CN104450550A

CN104450550A - 一株产acc脱氨酶活性的植生拉乌尔菌株srpg-4的筛选方法与用途

Info

Publication number: CN104450550A
Application number: CN201410386848.2A
Authority: CN
Inventors: 武占省; 何艳慧; 李春; 凃亮; 樊艳爽
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT; Shihezi University
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT; Shihezi University
Priority date: 2014-08-03
Filing date: 2014-08-03
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明提供一株产1，-氨基环丙烷-羧酸(ACC)脱氨酶活性的植生拉乌尔菌株SRPG-4及筛选方法(富集、初步筛选、再次筛选和鉴定四个步骤)与用途，该菌株经鉴定为植生拉乌尔菌SRPG-4，保藏号：CGMCC No.9392。本发明获得的菌株SRPG-4在ADF培养基中生长良好，其ACC比酶活力高达0.832±0.032U/mg。盐渍化条件下施用SRPG-4菌液对棉花的发芽率、成苗率及生物量的积累都有明显的提高作用，并且可以调节生长素(IAA)的产生量，缓解乙烯(Eth)和细胞分裂素(ABA)的产生，从而缓解盐胁迫。本发明筛选的菌株来源于西北干旱地区，对环境适应能力强，应用效果稳定等优点，因此，利用该菌株开发微生物菌剂，对解决土壤盐渍化问题具有广阔的应用前景。

Description

一株产ACC脱氨酶活性的植生拉乌尔菌株SRPG-4的筛选方法与用途

技术领域

本发明属于农业生物技术领域。更具体的，本发明涉及一株产ACC脱氨酶活性的植生拉乌尔菌株SRPG-4的筛选方法与用途及该菌株的解盐促生作用，该菌株已于2014年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9392，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

背景技术

西北地区是中国最大的棉花生产区和优质商品棉基地，但是为了解决在干旱半干旱地区棉花栽培长期采用膜下滴灌栽培模式所引起的土壤次生盐碱化造成作物缺苗、断垄、产量下降，严重制约了新疆棉花生产与农业经济发展。随着生活水平的提高，人们对有毒化学品造成农副产品污染所导致的直接或间接的危险和潜在的危害越来越重视，因此化学药剂与当今绿色、有机农业发展需求不一致。生物法避免化学农药造成的弊端，且安全、有效、持久，称为世界研究的主题。

近年来研究表明，植物根际有益微生物可以促进作物的生长发育，提高产量，更可以帮助作物耐受一些逆境条件。因此，利用植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)开发可帮助作物提高对盐渍化等逆境的耐受性，并具有良好促生作用的微生物肥料已日益受到人们的关注，是一个重要的发展方向。

以色列希伯来大学的Mayaka S等人在以色列南部Arava地区的干旱盐渍化土壤中分离出7株具有ACC脱氨酶活性的根际微生物(Mayaka S，Tirosh T，Glick BR.Plant growth-promoting bacteria that confer resistance to water stress in tomatoes and peppers[J].Plant Science 2004，166：525-530)，DNA分析表明是无色细菌。这些微生物能够增强番茄耐盐胁迫的能力，显著提高番茄幼苗在高盐环境中(172mM NaCl)的生长量，但其作用机制可能与其具有的减少幼苗在盐胁迫下的乙烯释放量、增加土壤溶液中钾离子与磷酸根离子的离子浓度、提高水分有效利用率、减轻盐胁迫的光合抑制作用等相关。另外，加拿大学者Glick BR等对具有ACC脱氨酶活性的PGPR进行研究，认为这类PGPR能水解植物体内生物合成乙烯的直接前体ACC，产生羟基丁酸和氨，阻止乙烯的释放。当PGPR附着在种子表皮时，它能水解ACC，降低种子内的乙烯水平，从而促进根伸长解除盐渍化对植物的胁迫。但他也承认，此类PGPR帮助植物减轻盐胁迫的作用机理还包括有其它的一些途径，如对植物内源ABA的调控等(Glick BR，Penrose DM，Li J.A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth-promoting bacteria[J].Journal of theoretical biology，1998，190：63-68)。2012年乌兹别克斯坦Dilfuza E课题组研究报道，筛选获得的绿针假单胞菌TSAU13在盐渍化土壤中能够促进黄瓜和番茄的生长和提高果实产量，该菌株能够在植物根际存活2个月(Dilfuza.E，Gisela H.Effect of plant growth-promoting bacteria on growth and nutrient uptake of cotton and pea in a semi-arid region of Uzbekistan[J].Journal of Arid Environments，2004，56：293-301)。印度Saravanakumar等人研究表明具有ACC脱氨酶活性的荧光假单胞菌TDK1能够显著提高花生的耐盐性并增加了花生的产量(Saravanakumar D，Samiyappan R.ACC deaminase from Pseudomonas fluorescens mediated saline resistance in groundnut(Arachis hypogea)plants[J].Journal of applied microbiology.2007，102：1283-1292.)。另外PGPR也可以通过调控一些植物内源激素，如生长素、乙烯和细胞分离素来促进作物生长(Raupach GS，Kolepper JW.Mixtures of plant growth-promoting rhizobacteria enhance biological control of multiple Cucumber pathogens[J].Phtopathology，1998，88：1158-1164)，从而缓解盐胁迫，达到促生的效果。

西北地区有着独特的地理、气候特征，孕育着独特而丰富的微生物资源，基于PGPR提高作物耐盐抗逆性的巨大应用潜力。选择可以高效促进植物生长，开发适宜于西北地区特殊地理气候条件的专属菌种，不但可以丰富生物种质资源，还会为研制菌肥提供物质基础，同时降低化学肥料的使用量，提高化学肥料的使用率，提高植物抗逆性。然而，目前还未见报道一种快捷、可操作的具有解盐促生特性菌株的筛选方法。本专利从植物——PGPR——盐渍化逆境三者间的相互作用关系入手，从新疆不同盐渍化区域土壤中采集土样，发明一种分离筛选具有ACC脱氨酶活性的PGPR的方法及解盐促生菌株的用途。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够缓解盐胁迫促进作物生长的功能菌株的筛选方法及用途，为开发提高盐渍化耕地土壤中的作物产量和品质的微生物菌剂提供技术保障。

本发明更具体的是提供一种产ACC脱氨酶活性的植生拉乌尔菌株SRPG-4的筛选方法。

本发明所述的SRPG-4菌为植生拉乌尔菌。其特点在于该菌株以ACC为唯一氮源的条件下能正常生长，与无盐条件相比，该菌株在盐渍化环境条件下能够更明显的提高作物的发芽率、成苗率和促进作物生物量积累的作用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种具有ACC脱氨酶活性菌株，其筛选过程如下：

本发明所述的植生拉乌尔菌株SRPG-4菌株分离自盐渍化严重的棉田中生长较好的棉花根围，利用初筛培养基DF和ADF培养基富集到具有ACC脱氨酶活性的菌株，再以珍珠岩为种植基质做ACC脱氨酶活性菌株的初步筛选，最后以天然盐渍化土为种植基质做ACC脱氨酶活性菌株的再次筛选获得产ACC脱氨酶活性的SRPG-4，经形态学、生理生化和16Sr DNA鉴定，并与数据库中已知菌株相应序列信息比较，其与菌株R.planticola ACTT 33531的相似度为99％，确定为植生拉乌尔菌。根据菌株SRPG-4的解盐促生特性，又在盐胁迫条件下接种植生拉乌尔菌SRPG-4，测定对棉花生物量的影响。结果表明SRPG-4菌株对盐渍化土壤中棉花的发芽率、干重、鲜重和株高都有明显的提高作用，进一步说明该菌株具有缓解盐胁迫和促进作物生长的功效。可用于制备农业生物肥菌剂，具有生产工艺简单、周期短、产品成本低及环境友好等特点，具有较好开发应用前景。

本发明的棉花田间使用方法具体如下：

将适量作物种子在菌悬液中浸泡接种4小时，或者播种后结合滴灌应用。

本发明所具有的优点：

利用本发明筛选的解盐促生菌株植生拉乌尔菌株SRPG-4(CGMCC No.9392)，在盐胁迫条件下能够提高作物种子的发芽率29.5％、成株率61.6％，并提高作物鲜重33.7％、干重33.3％、株高15.0％。该菌株促生应用效果稳定，环境适应性强，可作为生物制剂使用，不仅可以减少化学肥料的用量，还可以节省农民开支，增加经济收入，还具有良好的生态效益和社会效益。

附图说明：

图1菌株SRPG-4在DF和ADF培养基中的生长曲线

图2不同盐浓度对菌株SRPG-4生长的影响

图3菌株SRPG-4对棉花幼苗中三种激素含量的影响

具体实施方式

下面通过具体实施例对发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：具有ACC脱氨酶菌株的筛选和鉴定

1、DF液体培养基：

组分一：H₃BO₃ 10mg，MnSO₄·H₂O 11.19mg，ZnSO₄·7H₂O 124.6mg，CuSO₄·5H₂O 78.22mg，MoO₃ 10mg以上溶解于100mL灭菌蒸馏水中，-4℃保存；

组分二：FeSO₄·7H₂O(100mg)溶于10ml灭菌蒸馏水中，-4℃保存；

将上述组分一与组分二溶液各取0.1mL，再加入KH₂PO₄ 4.0g，Na₂HPO₄ 6.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖2.0g，葡糖酸2.0g，柠檬酸2.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，H₂O 1000ml。

2、ADF培养基：

将DF液体培养基中所含(NH₄)₂SO₄替换成ACC，ACC不可高温灭菌，使用时先将ACC配成0.5M浓度的母液，通过0.2μm的细菌滤器灭菌，将母液按6mL/L的量添加入经高温灭菌冷却后的DF液体培养基(无(NH₄)₂SO₄)。母液于-20℃保存。

3、DF固体培养基：

在DF液体培养基添加的Bacto-Agar，添加浓度为1.8％。

4、ADF固体平板：

将不添加(NH₄)₂SO₄的DF固体培养基灭菌处理后倒在标准尺寸培养皿中，在超净台上冷却凝固后，每皿以30μmol的量涂布ACC溶液。

DF是以(NH₄)₂SO₄为唯一氮源的基本培养基，ADF是用ACC替换DF培养基中(NH₄)₂SO₄为唯一氮源的培养基。

5、NA培养基(g·L^-1蒸馏水)：

牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，水1000mL，NaOH溶液调pH：7.0-7.2。

6、筛选过程：

第一步：采样

从新疆主要种植区典型盐渍化耕地中采集作物根际土样。

第二步：富集

把采集的土样各称取1g，分别放入盛有50mL灭菌水的三角瓶(容量为150mL)加入适量灭菌玻璃珠，于200rpm下振荡30min，待成悬浊液后取下，静置30min，分别吸取1mL上清液加入盛有50mlNA-土壤浸提液复合培养液的150mL三角瓶中，于30℃、200rpm条件下培养过夜。从上述培养液中，分别转移1mL，悬浮液至另一50mL NA-土壤浸提液复合培养液的150mL三角瓶中于30℃、200rpm条件下继续振荡培养过夜。从第二步培养液中，再分别转移1mL悬浮液至50mLDF培养液中，30℃、200rpm培养过夜。最后转移同样体积(1mL)的悬浮液至ADF培养液中，进行ACC脱氨酶活性菌株筛选(30℃、200rpm培养过夜)。从各ADF培养液中，分别吸取250μL菌液，涂布于ADF固体培养基上，在30℃下，培养72h。

从ADF平板挑取单菌落，(为避免重复筛选，观察比较菌落形态，每样本挑取大致相同的2～3个单菌落)。所筛选菌株再次接种于DF和ADF培养液中，在600nm处测光密度，绘制各菌株生长曲线，以反复验证各菌株利用ACC为唯一氮源生长的特性，重复2次，操作中凡涉及ACC为唯一氮源的步骤都应严格避免其他氮源的污染，各种器皿均需经洗液浸泡过夜，双蒸水洗净。将最终确定具有ACC脱氨酶活性的菌株在NA平板上划线分纯。30℃下培养48h后，挑取单菌落接种于NA斜面上培养48h，待长出菌苔后在4℃冰柜保存。此即为具有ACC脱氨酶活性的菌株SRPG-4。菌落形态几乎是透明、乳白色、针尖状小圆点。

第三步：初筛

将上轮筛选得到的具有ACC脱氨酶活性的菌株接种于盛有100mlNA培养液的250mL三角瓶中，在200rpm、30℃下摇培48h。摇培结束后，于8000rpm下将发酵液离心10min，弃上清，富集菌体。并用灭菌蒸馏水重悬菌体，用分光光度计调校各菌悬液的OD值，使其保持基本一致。

将珍珠岩于180℃下干热灭菌6-8小时，冷却后以每发芽盒35g的量分装，发芽盒提前用75％酒精擦拭，并在紫外灯下照射10min。

挑选饱满、大小一致的棉种，用70％的酒精消毒5min，再用0.1％升汞溶液对棉种浸泡消毒10min，用灭菌蒸馏水冲洗3次。之后将适量棉种子在菌悬液中浸泡接种4个小时。对照棉种子浸于灭菌蒸馏水中。浸好的棉种用吸水纸吸去表面水分后，以30粒/盒的量均匀播种于发芽盒中。设不加盐对照(CK-NS)、和加盐对照(CK-S)。每个菌株的处理棉种同样设不加盐处理(-NS)和加盐处理(-S)。处理和对照均设6个重复。种好后，不加盐对照和处理利用Hoagland营养液浇灌，加盐对照和处理利用含0.8％NaCl的Hoagland营养液浇灌。并在第三天对各个加菌处理补浇50ml菌液(10⁵)。将发芽盒置于人工智能气候箱中培养(光强：300μmol·m^-2·s^-1；光照：14h·d^-1；昼夜温度：30℃/25℃，相对湿度：40％)。于第10天统计发芽率，选择处理后发芽率显著高于对照的菌株进行下一轮天然盐渍化土的盆栽试验。

第四步：复筛

菌悬液的制备和棉种处理同初筛。

盆栽试验设计：设置棉种接菌和不接菌两个处理，在不接菌处理中设置盐渍化土壤和正常土壤两个对照，每个处理8个重复，将菌株处理的种子每10粒播入装有无菌土(把从田间采来的盐渍化土与正常土在160℃干热灭菌8h)的10cm×10cm的盆钵中，播种深度2cm左右，置于温室中培养(光强：280μmol·m^-2·s^-1；光照：24h·d^-1；昼夜温度：28℃/25℃，相对湿度：40％)，每天浇水一次，水量控制一致。从第8天开始统计发芽率，连续记录30天。对发芽率显著高于对照的筛选菌株进行鉴定。

第五步：鉴定

对解盐促生菌SRPG-4进行生理生化特性的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平确定解盐促生菌的种属。

鉴定结果见表1。

表1 菌株SRPG-4的生理生化特性

+：阳性；-：阴性

16S rDNA鉴定

测序获得的SRPG-4的16S rDNA序列片段大小分别为1456bp，在NCBI网站进行序列同源性比对分析，结合生理生化特征的鉴定结果，该菌株SRPG-4形态学、生理生化特征符合拉乌尔菌株属(Raoultella)特征，且最接近R.planticola ACTT 33531菌，且序列分析表明，菌株R.planticola SRPG-4与R.planticola ACTT 33531同源性在99％以上。由此鉴定，菌株为植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)。

实施例2：R.planticola SRPG-4的培养特性

从ADF平板挑取单菌落，所筛选菌株再次接种于DF和ADF培养液中，在600nm处测光密度，绘制各菌株生长曲线。

图1显示菌株SRPG-4在DF和ADF培养基中均能正常地生长，在同一时间内SRPG-4在ADF培养基细胞密度比在DF培养基低一些，但生长的趋势基本相同，同样说明菌株SRPG-4能够很好的利用ACC为营养物质而进行生长。

实施例3：R.planticola SRPG-4的耐盐性试验

采用摇瓶培养生长曲线法，设置不同的NaCl浓度(0.5％、1.0％、2.0％、4.0％、6.0％和8.0％)测定了SRPG-4菌株的耐盐特性，由图3所示，结果表明SRPG-4在盐浓度不超过4.0％时，进入平稳期的时间较为一致，表明菌株SRPG-4有很好的耐受性，只是盐浓度超过2％时，菌体生物量较低。SRPG-4在盐浓度为6.0％时生长变得非常缓慢，而且菌体浓度也很低，24h之后才进入平稳期。当盐浓度在8.0％时候，菌体几乎停止生长。表明菌株SRPG-4在土壤含盐量不超过2.0％，不会影响菌株的存活。因为，能够进行作物生长的次生盐渍化土壤或盐渍化土壤的含盐量一般都在1.0％之内，因此，该菌株在盐渍化土壤中应用不会受到盐分的影响，具有潜在的实际应用价值。

实施例4：盐胁迫条件下接种植生拉乌尔菌株SRPG-4对棉花生物量的测定

用菌处理棉种，待盐渍化土盆栽试验中棉花长至三叶期时，测量同一处理的所有植株从生长点到根尖的长度即株高，取平均值，即为此处理植株的平均株高。称量同一处理的所有植株的总重量，然后把其置于干燥箱中，110℃下杀青10min，再转入80℃下烘24h至恒重，取出称重。烘干前的总重量除以称量株数，即得此处理植株的平均鲜重。烘干后的总重量除以称量株数，即得此处理植株的平均干重。盆栽棉花的生长情况见表2。

表2 SRPG-4对棉花种子发芽率及棉花生物量的影响作用

注：CK-NS，无菌无盐处理；SRPG-4-NS，SRPG-4菌株无盐处理；CK-S，无菌0.8％盐处理；SRPG-4-S，SRPG-70菌株0.8％盐处理。同列数据后标不同小写字母这表示在5％水平上差异显著(p＜0.05)。

0.8％NaCl对棉花具有很强的胁迫作用，棉种接种SRPG-4菌株后，SRPG-4-S较CK-S发芽率提高29.5％，成株率提高61.6％。对SRPG-4菌株对棉花生物量积累的影响研究表明，SRPG-4菌株具有较强的解盐促生效果，在盐渍化条件下，SRPG-4对棉花的鲜重提高了33.7％，干重提高了33.3％；株高提高了15.0％。在没有盐胁迫时，棉种接种SRPG-4菌株后，发芽率和成株率没有显著提高，但是SRPG-4对棉花的鲜重提高了8.9％，干重提高了18.6％，株高的提高了13.7％。可以看出SRPG-4在盐渍化环境条件下对棉花生长表现出更明显的促进作用。结果表明SRPG-4菌株对盐渍化土壤中棉花的发芽率、干重、鲜重和株高都有明显的提高作用。

实施例5：盐渍化土壤中接种植生拉乌尔菌株SRPG-4对棉花发芽率的影响

对最终筛选得到的解盐促生细菌(SRPG-4)的实际应用功效进行了田间试验，于2011年在北疆农六师新湖农场进行了田间试验。田间试验结果表明，该菌株可以提高棉花在盐渍化土壤中的发芽率(表3)。SRPG-4对棉花的出苗率有着显著的提高作用，与对照相比，在各个观察点都有明显的提高，此结果与盆栽实验结果相一致。因此，具有较大的潜力开发成商业化的活菌解盐促生菌剂，便于大面积推广应用。

表3 盐渍化耕地中田间试验SRPG-4对棉花的出苗影响

注：CK：无菌处理，SRPG-4：SRPG-4菌株处理。同列数据后标不同小写字母这表示在5％水平上差异显著(p＜0.05)

实施例6：SRPG-4对棉花植株的生长素(IAA)、乙烯(Eth)和细胞分裂素(ABA)含量的影响

考察盐胁迫条件下不同处理中棉花植株的不同激素含量的变化结果如图3所示，CK-S处理的棉花植株的IAA含量在96h时显著降低了41.5％，而接种SRPG-4的棉花植株的IAA含量在同一时间仅下降了16.6％；在CK-S对照组中的棉花植株乙烯的生产量显著增加，96小时内由0.994nmol/gFW×h增加到1.669nmol/gFW×h，而在盐胁迫条件下接种SRPG-4处理组(SRPG-4-S)中棉花产生的乙烯的含量从0.799nmol/gFW×h仅增加到1.151nmol/gFW×hnmol(图3-b)，在不同时间下对应值均比对照组(CK-S)的低；CK-S和SRPG-4-S处理中的棉花植株的ABA含量随着时间的延长表现出明显增加的趋势，在96小时内CK-S处理中棉花植株脱落酸含量增加了两倍，由190.65ng/gFW增加到391.37ng/gFW，与此相反，在初始和96h的时候，接种SRPG-4的棉花植株中ABA含量分别为176.64ng/gFW和326.28ng/gFW，并且显著低于CK-S的对应值(图3-c)。所以SRPG-4菌株可以调节IAA的产生量，缓解Eth和ABA的产生，从而缓解盐胁迫。

Claims

1.一株产-氨基环丙烷-羧酸(ACC)脱氨酶活性的植生拉乌尔菌株(Raoultella planticola)SRPG-4菌株，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年6月30日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.9392。

2.一种如权利要求1所述菌的筛选方法，包括以下步骤：

富集：用DF和ADF培养基富集到具有ACC脱氨酶活性的菌株，菌株SRPG-4的ACC脱氨酶比酶活力达到0.832±0.032U/mg；

初筛：以珍珠岩为盆栽基质进行模拟盐渍化条件进行产ACC脱氨酶活性菌株的解盐促生特性的初步筛选；

复筛：以天然盐渍化土壤为种植基质进行产ACC脱氨酶活性菌株的解盐促生特性的再次筛选；

鉴定保藏：筛选的菌株经鉴定为植生拉乌尔菌SRPG-4，保藏号：CGMCC No.9392。

3.权利要求1所述菌株，其特征在于在以ACC为唯一氮源的条件下能够很好的生长，菌落形态几乎是透明、乳白色、针尖状小圆点，并且可以在含盐量8％NaCl的培养基中生长。

4.权利要求1所述菌株的特征，该菌株在盐胁迫条件下能够提高作物种子的发芽率29.5％、成株率61.6％和促进作物提高鲜重33.7％、干重33.3％、株高15.0％。

5.权利要求1所述菌株，该菌株在盐胁迫条件下可以通过调节作物植株对生长素IAA产生量的增加，从而缓解了由于盐胁迫而造成植株中IAA含量的不断降低。

6.权利要求1所述菌株，该菌株可以在盐胁迫条件下通过ACC产生的代谢而降低乙烯含量的产生，从而减轻了盐胁迫下乙烯对作物生长所造成的危害。

7.权利要求1所述菌株，该菌株可以在盐胁迫条件下有效缓解作物内源IAA含量的较快的下降，从而控制内源乙烯和ABA量在作物植株中产生。

8.如上述权利要求2所述的筛选菌株的盐渍化条件为含盐量0.3-1.0％，目标作物为棉花、加工番茄、辣椒中的一种。