CN104962500A - 解磷细菌及其分离和培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解磷细菌及其分离和培养方法和应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2012017。本发明的解磷细菌wpm-03具有高效的降解有机磷的能力，同时能够促进植物生长，可以用于制备生物肥料，尤其适合施用于种植牧草的土地。

Description

解磷细菌及其分离和培养方法和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域；涉及一种解磷细菌及其分离和培养方法和应用。

背景技术

在我国南方，土壤酸化是一个突出而普遍的问题，已成为影响农业生产和环境质量的主要因素之一。土壤酸化，实质上是指土壤接受输入其中的H⁺后，H⁺与土壤胶体上的盐基性阳离子发生交换反应，从而吸附在土粒表面，交换下来的盐基性阳离子则随渗漏水淋失；另一方面，土壤表面H⁺又自发地与矿物晶格表面的铝反应，迅速转化为交换性铝，导致土壤盐基性阳离子减少，氢、铝离子增加，土壤pH值降低，有毒金属离子活性增大。结果是，土壤酸化不仅导致铝、锰和氢对植物的毒害；还造成土壤中营养元素的转化与释放困难，尤其表现在磷和钾的缺乏上；土壤过酸还会明显影响土壤中微生物的活动、有机质的合成和分解、微量元素的有效性以及土壤保持养分的能力等，从而影响土壤生态环境质量和作物的生长。

缺磷是造成土壤酸化问题的一个重要因素，因此增施磷肥可减少玉米、燕麦、三叶草和大麦等植株体内过量阳离子的含量，减少土壤酸化程度。化学磷肥的施用，虽然在一定条件下增加了土壤有效磷的含量，但是施入的磷肥常因与土壤中的Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Al³⁺结合形成难溶性磷酸盐而丧失其有效性，一般情况下只有5％-25％的磷肥能被当季作物吸收。磷肥施用过多时，则不仅增加农业成本，还会使土壤中不能被作物吸收利用的无效磷因积累过多引起土壤板结；过多的土壤磷素也容易随水土流失迁移进入水体，导致水体富营养化，造成环境污染。因此，寻求活化土壤中作物难利用磷的途径或方法，提高磷肥利用率，不仅对农业的持续发展和生态系统的维护，都具有重要的意义，也为解决植物根际酸化问题提供了保障。

解磷微生物(Phosphate-solubilizing microorganism,PSM)是一类能够将植物难以吸收的磷转化为可利用状态的微生物。解磷微生物在高效解磷的同时，不会造成生存介质pH值的降低，且由于解磷微生物不仅为根系提供磷素营养，还促进 根系对N、K、Ca、Mg、Fe、Zn等营养元素的吸收，很大程度上减轻了由于营养缺乏导致的根际酸化作用。因而，利用解磷微生物来提高土壤磷素的利用率，并通过微生物来影响根系分泌物的种类与数量，有助于改善和缓解柱花草等植物根际土壤酸化问题，是一条值得探索的途径。

解磷微生物包括细菌、真菌和放线菌。解磷微生物有强烈的根际效应，即解磷微生物的种类、数量、分布和菌种与根际环境间相互关系等均受根际微域环境的影响。一方面，根系分泌物为微生物生长繁殖提供了碳源等能源，有利于微生物生长发育；另一方面，根际微生物的活动和代谢作用，又影响植物根系营养物质吸收和根系分泌物的释放。当解磷微生物作为菌肥施入作物根际后，一方面，其不断地氧化根系分泌的葡萄糖和其他碳水化合物以获得能量，随着解磷微生物在根际定殖、生长繁殖，所需能量越多，就进一步刺激根系分泌更多的葡萄糖等能源物质；另一方面，解磷微生物通过代谢活动溶解根际的难溶性磷化物，补充了植物的磷素营养，同时促进N、K、Ca、Mg、Fe、Zn等其他营养元素的吸收，不仅刺激植物快速生长，充足的营养物质，减少了根系有机酸、磷酸酶等物质的分泌，在很大程度上减轻了植物由于营养缺乏而导致的根际酸化现象。

从农业的可持续发展来看，提高土壤磷库中难溶性磷素资源的利用率是解决磷缺乏问题的最佳途径，利用解磷微生物制成微生物肥料具有重大的开发应用价值及强劲的市场竞争力。但是，由于解磷微生物的种类繁多，分解机制不尽相同且很复杂，解磷微生物做成菌剂施入土壤后，其活动规律和消长动态以及解磷作用的发挥条件都不大了解，以致于解磷微生物在我国的研究近几十年，所筛选的解磷菌株的解磷效果还是不太理想。例如，中国专利申请CN201010590115.2公开了一种解磷真菌；然而在筛选解磷真菌时采集的样品来源范围小，使得所筛选的真菌种类较少，且在进一步纯化过程中容易失去解磷能力。中国专利申请CN201010532768.5公开了一种从田间土壤分离到的枯草芽孢杆菌，但该菌株仅对土壤有机磷具有解磷作用，对难溶性无机磷则效果不佳。

因此，迫切需要开发一种新的具有高效解磷效果的解磷微生物及其分离和培养方法和应用。

发明内容

本发明目的之一是克服现有技术的不足，提供一种具有高效解磷效果的解磷微生物。

本发明目的之二是提供一种上述解磷微生物的分离和培养方法。

本发明目的之三是提供一种上述解磷微生物的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：一种解磷细菌，其为泛菌属(Pantoea spp.)，wpm-03，已于2012年2月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院，邮编430072；保藏编号为CCTCC No:M2012017。

上述解磷细菌wpm-03为革兰氏阴性杆菌；菌落呈圆形或椭圆形、表面光滑、凸透、质地松软、不透明、边缘完整、淡黄色；或有菌株呈假根状、边缘为丝状。生长速度快，接种24小时后可在卵黄培养基上观察到生长。

另一方面，本发明提供了一种上述解磷细菌wpm-03的分离方法，其特征在于：采集红树林根际土壤，加无菌水制成稀释液，用卵黄平板培养基培养，筛选出溶磷圈最大的若干菌株；继续用蒙金娜液体有机磷培养基培养，筛选出培养基上清液中可溶性磷含量最高的菌株；进行鉴定，得到所述解磷细菌wpm-03。

所述卵黄平板培养基为蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值7.0。

所述蒙金娜有机磷培养基为葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，卵磷脂1.0g，CaCO₃5g，酵母膏0.4g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5。

又一方面，本发明提供了上述解磷细菌wpm-03的培养方法，其特征在于：以蔗糖作为碳源，以硝酸钾为氮源，pH值6.5～8.5，温度28～32℃。

在一个优选的实施方式中，所述培养方法为蔗糖5.0g/l，KNO₃1.50g/l，pH为7.0，温度为28℃

最后，本发明还提供了上述解磷细菌wpm-03在制备生物肥料中的应用。

所述生物肥料用于促进植物生长和/或溶解土壤中有机磷，从而减轻植物根际酸化。

所述生物肥料的制备方法如下：取保存的解磷细菌wpm-03，活化12小时后，涂布于有机磷固体培养基上，于28℃培养箱培养24-48小时，待长出菌落后，刮 入无菌水中，于旋转器上旋转打散菌落，利用比浊法，通过测定菌悬液DO₄₄₀来进行调制，调至含菌量达到10⁹个/mL。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明筛选出的解磷细菌wpm-03，对有机磷的降解能力高，同时能够促进植物生长，并且能够明显缓解柱花草根际酸化。

(2)该菌株扩大培养方法简单，培养基成本低，可以大规模培养，制备成生物肥料。

具体实施方式

实施例1：解磷细菌wpm-03的筛选及鉴定 

1按照下列方法步骤配制培养基和试剂

1.1培养基

卵黄培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.0。分装灭菌，临用时每50ml加入新鲜蛋黄液3mL(蛋黄与生理盐水等比例混合)，用无菌吸管吸取3mL蛋黄液加入已融化的培养基中(培养基温度不宜过高，约在45℃左右加入蛋黄液较为合适，加入蛋黄液时也应缓缓加入，以免产生过多气泡)，充分混匀后，倒平板。

牛肉膏蛋白胨斜面培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

蒙金娜有机磷液体培养基：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，卵磷脂1.0g，CaCO₃5g，酵母膏0.4g，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.5。

1.2试剂

钼酸铵-硫酸溶液：181mL浓硫酸加入800mL蒸馏水中，加细碎的钼酸铵25克，搅拌溶解加水至1000mL(约6.5N H₂SO₄)。

酒石酸锑钾-阿拉伯树胶溶液：阿拉伯树胶2g，加水200mL，加热溶解，注入800mL水中，搅拌均匀，加酒石酸锑钾0.63g，搅拌溶解，此液不宜久存，根据用量酌情少配。

钼锑抗显色液：取试剂钼酸铵-硫酸溶液100mL加蒸馏水800mL，再加试剂酒石酸锑钾-阿拉伯树胶溶液100mL，配制成1000mL混合溶液，再在混合溶液中 加入1g抗坏血酸溶解、摇匀，即成显色液(0.6N H₂SO₄)。此试剂不宜久放，最好临用临配。

50PPM磷标准溶液：KH₂PO₄(A.R)在105～110℃干燥两小时，冷后称取0.1098g于50mL烧杯中，加水20mL溶解，转于500mL容量瓶中，加水至刻度摇匀。再分别吸50PPM磷标准溶液4、8、12、16、20、24mL于100mL容量瓶中，各加水约40mL，浓硫酸10.8mL，摇匀，每mL分别含磷2、4、6、8、10、12μg。

2.筛选方法

2.1溶菌圈法初筛 

从海南海口市琼山东寨港、文昌市清澜港红树林保护中心，采集红树林根际土样，用无菌胶袋装好，并在袋上注明采集地点、日期、土样号，带回实验室。立即称取部分土壤进行含水量测定。随后，将剩余土样分别置于塑料袋中，研钵研细，各称取10g土于90mL无菌水中，加入约20粒灭过菌的玻璃珠，振荡30min，按10倍稀释法稀释样品。用加样枪吸取10^-4，10^-5和10^-6三个稀释浓度样品各0.1mL，涂布于卵黄培养基的平板上，在28℃培养2d，观察有无溶菌圈，记录具有透明圈的菌落个数，根据溶菌圈的直径与菌落直径的大小比值来初步确定解磷能力，再用接种针挑取有明显透明圈的菌落，在平板培养基上多次用连续划线的方法，进一步分离纯化，将提纯的菌株转接到牛肉膏蛋白胨斜面培养基保存于4℃冰箱中。

初筛结果：对10种红树林根际微生物进行分离、培养后，发现共有27个菌株能在卵黄平板上形成明显透明圈。

从初筛的27个菌株中，依据溶菌圈的大小，优选出溶磷效果好的16株红树林根际解磷细菌，进行菌落观察和溶菌圈测定，结果见表1。

表1红树林根际解磷细菌菌落特性

注：表1中，生长快慢表示法为：++++表示在24h后观察到生长，+++表示在48h后观察到生长，++表示在72h后观察到生长，+表示在120h后观察到生长。

在解磷细菌培养过程中观察到：

①在有机磷平板上，红树林解磷细菌菌落大都呈圆形或近圆形、表面光滑、凸透、质地松软、不透明、边缘完整、乳白色，只有极少几株呈假根状、边缘为丝状。绝大多数有机磷菌株生长速度中等，24h后可在卵黄培养基上观察到生长。菌株的生长速度与其竞争能力有一定的关系，生长速度快，占领空间和获取营养的能力强，容易在竞争中获胜。因此，若利用这些微生物作为微生物肥料，其在土壤更易存活，形成优势菌种，有利于肥效的发挥。

②通过对磷细菌溶菌圈直径、菌落生长直径(d)、溶磷圈直径和菌落生长直径比值(D/d)观察，发现红树林根际有机磷细菌的溶解能力较强，D/d值在1.0～2.2间变动。

2.2液体摇瓶法复筛

液体培养法是测定解磷效果的定量方法之一。在培养基上观察得到溶菌圈，只是表征了菌体的解磷特性，其解磷能力大小还需要通过定量测定加以说明。本实验以卵磷脂为唯一有机磷来源测定有机磷菌株的解磷能力。

菌悬液配制：将初筛保存于冰箱中的各菌株接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，于28℃培养箱中，培养24h，挑取细菌接入到无菌水中，制成含菌量约为10⁸个/mL的菌悬液。

液体摇瓶培养：配制液体培养基(蒙金娜有机磷培养基)，取1mL菌液，接入50mL灭菌的液体培养基(放于150mL三角瓶内)中，同时做不接种对照(培养基中加入1mL无菌水),每一菌株做3个重复，在28℃下，往复摇床160r/min，培养5d。

培养液中可溶性磷含量的测定：将培养后的有机磷培养液在12000rpm下离心30min，吸取上清液，用钼锑抗比色法测定含磷量。细菌溶磷量为扣除不接种对照的值，用mg/L来表示。

具体作法是：吸取离心后的上清液1mL于25mL小三角瓶中，加入钼锑抗显色液10mL，充分摇匀，放置一小时以上，用650nm波长及1cm比色杯测定吸光度，同时进行空白试验，样品测定值E减空白测定值E₀，即得样品溶液的实际测定值。同时分别吸每毫升含磷2、4、6、8、10、12μg标准溶液各1mL于6个25mL小三角瓶中，再同样品一样，加入显色溶液10mL，摇匀后放置一小时以上，用650nm波长及1cm比色杯测定吸光度，此标准显色液分别含磷2、4、6、8、10、12μg，以微克数为横坐标，吸光值(E)为纵坐标绘制标准曲线，并计算通过零点曲线的磷含量(单位：微克)与吸收值E的比值，即常数K，待测溶液的含磷量即为：P％＝(E-E₀)×K×12.5×100/样重＝(E-E₀)×K×0.00125/样重。

实验结果见表2。由表2可以看出，在所选的16株红树林根际有机磷细菌，解卵磷脂能力较高，最高为4.3mg/L。

表2磷细菌分解难溶性磷的能力

菌株号	OD650	可溶性磷含量(mg/L)
			MO 1-4-1	0.153	3.50
MO 1-4-2	0.151	3.45
			wpm-03	0.166	3.77
MO 1-4-5	0.149	3.40
			MO 1-4-6	0.158	3.60
MO 1-5-1	0.149	3.40
			MO 1-5-2	0.079	1.95
MO 1-5-3	0.151	3.45
			MO 1-6-1	0.115	2.70
MO 1-2	0.132	3.06
			MO 3-4-2	0.161	3.65
MO 3-4-3	0.153	3.50
			MO 3-6-1	0.151	3.45
MO 3-6-4	0.144	3.3
			MO 4-5-1	0.192	4.3
MO 4-6-1	0.161	3.65

2.3菌株鉴定

经过初筛和复筛后，利用平板划线法，将具有较高解磷能力的菌株进一步纯化，筛选出1株高效解磷细菌wpm-03，送往广东微生物研究所，以法国生物梅里 埃API鉴定系统、Biolog鉴定系统来鉴定解磷菌株，结果见表3。

表3磷细菌鉴定结果

样品编号	革兰氏染色	氧化酶/解酶试验	鉴定方法	鉴定结果
					wpm-03	革兰氏阴性杆菌	氧化酶阴性	API 20E	泛菌属

经鉴定后，该菌株为wpm-03(Pantoea spp.)，其为泛菌属(Pantoea spp.)，wpm-03，已于2012年2月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院，邮编430072；保藏编号为CCTCC No:M2012017。

实施例2：解磷细菌wpm-03最佳培养条件研究

1培养基

菌种保存培养基：牛肉膏蛋白胨斜面培养基；基础培养基：蒙金娜有机磷液体培养基；碳源培养基：将蒙金娜有机磷液体培养基的碳源(葡萄糖)改变为蔗糖、甘露醇和淀粉。氮源培养基：将蒙金娜有机磷液体培养基的氮源((NH₄)₂SO₄)改变为KNO₃、尿素和NH₄NO₃，含氮量相同。pH影响测定：以蒙金娜有机磷液体培养基为基础培养基，用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH溶液调pH至不同值。

2各参数测定 

pH值测定：取菌体发酵液或其发酵液的离心上清液，用pH计测量。菌数测定：用微量移液器吸取1mL待测菌悬液，按10倍稀释法稀释，再吸取10^-4，10^-5和10^-6三个稀释浓度样品各0.1mL，涂布于卵黄培养基的平板上。有机磷细菌在28℃培养2d，分别记录菌落个数。菌体量测定：将菌液稀释成不同梯度，利用分光光度计，在440nm波长处比色测其吸光值，绘制吸光度与菌密度相关的标准曲线，再依照标准曲线推算出菌悬液的浓度与菌数。解磷能力测定：钼锑抗比色法。

实验结果：生长曲线是指在适宜的条件下培养微生物细胞，以培养时间为横坐标，以活菌数的对数值为纵坐标作出的曲线。依据微生物生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期，生长曲线反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。本试验将磷细菌在蒙金娜有机磷培养液中培养，并通过对菌悬液的波长扫描观察，发现在440nm波长下，菌悬液的吸光值为最高，所以，以比浊法测定培养液的OD₄₄₀值，绘制解磷细菌wpm-03的生长曲线。

从生长曲线可以看出，解磷细菌wpm-03在蒙金娜有机磷液体培养基中，其延滞期为0-12h，指数期为12-30h，在培养36h后进入稳定期，菌体量在108h达到最大值OD₄₄₀为0.723。但在培养0-36h期间，解磷能力并未达到最大值，直到60h后，菌2-6的解磷能力才达到基本稳定，到108h为最大值178.32mg/l。基于此，综合细菌菌体生长及解磷能力大小两因素考虑，各种因素对菌体最大生长量影响研究选取培养到108h时取样测定。

3单因子试验 

利用单因子试验选择出解磷细菌wpm-03适于生长的最佳碳源、氮源以及pH值等生理条件，然后按均匀设计试验方法对影响解磷细菌wpm-03的各种营养与环境条件进行系统测试。采用U₇(7⁶)表中4因素6水平设计的方法来安排培养基优化实验，各种因子及水平如下：

碳源：设6个不同水平：5.0g/L、10.0g/L、15.0g/L、20.0g/L、25.0g/L、30.0g/L。

氮源：设6个不同水平：0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L、1.25g/L、1.5g/L。

pH值：5.0、6.0、7.0、7.5、8.5、9.5。

温度：28～30℃、30～32℃、32～34℃。

结果说明，解磷细菌wpm-03菌体生长和解磷能力的最优组合是：蔗糖为5.00g/l，KNO₃1.50g/l，pH为7.0，温度为28℃，此条件下理论的溶磷值应为197.3547mg/l；各因子对解磷细菌wpm-03的菌体生长和解磷能力影响顺序为：氮源>碳源>温度>pH值。

实施例3解磷细菌wpm-03对柱花草生长和根际酸化的影响

供试土壤采自于中国热带农业科学院品资所基地，采样深度0～20cm，土壤风干后过1mm筛，将过筛后的土壤与同样过1mm筛的河砂以3：1比例混合，再将混合后土壤分成两等份，一份经甲醛灭菌后作为盆栽用土，另一份不灭菌作为土壤处理对照。其主要性状见表4。

表4供试土壤几种主要理化性状

参数	测定值	测定方法
			pH	5.441	SPM-10数字式酸度计测定

 

有机质(g/kg)	1.008	K2Cr2O7容量法-外加热法
			全氮(g/kg)	0.0647	半微量开氏法
碱解氮(mg/kg)	0.05	碱解扩散法
			全磷P2O5(g/kg)	0.034	NaOH熔融提取，钼蓝比色法测定
速效磷(mg/kg)	8.15	0.2N HCl-0.03N NH4F浸提
			全钾K2O(g/kg)	1.492	NaOH熔融提取，火焰光度法测定
速效钾(mg/kg)	44.00	1N硫酸铵提取，火焰光度法测定

按照下列方法进行试验：

(1)土壤灭菌：采用甲醛灭菌法进行灭菌，配制0.1％(占干土重％)的甲醛溶液，即100斤干土，用38％甲醛50毫升。

(2)种子催芽：柱花草种子用80℃热水进行热处理30分钟，去掉瘪粒，撒播在铺有一层滤纸的培养皿中，加适量去离子水，置于30℃培养箱培养48-72小时，待种子发芽，再挑取长度一致的芽苗进行移栽。

(3)配制菌液：取保存的解磷细菌wpm-03，活化12小时后，涂布于有机磷固体培养基上，于28℃培养箱培养24-48小时，待长出菌落后，刮入无菌水中，于旋转器上旋转打散菌落，利用比浊法，通过测定菌悬液DO₄₄₀来进行调制，调至含菌量达到10⁹个/mL。

(4)接种：将正常发芽的柱花草种子放入适量菌悬液中浸泡15分钟，用无菌镊子夹取植入装有灭菌土壤的塑料盆中，每盆种植4株，再沿着各根部加入该菌液1mL，使每株的带菌量达到10⁹个。

(5)试验处理及田间管理：本试验采用完全随机区组设计。

热研二号柱花草、有钩柱花草两种不同基因型柱花草，各设CK(不接菌)、接种解磷细菌wpm-03三种不同菌处理；每个菌处理再各设4个不同的磷水平，用磷酸钙添加，磷单质含量分别为：P₀(不施磷肥)、P₁(0.03g/kg土)、P₂(0.06g/kg土)、 P₃(0.12g/kg土)。每个处理三个重复，整个试验共计144盆。

(6)植物样采集及处理

直接采集柱花草植株带回实验室。分植株用游标卡尺测量株高、主根长，同时记分枝数、开花数；再沿植株茎基部剪下，分地上部分、根部各洗净晾干，称鲜重，放入烘箱中用110℃杀青15分钟，于85℃恒温烘干，取出后称干重，再留出做地上部分和根部的含磷量测定。

(7)土样采集及根际微生物采集

取植物样的同时，用小铲在植物根际(离植株根部0-2cm)取土，以用来测定柱花草根际土壤磷含量、土壤微生物含量等。用作根际微生物的土样采集则是直接取自附在植株根系上的土。

(8)根际酸化程度测定

采用琼脂培养基原位显色法，测定不同处理植株根际的酸化程度。将配制好的琼脂培养基倒入200ml三角瓶中，先倒入50ml，将土培90d的根系洗净后铺在盒中，再倒入100ml，使整个根系被琼脂覆盖，待琼脂凝固后，盖上塑料薄膜，包上黑纸，置于网室中15小时，取出将琼脂熔化，冷却至40℃左右，用酸度计测定pH值。

(9)土壤pH值测定

取10g自然晾干的盆栽根际土壤，加入25ml蒸馏水中，用玻棒搅动3分钟，放置30分钟，待土悬液中土壤沉淀后，利用MA-235数字式酸度计直接测定上清液的pH值。

(10)土壤速效磷测定(0.2N HCl～0.03N NH₄F浸提法)

称取通过1mm筛孔的风干土壤样品5g于100mL三角瓶中，加0.2N HCl～0.03N NH₄F混合浸提液25ml。以橡胶塞塞口，于摇床上摇3～5分钟。用无磷滤纸过滤，吸3mL过滤清液于20mL三角瓶中，加钼蓝混合显色液6mL，摇匀。半小时后，以空白试验溶液为对照用1cm比色杯，在650nm波长下测定溶液的吸光值(A)。标准溶液的显色与测定：吸1.5ppm磷标准溶液5mL于20mL三角瓶中，(三份)加显色溶液量及测定与样品溶液相同，求出平均吸收值(As)。计算1.5ppm磷标准溶液显色后与测定吸收值(As)之比，即1.5/As＝K。结果计算：有效磷(ppm) ＝K×A×5(其中5为水土比25/5)。

(11)植物样品全磷含量测定(H₂SO₄-H₂O₂消煮法)

沿待测植株茎基部剪下，分地上部分、根部烘干后，人工或用粉碎机将植物样研磨至可过1mm筛孔，即作为地上部分及根部样品。

称取样品0.06g于25mL的刻度试管(外径20毫米，长150毫米)中，加入浓H₂SO₄1.5ml。依次将试管插入特制的铝块(长、宽各12.5cm，厚5cm，上有四排孔，每排四孔，共十六孔，孔的直径22毫米，孔深4.5毫米)的孔中，在电炉上加热约1小时(试管口不放漏斗)。待试管中溶液呈棕黑色液体时，取下试管(每次4-5支)于铝质试管架中，冷却1-2分钟后，趁热逐滴加30％H₂O₂4-5滴，每加一滴要摇匀(直接滴入溶液中，勿使其沿试管壁流下)。一般情况下，此时溶液为无色或淡黄色，立即放回原来的铝块孔中继续消煮。10-20分钟后，如仍有黄色，则继续加H₂O₂1-2滴，反复滴加、消煮至无色为止。后再继续消化20分钟，以蒸发掉过多的H₂O₂，依次将试管取出，放入试管架中，冷却，加蒸馏水10-15ml，边加边摇匀，冷至室温，加水至25ml刻度，用塑料塞封口摇匀，即为待测溶液。

后用钼锑抗比色法测定待测溶液在650nm波长下的吸光值，再在磷标准曲线上求出溶液中的可溶性磷含量(方法同于培养液中可溶性磷含量的测定)。

结果表明，无论对于热研二号柱花草还是有钩柱花草，相对于对照组而言，采用本发明解磷细菌wpm-03接种可以显著提高热研二号柱花草和有钩柱花草的根际pH值，在较大程度上缓解了柱花草的根际酸化作用。此外，采用本发明解磷细菌wpm-03接种还显著提高了植物样品中的全磷含量。同时，采用本发明解磷细菌wpm-03接种还有利于促进柱花草植株的生长。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种解磷细菌，其特征在于，其为泛菌属(Pantoea spp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2012017。

2.根据权利要求1所述的解磷细菌，特征在于，其为革兰氏阴性杆菌；菌落呈圆形或椭圆形、表面光滑、凸透、质地松软、不透明、边缘完整、淡黄色；或有菌株呈假根状、边缘为丝状。

3.一种根据权利要求1所述的解磷细菌的分离方法，其特征在于，采集红树林根际土壤，加无菌水制成稀释液，用卵黄平板培养基培养，筛选出溶磷圈最大的若干菌株，继续用蒙金娜液体有机磷培养基在28℃下培养5天，筛选出培养基上清液中可溶性磷含量最高的菌株，得到权利要求1所述的解磷细菌。

4.根据权利要求3所述的分离方法，特征在于，所述卵黄平板培养基为蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

5.根据权利要求3所述的分离方法，特征在于，所述蒙金娜有机磷培养基为葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O0.03g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，卵磷脂1.0g，CaCO₃ 5g，酵母膏0.4g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5。

6.一种根据权利要求1所述的解磷细菌的培养方法，其特征在于，以蔗糖作为碳源，以硝酸钾为氮源，pH值6.5～8.5，温度28～32℃。

7.根据权利要求6所述的培养方法，特征在于，蔗糖为5.0g/l，KNO₃ 1.50g/l，pH为7.0，温度为28℃。

8.一种根据权利要求1所述的解磷细菌在制备生物肥料中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，特征在于，所述应用为用于促进植物生长和/或溶解土壤中有机磷，减轻植物根际酸化。

10.根据权利要求8或9所述的应用，特征在于，所述生物肥料的制备方法如下：取保存权利要求1所述的解磷细菌，活化12小时后，涂布于有机磷固体培养基上，于28℃培养箱培养24-48小时，待长出菌落后，刮入无菌水中，于旋转器上旋转打散菌落，利用比浊法，通过测定菌悬液DO₄₄₀来进行调制，调至含菌量达到10⁹个/mL。