CN1256013C - 一种烟草生物型包衣丸化种子的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草生物型包衣丸化种子的生产方法。该方法主要包括①生物包衣活性菌的分离与筛选；②活性菌原液的制备；③种子的生物包衣。本发明以活性菌原液或者其浓缩液替代水配制营养液，按常规方法进行种子丸化处理。本发明生产的生物型包衣丸化种子除能较好地防治烟草萌发及苗期主要的猝倒病外，还能拮抗种子主要霉变微生物烟草赤星病菌，并可促进烟草种子萌发、促进幼苗生长。
Description
技术领域
本发明涉及烟草种子的生产方法，更具体地说，本发明涉及一种利用现代生物技术加工烟草包衣种子的方法。
背景技术
烟草种子主要霉变真菌是烟草赤星病菌(Alternaria alternata)。它一方面引起种子霉变，另一方面是烟草赤星病的初侵染源。进行生物包衣的活性菌如能拮抗烟草赤星病菌，则可减少赤星病菌的带菌量，有效控制种子霉变，还有可能减少成熟期赤星病的危害。
烟草猝倒病是烟草苗期主要的土传病害之一，其病原菌主要是腐霉。在云南引发猝倒的腐霉多达4种，其中瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)是优势种群，也是对烟草致病性最强的种。这些腐霉不仅引起种子腐烂、不能萌发，还可引起苗期烟苗猝倒，对烟草生产危害极大。
生物包衣是利用现代生物技术研制成的一种微生物型种衣剂，它是以活性微生物的原菌剂为有效成分，辅以成膜剂及其它助剂而成，类似文献报道甚多。但是，迄今为止，尚无一种既能有效防治烟草猝倒病，又能拮抗烟草赤星病菌、促进种子萌发、提高种子活力的烟草包衣丸化种子。这是烟草生产中一个急待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足之处，提供一种烟草生物型包衣丸化种子的生产方法。该方法筛选的活性微生物除能较好的防治烟草萌发及苗期主要的猝倒病外，还能拮抗种子主要霉变微生物烟草赤星病菌，且可促进烟草种子萌发、促进幼苗生长。通过这种活性微生物包衣而形成的生物型包衣丸化种子也具有相同的功效。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
(1)生物包衣活性菌的分离与筛选
采用同步平皿对峙法、种子发芽法及温室盆栽法筛选拮抗瓜果腐霉、促进植物生长的根际细菌；再进一步采用同步对峙法、菌悬液生物处理法筛选对主要霉变微生物具有防除作用的根际拮抗细菌，即为筛选的活性菌。
(2)活性菌原液的制备
活性菌活化2～3次后，转入NA斜面培养48小时，再加入5ml灭菌水，振荡15分钟，使菌苔充分悬浮，摇匀，按体积比1∶100接种于筛选的培养液(过100目黄豆粉，20g；工业酵母粉，3.0g；食用红糖，30.0g；工业硫酸镁，0.5g；工业磷酸二氢钾，0.5g；工业磷酸氢二钾，1.0g)中，装液量为总容量的1/10～1/5，28+2℃，150rmin-1振荡培养36小时，胶体磨磨碎，过100目流体筛，即可得活性菌原液。
(3)种子的生物包衣
精选质量达一级良种标准的烟草种子，分袋盛装，活性菌原液浸泡15～20分钟，晾干；再按本领域常规方法进行裸种重量扩大0～20倍的包衣丸化；用喷雾器向种子喷洒以活性菌原液(或其浓缩液)为溶剂配制的营养液，并加入滑石粉，当丸化倍数达20～25倍时，取出用孔径为1.5～1.8mm的不锈钢筛过筛除大颗粒。继续边加包衣辅料边喷洒以活性菌原液为溶剂配制的营养液，丸化70～75倍，定型、抛光、染色，在45℃以下烘干，即为所需的烟草生物型包衣丸化种子。
本发明烟草生物型包衣丸化种子的生产方法，与现有技术相比具有如下有益效果：
1.腐霉是一种兼性寄生的土壤习居菌，高度适应了根际土壤环境，一旦气候条件适宜，如高温高湿，就会引起根部病害，如猝倒病、根腐、茎腐等，致使烟草在苗期较易感病。本发明通过生物包衣引入拮抗菌能很好地控制该病在苗期的危害。
2.烟草根际细菌能较好地存活、定殖于烟株根际，是一个丰富的生防资源库。从中筛选拮抗菌与自然生态条件极为相似，能明显提高筛选菌株的可利用率，特别是从重病田的健株或抑病土中分离、筛选更有效，能显著减少筛选的工作量。筛选出的拮抗根际细菌，易于进行菌剂生产，可满足种子生物处理的实际需要。
3.烟草种子主要的霉变微生物是烟草赤星病菌，采用其拮抗细菌处理能有效减少该病菌引起的种子霉变；同时也可减少由于种子带菌作为初侵染源而引发的成熟期赤星病对烟草叶片的危害。因此，对种子进行生物处理是一种简便、经济有效途径之一。
4.本发明不需制备生物型种衣剂，直接利用活性菌原液(或其浓缩液)，在加工完成后即可形成生物型包衣丸化种子。因此，与生物型种衣剂生产生物型包衣丸化种子相比，其操作流程大大简化，可以降低生产成本。也是本发明的核心技术所在。
保藏生物材料的说明
经本发明筛选出的2株活性菌，已于2003年7月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，分类命名为芽孢杆菌(Bacillus SP.)保藏编号分别为：CGMCC№.0981，CGMCC№.0982。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例和应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明。但它们不是对本发明的限定。
实施例1
烟草生物型包衣丸化种子的生产。采用同步平皿对峙法、种子发芽法及温室盆栽法筛选拮抗瓜果腐霉、促进植物生长的根际细菌；再进一步采用同步对峙法、菌悬液生物处理法筛选对主要霉变微生物具有防除作用的根际拮抗细菌，即为筛选的活性菌。
A.烟草猝倒病拮抗细菌的筛选
1.过程：
1.1拮抗根际细菌的分离与纯化
采集根病较重的病田健株根际土样，采用稀释涂布的方法在NA平板上分离、纯化。
1.2拮抗作用检测
1.2.1拮抗活性测定
将分离的根际细菌点种在直径为10cm的PDA平板的四周，间隔3cm点种一个菌株，同时，在平板相距4cm的正中接直径5mm的按常规病组织素琼脂法分离、纯化得到的强致病力瓜果腐霉菌株菌丝块，28℃恒温培养45天，挑选抑菌带大于5mm的根际细菌作拮抗筛选。
1.2.2拮抗筛选
采用对峙培养。将抑菌带大于5mm的根际细菌与猝倒病原菌进行同步对峙培养，根际细菌划线接种于四周，直径5mm的病原菌菌丝接种于相距3cm的正中，每直径9cm平板接四个菌株，重复3次。4-5天后，测抑菌带的宽度，保存抑菌带大于5mm、重复性较好的拮抗菌。
1.3拮抗根际细菌的生防作用
1.3.1接种体的制备
待测拮抗根际细菌悬液的制备：待测的拮抗根际细菌活化2-3次后，转入NA斜面培养48小时，再加入5ml灭菌水，振荡15分钟，使菌苔充分悬浮，摇匀，吸取1ml接种于40ml NA培养液中，28±2℃，150rmin-1振荡培养36小时，再用灭菌水稀释成106-7cfu/ml菌悬液。
1.3.2病原腐霉孢子液的制备
病原腐霉在CA平板上活化2-3次后，挑菌丝接种于CA平板，28℃培养7天，每直径9cm培养皿加灭菌自来水20ml，浸泡30分钟，刮下菌丝及孢子，用组织捣碎机打碎，调节菌丝片段或孢子浓度为105-6个/ml，即为病原菌接种体。
1.3.3生防作用的测定
烟草种子发芽测定：在直径10cm的培养皿上铺三层直径9cm的定性滤纸，121℃湿热灭菌30分钟，80℃烘干，冷却至室温，在超净工作台上打开，培养皿中的1层滤纸吸足待测的拮抗根际细菌悬液后，铺在已吸足病原腐霉孢子液的2层滤纸上，点播清洗、晾干的红大裸种，每皿8×8粒，28℃保湿培养7天，其间滴加灭菌水保湿。用同样稀释的拮抗根际细菌培养液作对照，用1000×的甲霜灵锰锌作为药剂对照，重复3次。7天后调查萌发种子总数及萌发后发病的种子数，计算发病率及拮抗根际细菌的防效。
温室盆栽试验：选择种子发芽病变较低的拮抗根际细菌，如上所述制备菌悬液，灌根接种红大5-6叶期的烟苗(4株共栽于一个小花盆内)，每株5ml，24小时后灌根接种病原腐霉悬浮液，每株5ml。用同样稀释的拮抗根际细菌培养液作对照，用1000×的甲霜灵锰锌作为药剂对照，重复3次。在28-30℃的温室中保湿培养，7～10天后调查萌发病的株数，计算发病率及拮抗根际细菌的防效。
测定结果：
采集重病烟田的健株根际土样分离根际细菌876株，平皿拮抗筛选到拮抗腐霉霉的根际细菌184株，筛选率为21.0％，其中形成抑菌带在5mm以上的菌株92个，拮抗活性较稳定的菌株44个。在拮抗筛选到的44株根际细菌中，防效在75.0％以上的有24个菌株，占筛选菌株的54.5％，防效与对照药剂防效相当的有11个菌株，防效达100.0％，见表1。
表1.种子发芽测定拮抗根际细菌的抑病效果
| 菌株编号 | 抑菌带(mm) | 病变率(％) | 防效(％) | 菌株编号 | 抑菌带(mm) | 病变率(％) | 防效(％) |
| 1 | 10 | 11.4 | 84.3 | 14 | 5 | 8.5 | 88.1 |
续表
| 2345678910111213 | 651355555651613 | 15.69.30008.50006.703.8 | 78.587.2100.0100.0100.088.3100.0100.0100.090.7100.094.8 | 15161718192021222324CKCK* | 19513125516161114-- | 000.7014.14.307.42.2072.40 | 100.0100.099.0100.080.594.1100.089.897.0100.0-100.0 |
注：CK表示空白对照，CK*表示甲霜灵锰锌药剂对照；表中数字为3次的平均值。
表1的数据表明，平皿拮抗抑菌带的宽度大小与发芽测定的防效之间无多大的相关性，因此，平皿拮抗筛选仅可作为生防菌筛选的辅助依据。
烟草种子发芽测定结果中，筛选防效在75.0％的24个菌株进行盆栽试验。结果表明，盆栽防治效果在75.0％以上的菌株有16个，占发芽筛选菌株的66.7％。在盆栽试验中也发现1、3、5、7、10等5个菌株有较明显的促生作用，尤其是5、7这2株促生效果最显著。这些菌株既有较好的防病作用，又有较好的促生效果，是较有应用前景的优良出发菌株(表2)。
表2.拮抗根际细菌盆栽防病效果
| 菌株编号 | 病变率(％) | 防效(％) | 菌株编号 | 病变率(％) | 防效(％) | 菌株编号 | 病变率(％) | 防效(％) |
| 1 | 8.3 | 90.9 | 10 | 0 | 100.0 | 19 | 54.5 | 40.6 |
| 2 | 0 | 100.0 | 11 | 8.3 | 90.9 | 20 | 8.3 | 90.9 |
| 3 | 0 | 100.0 | 12 | 50.0 | 45.5 | 21 | 25.5 | 92.1 |
| 4 | 0 | 100.0 | 13 | 0 | 100.0 | 22 | 66.7 | 27.3 |
| 5 | 0 | 100.0 | 14 | 0 | 100.0 | 23 | 41.7 | 54.5 |
| 6 | 0 | 100.0 | 15 | 50.0 | 45.5 | 24 | 33.3 | 63.7 |
| 7 | 0 | 100.0 | 16 | 66.7 | 27.3 | Ck | 91.7 | - |
| 8 | 0 | 100.0 | 17 | 66.7 | 27.3 | Ck* | 0 | 100.0 |
| 9 | 8.3 | 90.9 | 18 | 0 | 100.0 |
注：CK表示空白对照，CK*表示甲霜灵锰锌药剂对照；表中数字为3次的平均值。
B.烟草主要霉变微生物拮抗细菌的筛选
(1)以猝倒病拮抗菌为筛选对象，同法进行平皿筛选
对烟草种子主要霉变真菌的防除作用测定：利用拮抗菌悬浮液(108cfu/ml)处理带真菌量16.25％烟草种子15min，超净台风干，按常规种子发芽试验方法在滤纸平皿上排列成10×10方阵，28℃半光照保湿培养7天，其间滴加灭菌水保湿。用400×的菌核净作为药剂对照，重复3次。7天后调查萌发种子总数及霉变种子数，计算发病率及拮抗菌防效，结果如表4所示。在测定的24个拮抗猝倒病病菌的菌株中有14株可拮抗烟草赤星病菌，其抑菌带宽度均在5mm以上；防治烟草种子霉变的效果大部分比对照药剂菌核净效果好，最高可达100％(表3)。
表3拮抗细菌对种子霉变的防治效果
| 菌株编号 | 抑菌带(mm) | 病变率(％) | 防效(％) | 菌株编号 | 抑菌带(mm) | 病变率(％) | 防效(％) |
| 1234567CK | 1816917201614- | 3.001.002.671.002.003.002.0016.25 | 81.5493.8583.5793.8587.6981.5487.69- | 891011121314CK* | 1312191010117- | 0.001.000.003.335.0011.2012.6710.25 | 100.0093.85100.0079.5169.2331.0822.0336.92 |
注：CK表示空白对照，CK*表示菌核净药剂对照；表中数字为3次的平均值。
(2)活性菌原液的制备
活性菌活化2～3次后，转入NA斜面培养48小时，再加入5ml灭菌水，振荡15分钟，使菌苔充分悬浮，摇匀，按体积比1∶100接种于筛选的培养液(过100目黄豆粉，20g；工业酵母粉，3.0g；食用红糖，30.0g；工业硫酸镁，0.5g；工业磷酸二氢钾，0.5g；工业磷酸氢二钾，1.0g)中，装液量为总容量的1/10～1/5，28±2℃，150rmin-1振荡培养36小时，胶体磨磨碎，过100目流体筛，即可得活性菌原液。
(3)种子的生物包衣
精选质量达一级良种标准的烟草种子，分袋盛装，活性菌原液浸泡15～20分钟，晾干；再按本领域常规方法进行裸种重量扩大0～20倍的包衣丸化；用喷雾器向种子喷洒以活性菌原液(或其浓缩液)为溶剂配制的营养液，并加入滑石粉，当丸化倍数达20～25倍时，取出用孔径为1.5～1.8mm的不锈钢筛过筛除大颗粒。继续边加包衣辅料边喷洒以活性菌原液为溶剂配制的营养液，丸化40～45倍，定型、抛光、染色，在40℃～42℃下烘干处理5～6小时，即为所需的烟草生物型包衣丸化种子。
实施例2
种衣剂的制备
种衣剂原料组成的重量份数为特种矿质粘土30，滑石粉66，90％万灵原粉0.5，烟草复合肥3.5；将滑石粉的一半加入混合机内，然后加入特种矿质粘土，90％万灵原粉和烟草复合肥，最后将剩余的滑石粉加入混合机中；启动机器，混合15～25分钟后，停机，即制得种衣剂。
实施例3
以活性菌为溶剂配制的营养液
营养液的配制可如表4所示。
表4以活性菌为溶剂配制的营养液
| 贮备液 | 1升营养液含贮备液的毫升数 |
| 1M硝酸钙 | 5×2 |
| 1M硝酸钾 | 5×2 |
| 1M硫酸镁 | 2×2 |
| 1M磷酸二氢钾 | 1×2 |
| Fe-EDTA | 1×2 |
| 微量养分 | 1×2 |
| 活性菌原液(或浓缩液) | 970 |
续表
| ①Fe-EDTA：将0.568的FeSO4.7H2O溶于20ml的水中，0.75g的Na-EDTA溶于20ml的热水中，两种溶液混匀后，定容至100ml的容量瓶内。②微量养分：1升贮备液中含有的克数：1.81克氯化锰、0.11克氯化锌、0.05克氯化铜、0.25克钼化钠、2.86克硼酸③营养液的PH值自然。 |
应用实施例1
生物包衣对烤烟种子活力的影响。将已活化的供试活性菌菌苔一环接种于NB培养液，28℃、150rpm振荡培养48小时，获得各活性菌的原菌液，再分别以各活性菌原菌液替代常规化学处理药剂对供试K326裸种进行包衣，以常规化学处理药剂进行包衣对照，晾干，装袋，即形成了7种生物包衣种子处理和一个对照包衣种子处理。
发芽试验：在Ф10cm的培养皿的内盖内垫上2层Ф12cm的滤纸，外盖内垫一层Ф10cm的滤纸，灭菌，在比较干净的地方，随机取上述包衣种子，以10×10的正方形定点点播，冷却的灭菌水或蒸馏水小心润湿滤纸，以培养皿倾斜有2-3毫升明水为宜。每样品重复4次。置27℃全光照的培养箱中正置培养。种子发芽势、发芽率按常规方法进行，计算发芽指数、活力指数。实验结果见表5。
表5不同活性菌包衣对烟草种子发芽的影响
| 处理编号 | 样品 | 发芽势(％) | 发芽率(％) | 发芽指数 | 活力指数(mg) |
| 12345678 | 本发明样品″″″″″″常规化学农药 | 93.00aA90.50abA86.75bA88.25abA88.50abA89.75abA91.00abA87.50bA | 95.75aA93.50abAB90.00bB90.50bB92.25abAB92.25abAB92.50abAB90.00bB | 18.29aA16.86bBC16.53bcBC16.72bcBC16.96bBC17.24bB16.97bBC16.12cC | 32.38aA27.80abcAB26.60bcdAB25.10cdAB29.25abcAB28.78abcAB31.10abA25.15cdAB |
注：表中字母表示经LSD检测的结果，在α＝0.01水平上的差异显著性用大写字母表示；在α＝0.05水平上的差异显著性用小写字母表示.其中处理编号为1的活性菌株保藏号为CGMCC №.0981，处理编号为7的活性菌株保藏号为CGMCC №.0982.
表5的数据显示，不同生物包衣种子与常规包衣种子比较，发芽势在0.01水平上无显著差异，在0.05水平存在显著差异，其中1号生物处理最显著，比常规包衣种子高出5.50％，2、4、5、6、7号生物包衣略有提高，而3号生物包衣稍有下降。发芽率与常规包衣种子比较存在显著差异，1号生物处理最显著，比常规包衣种子高出5.75％，2、5、6、7号生物包衣略有提高，而3、4号生物包衣与常规包衣种处于同等水平。发芽指数、活力指数与常规包衣种子比较存在显著差异，所有的生物处理都有提高，其中本发明的生物处理达极显著水平。可见，本发明的生物型包衣丸化种子可以显著提高烟草种子的发芽势、活力指数，大大提高了烟草种子的活力，对进一步提高烟草种子田间出苗整齐度、增加成苗可利用率有很大作用，能显著改善烟草包衣种子的质量，满足烟草漂浮育苗、湿润育苗对烟草包衣种子提出的新要求。
应用实施例2
生物包衣种子对猝倒病的防治效果测定。①烟草种子发芽测定：在直径10cm的培养皿上铺2层直径9cm的定性滤纸，121℃湿热灭菌30分钟，80℃烘干，冷却至室温，在超净工作台上打开，培养皿中的2层滤纸吸足病原腐霉孢子液后，点播包衣种子，每皿8×8粒，28℃保湿培养7天，其间滴加灭菌水保湿。用常规药剂包衣种子作为药剂对照，无菌水包衣种子作为空白对照，重复3次。7天后调查萌发种子总数及萌发后发病的种子数，计算发病率及防效。②温室育苗测定：将用麦麸28℃培养7天的烟草猝倒病菌菌丝搅碎，按0.5％的重量比与烟草育苗基质混合均匀，装于20×16cm的塑料筛筐中，以行株距均为2cm的间隔定点点播生物包衣种子，下垫稍大的托盘，按标准湿润育苗的方法进行育苗至大十字期调查，每处理播2框共180粒，以未加病菌菌丝的处理作矫正计测发病率与防效。试验结果表明：生物包衣种子对烟草猝倒病具有明显的防效，有些微生物菌剂的包衣防效可高达100％，见表6。试验结果显示，生物包衣种子对烟草猝倒病具有明显的防效。
表6不同活性菌包衣种子对烟草猝倒病的防治效果
| 处理编号 | 试验样品 | 平皿发病率(％) | 平皿防效(％) | 苗床发病率(％) | 苗床防效(％) |
| 12345678CK | 本发明样品″″″″″″常规化学农药无菌水 | 007.812.3016.8012.390.2 | 100.0100.091.486.4100.081.4100.086.4- | 008.615.405.7015.485.4 | 100.0100.089.981.9100.093.3100.082.0- |
Claims (2)
1.一种烟草生物型包衣丸化种子的生产方法，该方法采用下述顺序的步骤：
(1)生物包衣活性菌的分离与筛选
采用同步平皿对峙法、种子发芽法及温室盆栽法筛选拮抗瓜果腐霉、促
进植物生长的根际细菌；再进一步采用同步对峙法、菌悬液生物处理法筛选对主要霉变微生物具有防除作用的根际拮抗细菌，经筛选得到保藏编号分别为CGMCC№.0981、CGMCC№.0982的2株活性菌，该活性菌的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus SP.)；
(2)活性菌原液的制备
采用所述的CGMCC№.0981或者CGMCC№.0982活性菌，活化2～3次后，转入NA斜面培养48小时，再加入5ml灭菌水，振荡15分钟，使菌苔充分悬浮，摇匀，按体积比1∶100接种于筛选的培养液中；所述培养液由过100目黄豆粉20g；工业酵母粉3.0g；食用红糖30.0g；工业硫酸镁0.5g；工业磷酸二氢钾0.5g和工业磷酸氢二钾1.0g组成，装液量为总容量的1/10～1/5，28+2℃，150rmin-1振荡培养36小时，胶体磨磨碎，过100目流体筛，即为活性菌原液；
(3)种子的生物包衣
精选质量达一级良种标准的烟草种子，分袋盛装，活性菌原液浸泡15～20分钟，晾干；再按本领域常规方法进行裸种重量扩大0～20倍的包衣丸化；用喷雾器向种子喷洒以活性菌原液或其浓缩液为溶剂配制的营养液，并加入滑石粉，当丸化倍数达20～25倍时，取出用孔径为1.5～1.8mm的不锈钢筛过筛除大颗粒；继续边加包衣辅料边喷洒以活性菌原液为溶剂配制的营养液，丸化70～75倍，定型、抛光、染色，在45℃以下烘干，即为所需的烟草生物型包衣丸化种子。
2.根据权利要求1所述的烟草生物型包衣丸化种子的生产方法，其中所述的以活性菌原液或其浓缩液为溶剂配制的营养液如下表：
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