CN111019870B - 一种假单胞菌、微生物菌剂及其应用 - Google Patents

一种假单胞菌、微生物菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明一种假单胞菌CGMCC No.19085和含有该假单胞菌的微生物菌剂，并提供该微生物菌剂的制备方法，通过向苜蓿生长的土壤中施用如上所述的假单胞菌和如上所述的微生物菌剂，能够有效地增加苜蓿对根腐病的抗病性。

Description

一种假单胞菌、微生物菌剂及其应用
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，具体的，涉及一种假单胞菌、微生物菌剂及其应用。
背景技术
苜蓿为豆科多年生植物，是牛、羊等牲畜的重要饲料。因营养价值高，适口性好，有“牧草之王”的美称。随着农业产业结构的调整，以苜蓿为主的种草业悄然兴起，栽培形式以过去的野生型、粗放型向精细种植方式转变，根腐病的发生也日益严重。
在2006年，先后报道该病的病原菌已达28种，其中以镰刀菌为主，有13种，其它病原真菌12种，细菌2中，线虫1种。细菌等虽然也可以引发苜蓿根部腐烂，但真菌的侵染是导致苜蓿根腐病的最主要原因。苜蓿根腐病一旦大面积发生会严重降低苜蓿产量，甚至需要重新建植。另外，引起根腐病的镰孢菌可能产生毒素，从而影响以苜蓿为食科的牲畜健康。因此，研究苜蓿根腐病和探索其防治方法具有重要意义。
发明内容
本公开的目的在于提供一种对苜蓿根腐病安全有效的生防菌剂。
为了实现上述目的，本公开一方面提供了一种假单胞菌，其特征在于，所述假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.19085，命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
可选地，其中所述假单胞菌为苜蓿内生菌。
另一方面，本公开提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂活性成分包含保藏编号为CGMCC No.19085的假单胞菌。
可选地，相对于1g微生物菌剂，保藏编号为CGMCC No.19085的假单胞菌的活菌数为108-1011CFU。
可选地，该微生物菌剂包括如下步骤的方法制备得到：
S1、将权利要求1所述的假单胞菌在活化培养基中接种并培养得到活化菌种；
S2、将假单胞菌的活化菌种在发酵培养基中培养得到发酵后的菌液。
可选地，所述方法还包括将所述发酵后的菌液经惰性载体吸附、烘干和粉碎，得到菌种的菌粉。
可选地，所述惰性固体载体的用量使得假单胞菌菌粉中活菌含量达到(2-5)×108CFU/g。
可选地，所述惰性固体载体包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高岭土、凹凸棒土、蒙脱土、膨润土、滑石粉、白碳黑和碳酸钙中的至少一种。
可选地，所述活化培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基或LB培养基；所述发酵培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基或LB培养基。
另一方面，本公开提供了上述假单胞菌或微生物菌剂在苜蓿根腐病防治中的用途。
通过上述技术方案，本公开提供的假单胞菌CGMCC No.19085及其微生物菌剂能够有效地增加苜蓿对根腐病的抗病性，并且本公开的假单胞菌CGMCC No.19085为苜蓿内生菌，相对于其他菌株具有防效稳定的特点。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏
本公开的假单胞菌是本公开的发明人从苜蓿根部中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCC No.19085，保藏日期为2019年12月5日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开一方面提供了一种假单胞菌，其特征在于，所述假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.19085，命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
其中，其中所述假单胞菌为苜蓿内生菌。
该假单胞菌为本公开的发明人从苜蓿根部样品中分离培养出一种新的菌种NANX90R-8，经鉴定该菌属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)。该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2019年12月5日，保藏编号为CGMCC No.19085。
另一方面，本公开提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂活性成分包含保藏编号为CGMCC No.19085的假单胞菌。
其中，微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.19085的假单胞菌的活菌数可以为108-1011CFU，优选情况下，每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.19085的假单胞菌的活菌数可以为109-1010CFU。
根据本公开，该微生物菌剂包括如下步骤的方法制备得到：
S1、将假单胞菌CGMCC No.19085在活化培养基中接种并培养得到活化菌种；
S2、将假单胞菌CGMCC No.19085的活化菌种在发酵培养基中培养得到发酵后的菌液。
其中，菌种的活化培养条件及培养后菌种状态没有特别限制，可以为假单胞菌培养的常用条件，例如培养温度可以为30℃，培养时间可以为48h，在培养的过程中，可以通过常规的方法，例如显微镜观察确定活化菌株的状态。
其中，发酵后的菌液可以直接作为微生物菌剂使用，也可以通过包括将所述发酵后的菌液经惰性载体吸附、烘干和粉碎，得到菌种的菌粉。
其中，所述惰性固体载体的用量使得假单胞菌菌粉中活菌含量达到(2-5)×108CFU/g。
其中，所述惰性固体载体包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高岭土、凹凸棒土、蒙脱土、膨润土、滑石粉、白碳黑和碳酸钙中的至少一种，混合后的物料可以进一步干燥制粒为颗粒剂。
根据本公开，所述活化培养基为无机盐培养基(硝酸钠1.5g，硫酸铵1.5g，磷酸氢二钾1.31g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，氯化钙0.002g，蒸馏水1000mL，pH7.0)和固体LB培养基(胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，定容至1000mL)；所述发酵培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基或LB培养基。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(Microbiology Culture Media Manual)的记载制备得到。并且可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125℃和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10-30分钟。
另一方面，本公开提供了上述假单胞杆菌或微生物菌剂在苜蓿根腐病防治中的用途。
其中，通过向植物生长的土壤中施用如上所述的假单胞菌和如上所述的微生物菌剂，能够有效地增加植物的抗病性。
以下结合实施例进一步详细说明本发明，但是本发明的范围并不限制于以下实施例中。
实施例1
采集健康未染病的苜蓿植株，对苜蓿植株的根部经过酒精浸泡，次氯酸钠浸泡、无菌水浸泡后，加入无菌水进行研磨，混合均匀制成悬浮液。将悬浮液稀释后涂布与LB平板，30℃下培养24h，分离得到假单胞菌CGMCC No.19085。
将假单胞菌CGMCC No.19085接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液。将100mL上述种子液加入100L发酵培养基中，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的芽孢杆菌的活菌数为1010CFU，所得到的培养液即为本实施例的微生物菌剂。
实施例2
将实施例1得到的假单胞菌CGMCC No.19085接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液。将100mL上述种子液加入100L发酵培养基中，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的芽孢杆菌的活菌数为1010CFU，然后使用硅藻土对发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂，所得到的可湿性粉剂即为本实施例的微生物菌剂。
对比例1
将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号CGMCC No.11220的木霉菌从保藏斜面接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)中，25℃培养箱培养7天，从中取3-4个菌块加入种子瓶。25℃、180rpm摇床上振荡培养48h，制成种子液。将种子液按1:150体积比加入种子发酵罐进行培养，然后按照1:20的体积比加入到厚垣孢子发酵培养基的发酵罐，28℃培养132小时，至90％菌丝都形成厚垣孢子，通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的木霉菌的活菌数为1010CFU。
对比例2
将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号CGMCC No.8995的枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液。将100mL上述种子液加入100L发酵培养基中，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的芽孢杆菌的活菌数为1010CFU。
对比例3
将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号CGMCC No.11220的木霉菌从保藏斜面接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)中，25℃培养箱培养7天，从中取3-4个菌块加入种子瓶。25℃、180rpm摇床上振荡培养48h，制成种子液。将种子液按1:150体积比加入种子发酵罐进行培养，然后按照1:20的体积比加入到厚垣孢子发酵培养基的发酵罐，28℃培养132小时，至90％菌丝都形成厚垣孢子，得到厚垣孢子发酵液；然后使用硅藻土对发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂，直至木霉菌的活菌数为1010CFU/g，所得到的可湿性粉剂即为本对比例的微生物菌剂。
对比例4
将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号CGMCC No.8995的枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃、180rpm摇床振荡培养12h，制成种子液。将100mL上述种子液加入100L发酵培养基中，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的芽孢杆菌的活菌数为1010CFU，然后使用硅藻土对发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂，所得到的可湿性粉剂即为本实施例的微生物菌剂。
对比例5-9
将与本申请的保藏编号为CGMCC No.19085的假单胞菌一起分离的5株假单胞菌分别接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃、180rpm摇床振荡培养12h，所得的菌液分别记为对比例4～8的种子液。将100mL上述种子液加入100L发酵培养基中，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的枯草芽孢杆菌的活菌数为1010CFU，所得到的培养液即为对比例4～8的微生物菌剂。
对比例10
购自山东麦肯生物科技有限公司的根腐宁-喜萃。
测试例1
本测试例使用的苜蓿根腐病常见致病菌为：腐皮镰孢霉(F.solani)和串珠镰孢霉(F.moniliforme)。
将过夜培养的腐皮镰孢霉(F.solani)菌液和串珠镰孢霉(F.moniliforme)菌液与营养琼脂培养基(含1.5％琼脂，w/v)混匀，将各菌液浓度稀释至2×107CFU/ml左右，取5ml倾注于制备好的营养琼脂平板中。将牛津杯用镊子轻轻放置于接种不同菌株的平板上，分别将200μl实施例1、对比例1和对比例2中溶液剂加入牛津杯后静置30min，于30℃培养16h，用游标卡尺测量测量其对腐皮镰孢霉(F.solani)和串珠镰孢霉(F.moniliforme)的抑菌圈大小，如表1所示。
表1
抑菌圈-腐皮镰孢霉(mm) 抑菌圈-串珠镰孢霉(mm)
实施例1 23.5 24.3
对比例1 15.8 17.7
对比例2 18.6 17.5
由表1可以看出，实施例1中的假单胞杆菌CGMCC No.19085对于腐皮镰孢霉和串珠镰孢霉的抑制率较对比例要高。
测试例1
本测试实施在田间试验中测定本发明的微生物菌剂在防治苜蓿根腐病中的效果。试验田位于河北省廊坊市中国农业科学院试验基地，苜蓿品种为紫花苜蓿(中苜1号，由国家种植牧草中期库提供，产品目录号为00068)。
从出现根腐病的苜蓿田中，拔取患病的苜蓿剪碎浸泡于10倍重量的清水中，即获得根腐病感病病原液。
在播种后20天后的不同种植区内施用实施例2和对比例3-10的微生物菌剂作为实验组，其中，实施例2和对比例3-9的微生物菌剂施用量为0.2kg/m2，对比例10中的市售根腐宁按照使用说明书用量将原液稀释500倍后进行喷施，施用量为1.5g/m2(原液)。并且使用空白的发酵培养基作为空白对照组。施用微生物菌剂2天后，每平方米喷洒100mL上述根腐病的感病病原液。30天后，统计草坪草的相对成活比(即实验组成活株数除以空白对照组成活株数)、相对株高(即实验组平均株高除以空白对照组平均株高)和相对地上生物量(即实验组平均地上鲜重除以空白对照组平均地上鲜重)，结果见表2。
表2
微生物菌剂 相对成活比 相对株高 相对地上生物量
实施例1 2.0 1.87 2.78
对比例1 1.85 1.71 1.78
对比例2 1.66 1.44 1.69
对比例3 1.74 1.56 1.76
对比例4 1.53 1.43 1.66
对比例5 1.72 1.51 1.72
对比例6 1.73 1.53 1.74
对比例7 1.69 1.50 1.71
对比例8 1.81 1.70 1.77
通过表2可以看出本公开的假单孢杆菌CGMCC No.19085对苜蓿根腐病具有良好的防治效果。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种假单胞菌，其特征在于，所述假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.19085，命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。
2.根据权利要求1所述的假单胞菌，其中所述假单胞菌为苜蓿内生菌。
3.一种微生物菌剂，其特征在于，该微生物菌剂活性成分包含权利要求1所述的假单胞菌。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其中，相对于1g微生物菌剂，保藏编号为CGMCCNo.19085的假单胞菌的活菌数为108-1011CFU。
5.根据权利要求3或4所述的微生物菌剂，其特征在于，该微生物菌剂包括如下步骤的方法制备得到：
S1、将权利要求1所述的假单胞菌在活化培养基中接种并培养得到活化菌种；
S2、将假单胞菌的活化菌种在发酵培养基中培养得到发酵后的菌液。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其中，所述方法还包括将所述发酵后的菌液经惰性固体载体吸附、烘干和粉碎，得到菌种的菌粉。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其中，所述惰性固体载体的用量使得假单胞菌菌粉中活菌含量达到（2-5）×108CFU/g。
8.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其中，所述惰性固体载体包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高岭土、凹凸棒土、蒙脱土、膨润土、滑石粉、白碳黑和碳酸钙中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其中，所述活化培养基为无机盐培养基；所述发酵培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基或LB培养基。
10.权利要求1或2所述的假单胞菌或权利要求3-9中任意一项所述的微生物菌剂在苜蓿根腐病防治中的用途。
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