CN104531546A - 一种恶臭假单胞菌株srpg-396及其解盐促生应用 - Google Patents

一种恶臭假单胞菌株srpg-396及其解盐促生应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种恶臭假单胞菌株SRPG-396及其解盐促生应用，属于农业生物技术领域。所述菌株保藏号为CGMCC No.9397。该菌株具有溶解无机磷、分泌植物生长素和嗜铁素功能，能够提高作物对氮、磷、钾、钙、铁等元素的吸收，降低对钠的吸收，本身具有良好的耐盐性，可以有效缓解盐渍化土壤对作物造成的盐胁迫危害并促进盐胁迫下作物的生长。与对照相比，能显著提高棉花、番茄和辣椒等作物在盐胁迫下的发芽率、干重及株高。本发明所述菌株具有功能稳定、环境适应性强、生态环境友好等优点，可制备成微生物菌剂及生物肥料等产品，有非常大的工业化商品的开发潜力，具有良好的应用前景。

Description

一种恶臭假单胞菌株SRPG-396及其解盐促生应用
技术领域：
本发明涉及一株具有解盐促生作用的恶臭假单胞菌及其在缓解盐渍化土壤对作物造成的盐胁迫危害并促进作物苗期生长方面的应用，属于农业生物技术领域。
背景技术：
我国西北地区地处干旱半干旱区域，缺水成为制约其农业发展的瓶颈，而目前当地结合自身干旱地区特点将先进的滴灌技术与覆膜种植模式有机结合起来形成高效节水技术——膜下滴灌，从根本上改变了传统的农业结构，极大地促进了农业生产的发展。但是同时也造成耕作层中的土壤盐分得不到充分的淋洗，随着蒸发不断上移，使盐分在耕作层日益积累，造成土壤盐渍化现象严重。土壤盐渍化通过改变土壤环境来影响植物的生长，造成植物缺苗和死亡现象，成为限制作物产量的主要因素和农业可持续发展的主要障碍。目前相关农业方面的研究已为我们提供了一些应对措施，例如可以通过培育抗逆性强的植物品种、改良盐碱土壤或者改进栽培措施等来应对次生盐渍化危害。然而，这些措施往往存在周期长，投入大，见效慢等问题，对解决盐渍化土壤问题还远远不够。
近年来研究表明，根际有益微生物可以促进作物的生长发育，提高产量，更可帮助作物耐受一些逆境条件。国内对植物根际促生菌(PGPR)在提高植物抗逆特性方面近几年才开始研究，姚拓、张德罡等对盐碱地小麦和高寒地燕麦根际联合固氮菌的分离、特性及其对小麦和燕麦生长发育有较成熟的研究(姚拓，龙瑞军，王刚，胡自治，兰州地区盐碱地小麦根际联合固氮菌分离及部分特性研究[J]，土壤学报，2004(3)：444-448；李风霞，张德罡，高寒地燕麦和盐碱地小麦PGPR菌的生长特性与促生性，甘肃农业大学硕士学位论文，2004.5)。国外对PGPR菌的研究较多，主要在研究与开发植物促生菌剂技术，减少化肥使用，提高化肥利用率，促进土壤中无效营养有效化，提高作物对逆境的耐受性和适应性。目前研究较多的菌属有固氮螺菌、根瘤菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌等。Bacilio M等研究生脂固氮螺菌ngfp15能够在NaCl胁迫下在非土培的小麦根际定殖，并促进小麦的生长和生物量的积累，缓解盐胁迫对小麦造成的伤害(Bacilio M,Rodriguez H,Moreno M,Hemandez JP.Mitigation of salt stressin wheat seedling by a gfp-tagged Azospirillum lipoferum[J].Biol Fertil Soils.2004,40:188-193)。Saima等发现100mM NaCl胁迫环境中，用从不同作物根系分离得到的多个菌株接种小麦能明显提高小麦植株体内蛋白和生长素含量(Saima M,Shazia A,Shahida H.Plantgrowth-promoting bacteria that confer resistance to salt stress[J].Pakistan J Biol Sci.2002,5(6):643-647)。Dilfuza等从乌兹别克斯坦的干旱贫瘠地区的棉花、小麦、番茄、瓜和紫花苜蓿的根系分离得到产碱假单胞菌PsAl5，多粘芽孢杆菌BcP26和分支杆菌属MbPl8，这些菌株能够显著提高贫瘠土壤中生长的棉花和豌豆的生物量，使植株体内的N、P、K元素含量有明显提高，且这些菌株能够分泌植物激素并具有固氮酶活性(Dueikovsky AN,Morduldmva E A,Kochetkov V,et a1.Growth promotion of black currant softwood outings by recombinant strainpseudomona fluorescens BSP53a synthesizing an increased amount of indole-3-acetic acid[J].Soi1Biol.Biochem,1993,25:1277－1281)。然而，针对西北地区的特殊的气候和地理环境，目前还没有报道适合干旱半干旱地区应用的具有高效的解盐促生功能菌株及其潜在微生物菌剂的开发。
利用微生物资源来改善盐渍化土壤问题，具有投入小、效果好、周期短、环境兼容性好等优点，因此筛选适宜于新疆特殊地理气候条件并对植物有良好的缓解盐胁迫促进作物生长的植物根际促生菌，对于应对目前土壤盐渍化现象具有重要的实用价值，开发的解盐促生菌剂将具有广阔的产业化前景。
发明内容：
本发明的目的是提供一种适宜于新疆特殊地理气候条件，特别是可以很好地缓解盐渍化土壤对作物造成的盐胁迫的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida SRPG-396及其应用。
本发明所述的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida SRPG-396，于2014年6月30日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCC No.9397。
本发明所涉及的SRPG-396菌株的菌体特征和菌落特征：菌体呈短杆状，于牛肉膏蛋白胨平板生长时为圆形、凸起、表面较为光滑的淡黄色菌落，产黄绿荧光色素，氧化酶、接触酶阳性，发酵葡萄糖、木糖产酸产气，能利用多种碳源。
本发明所述的菌株其特点在于能够明显缓解盐碱土壤对以棉花为主的经济作物造成的盐胁迫，特别是能通过分泌有机酸溶磷、分泌生长素和嗜铁素来促进棉花在盐胁迫下的生长，并能够提高盐胁迫环境下作物对氮、磷、钾、钙、铁等元素的吸收，降低对钠的吸收。
本发明的另一个目的是提供一种具有解盐促生功效的生物菌剂，其活性成分是恶臭假单胞菌Pseudomonas putida SRPG-396。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
解盐促生菌的筛选过程如下：
本发明所述的恶臭假单胞菌SRPG-396分离自新疆盐碱地及长期滴灌造成的盐渍化耕地的棉花根际土壤。首先以沙土为种植基质利用沙床发芽试验进行具有解盐促生功效菌株的初筛，再以天然盐碱土壤为种植基质进行解盐促生菌的再次筛选，最后通过对不同作物的促生实验筛选得到可以有效缓解作物在盐渍化土壤中的盐胁迫危害，并促进作物苗期生长发育的解盐促生菌恶臭假单胞菌SRPG-396。
本发明所述菌剂经如下步骤得到：
将上述解盐促生菌SRPG-396接种在NA固体培养基上进行活化后，转接于100mLNA培养液中30℃下180rpm培养24h，获得种子液。将种子液以1:100比例接种于发酵培养基中，30℃，200rpm培养48h。用灭菌水稀释制成活菌总浓度为1×108--1×1010cfu/mL的菌剂。
NA(营养琼脂)培养基组分：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，pH7.2。
发酵培养基组分：豆粕粉10g/L、玉米粉10g/L、氯化钠10g/L，牛肉膏2g/L，蛋白胨3g/L，葡萄糖3g/L，pH 7.0-7.2。
本发明的有益效果：：
针对新疆目前盐渍化现象严重没有较为有效的应对措施，本发明创新性地提供了一种可有效缓解盐渍化土壤对作物造成的盐胁迫危害，并促进其苗期生长的恶臭假单胞菌株Pseudomonas putida SRPG-396，该菌剂应用效果稳定，适应性强。使棉花在盐胁迫下的发芽率、干重、株高分别提高了36.2％、31.1％、14.6％。应用于番茄和辣椒时使其发芽率分别提高43.4％、41.43％，同时明显促进其苗期生物量积累。该菌可作为生物制剂使用，不仅可以减少化学肥料的用量，还可以节省农民开支，增加经济收入，还具有良好的生态效益和社会效益。
附图说明
图1菌株SRPG-396连续培养96h发酵液中IAA的含量
图2菌株SRPG-396在KB培养基上产荧光色素
图3菌株SRPG-396单细胞形态观察
图4菌株SRPG-396溶解无机磷性能
图5菌株SRPG-396在CAS平板上产嗜铁素
图6菌株SRPG-396的耐盐性
具体实施方式：
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1菌株的分离纯化
从新疆盐碱地及长期滴灌造成的盐渍化耕地的棉花根际土壤采集土样，称取土样10g，放入100ml无菌水中，加入灭菌的玻璃珠，200rpm，30℃，震荡20min，使样品充分分散。无菌操作吸取上清液100μl加入900μl无菌水中，用无菌水稀释制成10-2--10-8浓度的稀释液。取100μl的各浓度稀释液，采用常规涂布法在NA平板上涂布，放置于30℃恒温培养箱内培养。48小时后，待平板上长出菌落后，挑取平板上的单菌落进行纯化培养，获得菌株SRPG-396。
实施例2解盐促生菌株SRPG-396的筛选
(1)初筛
菌悬液的制备：菌株分别接种于液体NA培养基中，经30℃下200rpm转速摇培2天后，制成108cfu/ml浓度的菌悬液备用。
实验处理：挑选饱满、大小一致的棉种，75％的酒精消毒15s，然后用0.1％的升汞浸泡20min，无菌水清洗3次后于菌悬液中浸泡4h，之后将棉种播种于装有沙土的穴盘内，沙土预先用0.5％的氯化钠溶液调整含水量至14％，5粒棉种为一个重复，每个处理四个重复。置于人工智能气候箱中培养。(昼夜温度：30℃/25℃)。
表1 解盐促生菌初筛砂床发芽实验
处理 CK SRPG-396
发芽率(％) 64.2 87.5
测定结果表明，接种解盐促生菌株SRPG-396后，盐胁迫下棉花发芽初期的发芽率提高了36.3％。
(2)盆栽实验复筛解盐促生特性
菌悬液的制备如(1)所述。
盆栽实验设计：设计棉种接菌和不接菌两个处理，对照种子浸于灭菌蒸馏水中。在不接菌处理中设置盐碱土壤和正常土壤两个对照，每个处理8个重复，将菌株处理的种子每20粒播入装有无菌土的10cm×10cm的盆钵中，播种深度3cm，置于人工气候室中培养，每天浇一次水，浇水量控制一致。每天统计发芽率。测定结果表明，解盐促生菌株SRPG-396对棉花发芽期不同阶段的发芽率均有明显提高。
表2 解盐促生菌复筛盆栽发芽试验(发芽率％)
天数 4 5 6 9
CK 27.5 33.7 35 43
SRPG-396 58.8 68.8 72.5 80
实施例3解盐促生菌株SRPG-396的鉴定特征
根据菌体形态特征、菌落形态特征及革兰氏染色结果，结合《伯杰细菌鉴定手册》(Bergey’s Manual of Etermitive Bacteriology)第八版和《常见细菌鉴定手册》对解盐促生菌SRPG-396进行生理生化特性的鉴定。结果如表3所示，经初步鉴定，菌株SRPG-396为假单胞(Pseudomonas.sp)菌属。
表3 菌株SRPG-396的生理生化特性
试验项目 结果 试验项目 结果
菌落形状 圆形凸起 产气 +
菌体形状 短杆状至圆形 葡萄糖 +
革兰氏 － 葡萄糖产酸 +
黄绿荧光色素 + 木糖 +
接触酶 + 丙三醇 +
苯丙氨酸脱氨酶 － 乙醇 +
氧化酶 + 柠檬酸盐 +
甲基红 － 酒石酸盐 －
VP实验 + 吲哚实验 +
淀粉水解 － 明胶液化 +
乳糖反应 － 4℃生长 +
蔗糖反应 + 39℃生长 +
KNO3还原 + 41℃生长 －
注：+：阳性；－：阴性
菌株SRPG-396的16S rDNA鉴定
将菌株SRPG-396的16SrDNA进行测序，测序获得的SRPG-396的16S rDNA序列片段大小为1479bp，到GenBank数据库上进行比对，其16S rDNA的序列与恶臭假单胞菌Pseudomonas putida相似度达到100％，结合生理生化特征的鉴定结果，该菌株被鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
实施例4Pseudomonas putida SRPG-396对棉花的解盐促生应用效果
菌悬液的制备和棉种处理同实施例1
盆栽试验设计：设置棉种接菌和不接菌两个处理，在不接菌处理中设置不加盐(-NS)、和加盐(-S)两个对照，不加盐对照和处理利用Hoagland营养液浇灌，加盐对照和处理利用含0.8％NaCl的Hoagland营养液浇灌。每个处理8个重复，将菌株处理的种子每10粒播入装有无菌土的10cm×10cm的盆钵中，播种深度2cm左右，置于温室中培养(光强：280μmol·m-2·s-1；光照：24h·d-1；昼夜温度：28℃/25℃；相对湿度：40％)，每天浇水一次，水量控制一致。待盐碱土盆栽实验中棉花长至三叶期时，测量同一处理的所有植株从生长点到根尖的长度即株高，取平均值，即为此处理植株的平均株高。称量同一处理的所有植株的总重量，然后把其置于干燥箱中，110℃下杀青10min，再转入80℃下烘24h至恒重，取出称重。烘干前的总重量除以称量株数，即得此处理植株的平均鲜重。烘干后的总重量除以称量株数，即得此处理植株的平均干重。
表4 解盐促生菌对棉花的促生实验
处理 平均干重(g/plant) 平均鲜重(g/plant) 平均株高(cm/plant)
CK-NS 0.161±0.01c 1.25±0.18b 17.30±1.23c
SRPG-396-NS 0.189±0.03a 1.34±0.09a 19.45±1.53a
CK-S 0.09±0.02e 0.89±0.12d 16.03±1.41d
SRPG-396-S 0.118±0.03d 1.19±0.13c 18.38±1.30b
注：NS为不加盐处理，S为加盐处理；字母表示不同的显著性水平，p＜0.05
测定结果表明，棉种接种Pseudomonas putida SRPG-396后，在盐胁迫条件下出苗率和成株率得到显著提高，棉花干重、湿重和株高分别提高了31.1％、33.7％、14.6％。
实施例5Pseudomonas putida SRPG-396对番茄的解盐促生应用效果
实验设计与实施同实施例4，实验所用种子为番茄种子。具体结果见表5。
表5 解盐促生菌对番茄的促生实验
注：NS为不加盐处理，S为加盐处理；字母表示不同的显著性水平，p＜0.05
测定结果表明，在没有盐胁迫时，接种SRPG-396菌株后，对番茄发芽及苗期生长没有显著提高，但是在盐渍化条件下SRPG-396对番茄生长表现出更明显的促进作用。番茄种子接种SRPG-396菌株后，SRPG-396-S较CK-S发芽率提高43.4％，成株率提高59.95％。对生物量积累的影响研究表明，SRPG-396菌株在盐渍化条件下，使鲜重、干重和株高分别提高了27.8％、37.5％、26.17％。
实施例6Pseudomonas putida SRPG-396对辣椒的解盐促生应用效果
实验设计与实施同实施例4，实验所用种子为辣椒种子。具体结果见表6。
表6 解盐促生菌对辣椒的促生实验
注：NS为不加盐处理，S为加盐处理；字母表示不同的显著性水平，p＜0.05
测定结果表明，辣椒种子接种SRPG-396菌株后，盐渍化条件下发芽率提高41.43％，成株率提高41.6％。对生物量积累的影响研究表明，SRPG-396菌株在盐渍化条件下，使鲜重提高了34.25％，干重提高了50％，株高提高了38.73％。
实施例7Pseudomonas putida SRPG-396生物菌剂的制备
(1)种子液的制备
将菌株SRPG-396接种在NA培养基上进行活化后，转接于装有100mL NA培养基的250mL的三角瓶中，30℃，180rpm培养24小时得到种子液。
(2)菌剂的制备
将种子液以1:100比例接种于发酵培养基中，30℃，200rpm培养48h。用灭菌水稀释制成活菌总浓度为1×108--1×1010cfu/mL的菌剂。
NA(营养琼脂)培养基组分：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl，琼脂15g，pH 7.2。
发酵培养基组分：豆粕粉10g/L、玉米粉10g/L、氯化钠10g/L，牛肉膏2g/L，蛋白胨3g/L，葡萄糖3g/L，pH 7.0-7.2。
实施例8Pseudomonas putida SRPG-396产植物激素性能分析
培养条件：转速为200rpm，培养温度为30℃，实验设三个重复。菌株在KB液体培养基中连续培养96h。每12h取一次样，用Salkowski法(λ＝535nm)测定发酵上清液中(3000rpm离心10min)IAA的含量，结果见附图1。
测定结果表明，Pseudomonas putida SRPG-396可以产生较大含量生长素IAA。在培养第96h，菌株的发酵液中的IAA含量达到10.77mg/L。次生代谢产物IAA主要在菌株的对数生长末期和稳定期大量产生，并且随着菌体生长时间的延长，其含量逐渐增高。
实施例9Pseudomonas putida SRPG-396溶磷性能
采用本发明所述的恶臭假单胞菌在有机磷平板和无机磷平板上进行溶磷性分析，菌株接3-4皿，置于28-30℃培养箱中培养10天，观察有无溶磷圈，结果见附图4。测试结果表明，Pseudomonas putida SRPG-396有明显的溶磷圈产生。
实施例10Pseudomonas putida SRPG-396产嗜铁素性能
CAS检测平板制作
配制1mM的CaCl2溶液、1mM的MgSO4·7H2O溶液、10％的酸水解酪蛋白溶液，灭菌后取0.2mL的CaCl2溶液、6mL的MgSO4·7H2O溶液、10％酸水解酪蛋白溶液，加入生物缓冲液Pipes，调pH6.8-7.0。用去离子水定容至100mL，加入2g琼脂粉灭菌后温度降低至60℃时以5mLCAS蓝色检测液/100mL培养基。按照每30mL倾注于培养皿中，制成CAS检测平板。
将待测菌株接种至CAS检测平板上，28℃培养3天，若平板上产生橙色，则认为产生了嗜铁素。测试结果表明，Pseudomonas putida SRPG-396在CAS平板上产生橙色，表明菌株可产生嗜铁素，结果见图5。
实施例11Pseudomonas putida SRPG-396菌株耐盐性
采用摇瓶培养生长曲线法，设置不同的盐浓度(0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、7.0％和8.0％)测定了该菌株的耐盐特性，由图6结果表明解盐促生菌株SRPG-396有很好的耐受性，在盐浓度为5.0％时菌株正常生长，12h进入平稳期，而盐度为7.0％的盐浓度下生长较平缓，而盐浓度达到8.0％时，几乎停止生长，表明菌体耐受5.0％的含盐量，而作物生长的次生盐渍化土壤或盐渍化土壤的含盐量都在2.0％之内，因此，表明菌株在盐渍化土壤中应用不会影响菌株的存活，具有潜在的实际应用价值。
实施例12Pseudomonas putida SRPG-396菌对棉苗营养元素吸收的应用效果
对接种和未接种SRPG-396的棉花种子进行盆栽试验，在棉花种子发芽四周后对其叶片和根部的K，Na，Ca，Mg，Fe各营养元素含量进行测定，计算其与植株干重的比例。
植株干重测量方法，将待测植株置于干燥箱中，110℃下杀青10min，再转入80℃下烘干24h至恒重，取出称重，所得重量即为植株干重。测定结果表明：盐胁迫导致棉花Na+含量的明显增高和K+含量的降低，同时增加了Fe3+的吸收并降低了Ca2+的吸收，而接种菌株SRPG-396可显著降低棉花叶片和根部Na+含量并提高K+的含量，同时提高Ca2+，Mg2+的吸收，从而有效缓解盐胁迫对棉花带来的迫害。具体结果见表7，表8。
表7菌株SRPG-396对棉花苗期叶片营养元素含量的影响(mg/g干重)
处理 K Na Ca Mg Fe
CK-NS 64.29±2.63 2.95±0.42 36.45±1.42 10.05±0.76 0.52±0.023
CK-S 39.2±1.41 45.73±2.28* 20.21±1.38 7.72±0.58 0.60±0.011
SRPG-396-N 73.4±2.51* 3.49±0.15 43.26±1.61* 11.43±0.70* 0.81±0.022*
SRPGS-396-S 51.33±2.636 34.78±1.92 31.82±1.45 8.98±0.52 0.89±0.019*
注：NS为不加盐处理，S为加盐处理；*表示显著性差异(p＜0.05)。
表8 菌株SRPG-396对棉花苗期根部营养元素含量的影响(mg/g干重)
处理 K Na Ca Mg Fe
CK-NS 36.45±1.42 2.55±0.32 16.09±1.54 5.86±0.39 0.69±0.014
CK-S 23.20±1.26 38.06±2.11* 5.92±0.32 6.24±0.24 0.73±0.021
SRPG-396-N 43.19±1.91* 3.14±0.04 17.39±1.33* 6.53±0.42* 0.86±0.028*
SS RPG-396-S 31.19±1.86 31.44±1.86 7.28±0.59 6.82±0.33* 0.91±0.031*
注：NS为不加盐处理，S为加盐处理；*表示显著性差异(p＜0.05)。

Claims (4)

1.一种具有解盐促生功效的恶臭假单胞菌SRPG-396，其特征在于：该菌株属于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，2014年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.9397，命名为恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaSRPG-396。
2.用权利要求1所述菌株制备的恶臭假单胞菌SRPG-396菌剂，其特征在于由所述菌株SRPG-396接种于由豆粕粉5-15g/L、玉米粉5-15g/L、氯化钠5-15g/L，牛肉膏2-10g/L，蛋白胨2-10g/L，葡萄糖2-10g/L，组成的液体培养基中发酵获得，所得菌剂活菌总浓度为1×108--1×1013cfu/mL。
3.权利要求2所述的恶臭假单胞菌剂的应用，其特征在于：所述菌剂应用于缓解盐渍化土壤对棉花、番茄和辣椒造成的盐胁迫的危害，并促进作物在盐胁迫下的苗期生长。
4.权利要求1所述的恶臭假单胞菌SRPG-396的应用性能，其特征在于：所述菌株同时具备溶解无机磷、产植物激素IAA和分泌嗜铁素的性能来缓解盐胁迫对作物造成的迫害，促进盐胁迫下作物的生长。
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