CN110055303A - 一种高通量筛选用于防治植物土传真菌病害微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高通量筛选用于防治植物土传真菌病害微生物的方法，属于农业微生物技术领域。本发明将人工培养的高浓度小麦根腐病病原菌培养物与土壤制作成发病土壤，小麦种子催芽后播种于含病原菌的土壤中，最大程度模拟植物和病原菌的在土壤中自然生长条件和环境；本发明建立了针对小麦平脐蠕孢菌的拮抗微生物的病原‑植物发病体系下的筛选方法，小麦密植减小筛选占用的空间，小麦根腐病症状出现早缩短了筛选所需的时间，从而实现高通量筛选，针对进一步筛选前期获得的具有较好抑制病原菌作用的微生物的筛选效率大大提高，能够屏除大量的在实际应用中无法发挥防效的微生物，从而加快微生物筛选、微生物农药研发和微生物肥料研发的步伐。
Description
技术领域
本发明涉及一种高通量筛选用于防治植物土传真菌病害微生物的方法，属于农业微生物技术领域。
背景技术
植物病原真菌引起的土传真菌病害约占所有植物病害的70-80％，其症状类型繁多、可以出现在植物的各个部位和生长期的各个阶段。生物防治已经是目前全世界公认的环保、无公害、绿色、友好、持久的可以替代传统化学农药的防治病害的一种方法，如何获得具有良好生防效果并可以实现大规模工业化生产的微生物资源是科研院所和公司企业的核心技术。
根据使用体系载体的种类，目前常规的筛选方法基本可以分为体外平板抑制实验和体内植物-病原体盆栽实验两种。科研人员广泛采用的是先在培养皿上使用对峙培养法筛选具有抑制病原真菌生长能力的微生物，再通过盆栽实验进行验证。植物-病原活体筛选系统是生防菌株筛选过程中的关键步骤和限速步骤。目前科研人员使用的植物-病原体盆栽实验，一般是将植物种子或幼苗通过蘸根处理使其发病，或者是将病原真菌的孢子悬液浇灌于土壤中使植物发病，常用的植物包括棉花、黄瓜、番茄等，这些植物每个花盆中只能栽种1-2棵苗，植物从生长到发病常常需要一个月至几个月的时间。所以从平板筛选到花盆实验的筛选工作是一个耗时、费力、繁琐的过程，不容易大批量操作，需要建立一个从平板到盆栽过程中可以高通量筛选具有潜力的微生物的中间桥梁筛选模型。
现有的一些专利虽然描述了一些方法，但广谱性还不够强。
CN101831393A中描述的使用生姜的组织过滤液作为筛选培养基来富集培养可以以生姜组织为营养的微生物，该发明作物靶标性强，但并不能确定所得微生物是否可以随同植物在土壤中一并繁殖。
CN101805717B针对的是筛选具有产生生物膜能力和植酸钙水解能力的微生物方法。
CN103981249B所用到的辣椒疫霉(Phytophthora capsici)属于卵菌门疫霉属，在细胞结构、细胞成分、繁殖方式显著不同，在系统进化上有别于其它植物病原真菌。
CN101148648A所述的筛选方法仍停留在实验室平板上，属于体外培养法。
CN103371041A所用到的黄瓜蘸根处理法均是在无菌条件下进行的，而且实际的农业生产中黄瓜枯萎病的发生并不是在移苗时蘸根处理发生的，而是由土壤中所潜伏的黄瓜枯萎病病原菌侵染造成的。该方法适合实验室操作，但并不符合实际的生产情况，在实际的农业生产中作物是在土壤中进行生长。
该桥梁筛选模型需要满足以下四个条件：一是具有代表性：即所选取的植物与引起其病害的植物病原真菌为常见病害，对我国乃至世界的农业生产造成很大影响。二是人工建立的桥梁筛选模型稳定发病：即所选取的植物病原真菌能够稳定的侵染对应的植物并使其表现出易于判断的病征。三是可以进行高通量筛选：即该系统操作简单、可以高密度种植、占用空间小、易于重复、可以大批量操作、尤其是在实验室内或者户外能够重复操作、得到发病体系，从而能够保证实验的进行。四是筛选过程所需时间短：即该系统生长周期不能太长，能够在短期内表现出病症以获得结果。
小麦根腐病是小麦生产中常见的土传病害之一，是一种全球性病害，小麦的全生育期均可发病，严重影响小麦产量，一般使小麦减产20-60％。小麦根腐病是多种病原菌入侵混合发生的一类复合侵染的根病，以小麦平脐蠕孢菌引起为主，病原菌无性态为Bipolaris sorokiniana(Sacc.In Sorok)Shoem.，有性态为Cochliobolus sativus(Itoet Kurib.)Drechsl.，为子囊菌门旋孢腔菌属禾旋孢腔菌。该病原菌在田间可随小麦病残体在土壤中或在种子上越冬或越夏，借风雨传播，进行侵染和再侵染。因此，建立一种针对小麦根腐病病原菌的抗性微生物筛选方法对于防治小麦根腐病具有重要的应用潜力。
发明内容
本发明针对目前常规的费时费力的盆栽实验系统，建立了一种高通量筛选用于防治植物土传真菌病害微生物的方法，该方法针对于小麦根腐病，具有筛选体系体积小、操作简单、易于重复、周期短，可进行高通量筛选潜力微生物的特点。
本发明的第一个目的是提供一种高通量筛选用于防治植物土传真菌病害的方法，所述方法是将待筛选的微生物处理小麦种子，将处理后的小麦种子播种于含小麦根腐病致病菌的土壤中；出苗后，与未用微生物处理的种子播种于含有小麦根腐病致病菌土壤中的阴性对照组相比，小麦的出苗率、株高等高于阴性对照组的待筛选处理组，即表示待筛选的微生物可用于防治植物土传真菌病害；所述病原菌在土壤中的孢子浓度为1×106～5×106个/g土壤；所述筛选方法在体积为50～60mL的体系下进行；所述发病是指植株表现为出苗率降低、植株生长缓慢、矮小，株高、湿重、茎秆直径均小于正常植株。
在本发明的一种实施方式中，所述小麦根腐病病菌是小麦平脐蠕孢菌。
在本发明的一种实施方式中，所述小麦根腐病病菌是小麦平脐蠕孢菌ACCC36529。
在本发明的一种实施方式中，所述处理包括拌种、浸种或包被。
在本发明的一种实施方式中，所述拌种是用含待筛选的微生物的细胞悬液对小麦种子进行拌种。
在本发明的一种实施方式中，所述浸种是用含待筛选的微生物的细胞悬液对小麦种子进行浸种。
在本发明的一种实施方式中，所述包被是用含有10～20g/L的包衣处理剂CMC(羧甲基纤维素钠)和待筛选微生物孢子悬液按1:1～2的体积比混合的混合液来处理小麦种子。
在本发明的一种实施方式中，所述包被是用含20g/L的CMC与待筛选微生物的孢子悬液按等体积比混合后包被。
在本发明的一种实施方式中，所述处理具体是：将待筛选的样品制成菌悬液或孢子悬液，使孢子量或菌浓度控制在1×106～9×107CFU/mL；将孢子悬液与等体积的2％CMC混匀后包被催芽的小麦种子。
在本发明的一种实施方式中，将处理后的小麦种植于小麦根腐病发病体系的土壤中，置于植物培养架或者室外培养。
在本发明的一种实施方式中，所述土壤是营养土和沙土＝1:1的土壤。
本发明的第二个目的是提供一种人工建立的病原菌-植物发病系统，包括5～10％(v/v)含病原菌的混合培养物和植物；所述植物播种和/或培养在所述含病原菌的混合培养物中；所述病原菌的孢子浓度为1～5×106个/g混合培养物。
本发明还要求保护所述方法在在微生物筛选、微生物农药研发、微生物肥料研发方面的应用。
有益效果：(1)本发明的筛选体系具有体积小，易操作的特点，总体积只需要50-60g或50-60mL的土壤即可，可在直径5-6cm的透明水杯或花盆中进行操作。与传统的盆栽实验相比，小麦可以密植，筛选过程占用空间小，从而节约了栽培材料和操作空间，可以同时对几十株甚至上百株待筛选微生物进行操作，实现高通量筛选；
(2)应用本发明的方法小麦根腐病症状出现早，可缩短筛选周期，快速观察到结果。整个植物生长周期为14天即可明显的观察到植物由于受植物病原真菌的侵染而表现出出苗率降低、生长缓慢、植株鲜重和干重降低等病症，极大加快了筛选具有实际应用价值微生物的步伐，缩短了时间，节约了成本。
(3)本发明建立的植物发病体系最大程度的模拟了自然界中种子在含有病原菌的土壤中被侵染而发病的过程。本发明将小麦根腐病菌附着于小麦种子颗粒上，再混合于土壤中，模拟了小麦在含有病原菌的土壤中生长的状态，相比常规的蘸根和浇灌孢子悬液的方式，可以最大程度还原种子的生长环境，屏除了在土壤中不能够存活或不能发挥抑制作用的无效微生物，从而可以得到更可靠的实验结果。
附图说明
图1为小麦根腐病菌的生长形态和孢子形态；
图2为含不同比例小麦根腐病菌培养物的植物病害系统；其中，1/40、1/20、1/10、1/5表示病土的添加量；
图3为利用小麦-小麦根腐病发病系统大量筛选拮抗微生物；其中，14d表示培养14天；
图4为不同物质利用本发明体系进行筛选效果的验证；其中，CK为空白对照；NC为阴性对照。
具体实施方式
实施例1：小麦根腐病菌的培养
本发明所使用的小麦平脐蠕孢菌购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为ACCC 36529。该菌株可以在PDA培养基上生长，在25～30℃环境下，2-3天内菌丝可以长满整个培养基表面，之后开始生长气生菌丝，4-6天产生棕色或褐色的分生孢子。分生孢子长椭圆形或长梭形，有3-9个隔膜不等。脐点宽大，基部平截(图1)。
实施例2：小麦根腐病菌病土的制备
培养基的制备：将小麦种子浸泡过夜，次日将水滤掉，将吸足水的小麦种子放入三角瓶中，每瓶装种子量(按体积计，v/v)30-40％，间歇灭菌两次。
病土的培养：将在PDA培养基上已经产孢的小麦平脐蠕孢菌连同培养基切割成小块，接种入装有灭菌小麦的三角瓶中，混匀，28℃黑暗培养5～8天至病原菌菌丝长满小麦种子；28℃光照培养2周，直至小麦平脐蠕孢菌在小麦种子上产生黑色孢子；自然通风干燥1-2天，用粉碎机将轻微粉碎即可得到含有小麦平脐蠕孢菌的病土，病土中小麦平脐蠕孢菌孢子浓度为1×106～5×106个/g。
实施例3：小麦根腐病菌病土的使用比例确定
在营养土和沙土＝1:1的土壤中，按照不同的体积比加入实施例2制作的含小麦根腐病菌的病土，观察小麦的生长情况。当小麦苗出现出苗缓慢、生长矮小、叶片出现病斑时认为是发病症状。选取在最小添加量下出现病症的比例进行重复。结果显示，小麦根腐病菌病土的添加比例大于10％(v/v)时，与空白对照相比明显出现出苗率严重滞后或不出苗、生长严重受损或基本不能生长的现象；小麦根腐病菌病土的添加比例为2.5％(v/v)时，与空白对照相比，出现生长缓慢不明显、植株矮小不明显的现象；添加体积为5％～10％(v/v)时，可以均一出现小麦植株出苗率低、植株生长缓慢和矮小、植株湿重低于空白对照组，因此，以添加体积为5～10％(v/v)为最佳使用剂量(图2)。
实施例4：利用本发明体系对大量的有抑菌活性的微生物的筛选
小麦种子的处理：将小麦种子进行表面消毒，使用10％的84消毒液浸泡1-2分钟，用大量的无菌水冲洗后，放在铺有两层湿润滤纸的培养皿中，种子的上面也覆盖两层湿润的无菌水(不滴水)，于2℃培养箱静置催芽12-16小时，露白的种子可以使用。
待筛选微生物的准备：将抑菌微生物从培养基上直接刮取，制备孢子悬液，或者将抑菌微生物液体培养以获得孢子悬液，孢子量控制在1×106～9×107CFU/mL。
植物-病原菌体系的使用：将待筛选微生物的孢子悬液与等体积的2％羧甲基纤维素钠(CMC)混匀后包被催芽的小麦种子0.5-1h，液体体积尽量小，以最大量提高包被微生物的孢子含量。将包被好的小麦种子播种于实施例3制备的小麦根腐病菌发病土壤中，每个培养体系中填充50～60g土壤，置于直径为5～6cm的容器中，播种10～12粒处理后的小麦种子，于植物培养架或者室外培养。培养至第三天即可观察结果，记录出苗率。待小麦生长至10-14天左右即可进行株高、茎秆直径、和干湿重的测量。每个处理组至少做三盆重复。
如图3所示，自左向右数，前3列为空白对照组，即小麦使用无菌水处理，并在正常的不添加小麦根腐病菌的土壤中可以正常生长。中间三列为阴性对照组，即小麦使用无菌水处理，并在正常土壤中添加了10％(v/v)小麦根腐病病原菌后人工制作的发病土壤。与空白对照组相比，阴性对照组的小麦在含有病原菌土壤中因生长受到病原菌的侵染而表现为植株生长极其缓慢、植株显著矮小、出苗率明显小于空白对照组。其余三列为待筛选微生物处理组(图中标记为微生物的命名及培养天数，14d表示培养14天)，可以看出在土壤中不能存活或在土壤中不能发挥抑制病害菌作用的微生物处理组，小麦生长情况与阴性对照组类似或基本相同；而能够在土壤中存活或能够在土壤中发挥抑制病害菌作用的微生物处理组，小麦的生长情况则最大程度接近于空白对照组。根据该系统的实验结果和后期的重复实验，筛选获得一株具有潜力的菌株W68，经后续的验证，W68菌株不仅对小麦根腐病有很明显的生防效果，而且对甜瓜枯萎病、小麦全蚀病、辣椒疫霉病、黄瓜枯萎病也具有明显的生防效果。
实施例5：抑菌微生物的效果验证
以不含小麦根腐病病土的土壤为空白对照组(CK)，以含有5％(v/v)的病土为阴性对照组(NC)，使用筛选获得的菌株W68菌悬液包被处理小麦种子后播种于含有5％(v/v)小麦根腐病病土的土壤中为W68处理组，使用市场上常用的商业化药剂甲基托布津(甲托)包被小麦，甲基托布津用量为：每100g有效成分甲托/100kg麦种，闷种6小时后播种于含有5％(v/v)小麦根腐病病土的土壤中，作为阳性对照组，将上述处理条件下的小麦种子分别按10粒小麦种子/盆播种，每个处理条件重复四盆。于五月中旬开始在相同条件下室温培养，每日根据土壤的干湿程度浇相同量的水。
结果显示，在第14天时，空白对照组的出苗率为96.7％，阴性对照组的出苗率为63.3％，阳性对照组的出苗率为70％，W68处理组的出苗率为93.3％，可以基本达到空白对照组出苗率的水平，并显著优于阳性对照组的出苗率。通过对小麦的地上部株高测量，空白对照组的平均株高为27.95cm，阴性对照组的平均株高为20.57cm，阳性对照组的平均株高为21.92cm，W68处理组的平均株高为25.65cm，株高结果显示筛选微生物处理组的植物株高基本接近空白对照组。通过对小麦茎秆最大直径的测量，空白对照组的平均茎秆直径为3.77mm，阴性对照组的平均茎秆直径为2.39mm，阳性对照组的平均茎秆直径为2.49mm，W68处理组的平均茎秆直径为2.99mm，株高结果显示筛选微生物处理组的植物茎秆最大直径均高于阴性对照组合阳性对照组。通过对小麦湿重和干重的测量，空白对照组的平均湿重和干重分别为1.09g/棵和0.67g/棵，阴性对照组的平均湿重和干重分别为0.44g/棵和0.06g/棵，阳性对照组的平均湿重和干重分别为2.61g/棵和0.29g/棵，W68处理组的平均湿重和干重分别为0.70g/棵和0.09g/棵，湿重和干重结果显示筛选微生物处理组的植物平均重量均高于阳性对照组和阴性对照组。从上述所有的统计结果可以看出，利用本发明的方法筛选到的微生物具有继续开发成微生物制剂的潜力(图4)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种高通量筛选用于防治植物土传真菌病害微生物的方法，其特征在于，所述方法是用待筛选的微生物处理小麦种子，将处理后的小麦种子播种于含有小麦根腐病致病菌的土壤中；出苗后的小麦出苗率、株高明显高于未用微生物处理种子的对照组，即表示待筛选的微生物可用于防治植物土传真菌病害；所述小麦根腐病致病菌在土壤中的孢子浓度为1×106～5×106个/g土壤；所述筛选方法中小麦播种于体积为50～60mL的土壤中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小麦根腐病致病菌为平脐孺孢菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物处理小麦种子的方法包括拌种、浸种或包被。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，拌种是先将待筛选的微生物的制备成细胞悬液，然后将种子直接与待筛选的微生物细胞悬液进行混合，种子与微生物细胞悬液的比例为1:0.01～1:0.1，种子阴干后播种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，浸种是先将待筛选的微生物的制备成细胞悬液，然后指将小麦种子与微生物细胞悬液进行混合，种子与微生物细胞悬液的比例为1:0.2～1:5，处理时间不超过24小时，种子阴干后播种。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包被是先将待筛选的微生物孢子或细胞悬液与2～20g/L羧甲基纤维素钠溶液进行混合，然后用混合液与小麦种子充分混合，种子阴干后播种。所述羧甲基纤维素钠溶液与待筛选的微生物的孢子或细胞悬液按1:1～2的体积比混合。
7.根据权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于，所述处理具体是：将待筛选的样品制成微生物孢子或细胞悬液，使孢子量或细胞浓度控制在1×106～1×109CFU/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述土壤是以营养土和沙土进行1:1混合形成的植物栽培基质。
9.一种人工建立的病原菌-植物发病系统，其特征在于，体积为50～60mL，由权利要求8所述土壤与病原菌形成的混合物，其中平脐孺孢菌浓度为1×106～5×107个/g；所述植物播种和/或培养在所述混合培养物中。
10.权利要求1～9任一所述方法在微生物筛选、微生物农药研发、微生物肥料研发方面的应用。
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