种植物病原真菌引起的植物病害的应用。

所述在制备防治植物病害菌剂的应用。

所述的枯草芽孢杆菌CYY-25防治紫花苜蓿根腐病的应用。

Claims (9)

1.一株枯草芽孢杆菌CYY-25，其特征在于，该枯草芽孢杆菌CYY-25命名为Bacillussubtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.8995。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CYY-25作为促进植物生长菌剂的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CYY-25在制备用于促进植物生长的菌剂中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。

6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CYY-25作为抑制植物病原真菌生长的菌剂的应用。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CYY-25作为防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂的应用。

8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CYY-25在制备用于防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的菌剂为防治苜蓿根腐病的菌剂。