CN104974954A - 牧草根际溶磷促生菌的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牧草根际溶磷促生菌的应用，该牧草根际溶磷促生菌为扁穗雀麦根际溶磷菌Br7菌株；包括Br7菌株在制备用于提高禾本科牧草营养供给和生产性能的生物菌肥上的应用；包括Br7菌株的筛选方法、Br7菌株的环境适应性评价方法和Br7菌株对扁穗雀麦的促生效应评价方法。本发明采用的Br7菌株能同时溶解两种难溶性的磷酸盐（磷酸钙和磷酸铝）。Br7菌株虽然是在酸性环境下筛选出来的，但可适应较广的环境（pH值4.0~8.5范围内均能生长），并且可以耐高温，在温度为40℃条件下的OD值在0.2以上。可以利用于偏盐碱地。利用该Br7菌株制备生物菌肥对牧草产量和品质的提高有较大的促进作用。

Description

牧草根际溶磷促生菌的应用

技术领域

本发明涉及微生物肥料领域，特别是涉及一种牧草根际溶磷促生菌的应用。

背景技术

本技术旨在从贵州境内主栽牧草（黔南扁穗雀麦）根际，筛选促生溶磷菌株，测定菌株溶磷、分泌植物生长素等促生特性；研究菌株生理生化、生态适应性、定殖能力等，获得优良菌株；评定应用效果。解决我国西南地区（特别是贵州）贫瘠土地的肥料供给，降低环境污染，保护生态，促进农牧业可持续发展。而土壤中氮、磷元素缺乏已成为世界许多国家面临的共同问题。就我国而言，调查结果显示，74%的耕地缺磷，而且农田土壤中磷是以磷酸盐的化合状态存在的，化合态中的磷由于与土壤中的Fe³⁺、Ca²⁺和Al³⁺等结合而呈水不溶性，很难被植物吸收，所以农业生产中每年必须向土壤施入大量的可溶性磷肥。对于所施入的磷肥，当季作物的利用率一般只有5%～10%，加上作物的后效，也不超过25%，施入土壤的大部分磷肥实际上是以无效态累积于土壤中的。在农业生产过程中，为了维持和提高作物产量，化肥一直被认为是解决土壤氮素和磷素缺乏问题的主要甚至是唯一途径。特别在我国，化肥的年产量、总产量和单位面积使用量均居世界第一。但化肥生产成本高，随着施用量的增加，还伴随出现了肥效下降、利用率降低等现象，而且随着土壤和植物中NO^2- 等离子的累积，不可避免的出现了污染环境、危及人畜及食品安全等生态问题。与此同时，生产化肥对非再生能源消耗较大，施用化肥又会导致土壤团粒结构及微生物多样性受到破坏等负面效应。因此，探寻其它肥料来源特别是生物肥料以部分替代化肥的作用已是目前生产中亟待解决的问题。

黔南扁穗雀麦（Bromus carticus cv.Qiannan）是一种国家级优质牧草新品种，该品种具再生性和分蘖能力强、产草量高、草层密度大、叶量丰富，品质好，抗逆性强，适宜在林、果树下用于建植林间草地，冬季青绿，是解决南方冬春季缺乏青绿草的理想牧草之一。作为南方重要的禾草，属嗜氮、磷植物。磷在植物的结构和生理上起着重要作用，同时又以多种方式参与植物体内的各种生理代谢过程，对促进植物的生长发育和新陈代谢，以及作物的早熟、高产、优质都起着重要的作用，此外，还能提高植物的抗旱、抗寒、抗病、抗倒伏和耐酸碱的能力，磷素不足是限制植物生长和农业生产的重要因素。传统农业生产中大量施用化肥会导致环境污染。肥料中的速效磷很容易与土壤中的铁、铝生成难溶的化合物，使土壤板结，而且磷在土壤中的运动速度很慢，植物体难以吸收利用，土壤缺磷状况仍得不到根本缓解。因此最有效最环保的方法是筛选土壤根际中促生菌种为植株提供磷源。

溶磷微生物能够依靠自身的代谢产物或其他生物协同溶解土壤中的难溶无机磷，以提高土壤中磷的利用率，具有减少化学肥料施用量，降低农业投入成本，对环境进行微生物修复等功能。因此，如将这类溶磷微生物制作成生物菌肥，有利于提高禾本科牧草营养供给和生产性能，缓和牧草高产与磷需求高的矛盾，充分利用养分资源、降低生产成本，促进农业的可持续性发展,推动地方牧草品种产业化和生态畜牧业发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于从黔南扁穗雀麦根际筛选促生溶磷菌株，获得优良菌株并将其应用于生物菌肥领域，以克服现有技术的不足。

本发明是一种牧草根际溶磷促生菌的应用，该牧草根际溶磷促生菌为扁穗雀麦根际溶磷菌Br7菌株；它的应用包括Br7菌株在制备用于提高禾本科牧草营养供给和生产性能的生物菌肥上的应用；具体包括Br7菌株的筛选方法、Br7菌株的环境适应性评价方法和Br7菌株对扁穗雀麦的促生效应评价方法。

本发明的技术方案是这样的：

1、Br7菌株的筛选：

样品采集：以5点法采集扁穗雀麦根际土壤约100克，低温保存并在48小时内带回实验室进行溶磷菌分离。

菌株分离及初筛：选用PKO无机培养基（含磷酸钙）分离菌株，保存用LB培养基（配方见下边）。将分离具有溶磷圈的菌株分别点接种于PKO上，每培养皿四个点，28 ℃恒温培养3 d、6 d、9 d和12 d，测量溶磷圈直径（D）和菌落直径（d），计算D/d值，挑选D/d值相对较大的菌株纯化后保存（4 ℃）备用。

菌株溶解磷酸盐活力测定：采用钼蓝比色法，接种0.5 mL菌悬液在已装入50 mL灭菌PKO无机磷液体培养基中，对照不接菌。28 ℃、150 rpm·min^-1恒温摇床上振荡培养7 d。培养液在10000 rpm·min^-1、4 ℃下离心15 min，取1 mL上清液采用钼锑抗比色法测培养液中可溶性磷含量，菌株溶磷量以可溶性磷素表示[扣除对照值（μg·mL^-1）]；无机磷源为磷酸钙[Ca₃(PO₄)₂]与磷酸铝（AlPO₄）。

菌株溶磷量测定：将溶磷量较好的4个菌株转接在PKO无机磷[Ca₃(PO₄)₂]液体培养基中（重复3次）对照不接菌。28 ℃、150 rpm·min^-1恒温摇床上振荡培养3 d、6 d、9 d、12 d。测量溶磷圈直径（D）和菌落直径（d），同时用酸度计测定培养液pH值。

菌株分泌IAA能力测定：①定性判断，以加前体（色氨酸）和不加前体的king液体培养基培养菌株。菌株用LB培养基活化后制作菌悬液，接种量及重复数同菌株溶解磷酸盐活力测定。接种后培养基经28 ℃，125 rpm·min^-1的摇床培养3 d。取菌株悬浮液1 mL滴置于白色陶瓷检测板上，加入等量PC比色液，同时在比色液中分别加1 mL 50 μg·mL^-1、30 μg·mL^-1、10 μg·mL^-1的植物生长激素（IAA）作梯度对照，摇匀后室温下观察其颜色变化（15 min内），确定菌株是否分泌IAA及其强度。PC比色液：FeCl₃  12 g，7.9 mol·L^-1H₂SO₄ 1000 mL。②定量测定，挑选具有分泌IAA能力的菌株悬液于10000 rpm·min^-1下离心10 min，取适量上清液等比例加S₂比色液，混匀，黑暗中静置30 min后立即测定（波长530 nm）吸光度，根据标准曲线计算菌液中IAA含量（μg·mL^-1）。

其中，相关溶液配制：PKO无机培养基：Ca₃(PO₄)₂  3.0g、葡萄糖 10g、 (NH₄)₂SO₄  0.5g、 NaCl  0.2g、KCl  0.2g、MgSO₄.7H₂O  0.03g、MnSO₄  0.03g、 FeSO4. 7H₂O 0.003g、 酵母粉0.5 g、 琼脂 20 g、蒸馏水1000mL 、PH 6.8-7.2；LB培养基：酵母粉 5 g、蛋白胨 10.0 g、NaCl  6.0 g、琼脂 20.0 g、蒸馏水1000mL 、PH 7.0；King培养基：蛋白胨 20.0 g、甘油 15mL、K₂HPO₄  1.15g、MgSO₄.7H₂O 1.5g、蒸馏水1000mL 、PH 6.8-7.0；S₂比色液：FeCl₃ 4.5g 、10.8moL·L^-1 H₂SO₄  1L。（测定范围5-200μg·mL^-1）。

2、环境适应性评价：

菌悬液制备：将各供试促生菌划线接种于LB固体斜面上，在28℃下活化培养24h，加入3mL灭菌水制成菌原液，取1mL配成一系列10倍稀释液涂板，28℃培养48h，根据平板菌落计数法，推算菌原液浓度。根据菌原液浓度，制备菌悬液，使1mL菌悬液涂板长出的菌落数为100个左右。

促生菌最适培养条件测定：①温度对溶磷菌生长的影响测定，在无菌条件下，将制备好的菌悬液各0.2mL接种于灭菌的LB培养液（15mL/管）中，以不接菌为对照，摇匀后在不同温度（5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）下静止培养，每处理3个重复，培养48h，用T6新世纪紫外可见分光光度计测定吸光度，确定最适培养温度。② pH对溶菌生长影响测定  将LB培养液分别用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调到pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5共10个pH梯度，分装到试管中（15 mL/管），灭菌后在无菌条件下分别接种0.2mL菌悬液，以不接菌为对照，每处理3个重复，置28℃下振荡培养48h，用T6新世纪紫外可见分光光度计测定吸光度，确定最适pH值。③光照对溶磷菌生长影响测定，在无菌条件下，将制备好的菌悬液各0.2mL接种于灭菌的LB培养液（15mL/管）中，分别设置连续24h光照、12h黑暗和12h光照交替以及连续24h黑暗3个处理培养，以不接菌为对照，每处理3个重复，置28℃下振荡培养48h，用T6新世纪紫外可见分光光度计测定吸光度，确定最适光照条件。④培养方式对溶磷菌生长影响测定，在无菌条件下，将制备好的菌悬液各1mL分别接入盛有50mLLB培养液的三角瓶（150mL）中，设静止、间歇振荡（12h/d）、全天24振荡共3个处理，设转速为150rpm/min，以不接菌为对照，置28℃下培养48h，用T6新世纪紫外可见分光光度计测定吸光度，确定最佳培养方式。⑤盐分对溶磷菌生长的影响，在LB培养基中加入NaCl 配成1%、2%、3%、4%、5%、6%、7% 7个浓度梯度，灭菌后制成平板。用接种环挑取在LB斜面上活化的各供试菌株，划线接种，每处理3个重复，以不接菌的为对照，置28℃下培养5d，观察菌体生长情况。⑥溶磷菌产酸、碱性能的测定  用接种环挑取分离所得菌株的纯培养物一环，接种于盛有30 mLNFM液体培养基的三角瓶中，每一菌株3个重复。将三角瓶置于28 - 30℃摇床上，于125 rpm·min^-1转速下，培养72 h。观察并记录培养基颜色的变化。颜色变成黃色，表明其为产酸菌株；变为兰色为产碱菌株；不变色为中性菌株^[11]。同时利用pH测定仪测定菌株悬浮液的pH值。⑦不同碳源下溶磷菌生长的观测，在LB培养基中分别以甘露醇(A)、蔗糖(B)、木糖(C)、麦芽糖(D)、葡萄糖(E)、苹果酸(F)、柠檬酸(J)、可溶性淀粉(H)取代蛋白胨，制成不同碳源的培养基，各种碳源体积质量保持不变，用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调到pH值为7.2，28℃下培养72h，观察并记录各菌株在不同碳源培养基上的菌株的长势，直径等。

3、Br7菌株对扁穗雀麦的促生效应评价：

菌株对扁穗雀麦的试管试验：在4 cm×50 cm的试管，加入Hoagland半固体有氮培养液（Ca（NO₃）₂ 0.945 g，KNO₃ 0.506 g，NH₄NO₃ 0.08 g ，Ca₃(PO₄)₂ 0.31 g ，AlPO₄ 0.31 g，MgSO₄ 0.493 g，铁盐溶液 2.5 mL，微量元素液 2 mL，pH 6.0，Agar 3.5 g，蒸馏水1000 mL），每管50 mL，灭菌；扁穗雀麦种子去皮用75%的酒精浸种5 min无菌水冲洗2 - 3次，1%的氯化汞消毒20 min无菌水冲洗，然后在水琼脂培养基上长出2 - 4 cm，移入试管中，每管1粒种子，加入菌液0.5 mL，对照不接菌，每个处理设7次重复。21 d后收获，测量扁穗雀麦株高、根长与根数，地上生物量和地下生物量（干重）。

盆栽试验：①试验处理： 取田间耕作层土壤（0-20cm），除去砾石及杂草枯枝后，混匀过2mm筛，高温高压蒸汽间歇灭菌2h后装于栽培盆中，每盆约1.5kg。扁穗雀麦种子用50℃温水浸泡过夜，用75%酒精浸种5 min无菌水冲洗2 - 3次，1%的氯化汞消毒30 min，用无菌水冲洗5-6次后浸泡于上述准备好的菌悬液中2-3h，取出按常规方法播种于栽培盆中，每盆播种25粒，每菌株3个重复，以不接种菌株为对照，置于生长室，种子发芽后每盆保存10株进行观察。每次刈割后追施尿素7kg/666.7m²，盆0.19×0.19m。②测定时间和项目，播种时间为春季或秋季，第一次观察时间为34d，第二次为21 d，第三次为35 d，第四次为33 d，第五次为29 d。每盆随机用5株测定株高，干重、干鲜比。最后一次测产时选取15株差异不大的根系进行根长、鲜重、干重，和植株分蘖数，用五次测产的地上部分进行营养成份分析。

本发明的技术效果如下：

本发明采用筛选的溶磷菌，从生物学角度实现高效溶磷。其制备的菌剂具有将土壤中多种难溶性的磷酸盐转化为水溶性形态，从而改良了土壤品质，提高了提高牧草产量、改善品质、增强肥料利用率，并减少了环境污染。此菌剂环境适应性强，具有耐高温（＜40℃）、抗高盐（NaCl＜5%），并且适宜于在pH值较广的范围内生长（4.0-8.5）；对土壤溶磷效果显著，具有较强的溶解磷酸钙（98.33 μg·mL^-1）和磷酸铝（111.80 μg·mL^-1）两种难溶性磷的能力；对牧草品质和产量有显著的促进作用，牧草（扁穗雀麦）地上生物量增产44.64%-61.84%；牧草钙磷比显著降低到1.308:1（最适范围1～2:1），P素利用率提高14.29%；适合红土壤、黄壤等多种土壤类型，具有释放土壤难溶磷、防止磷的土壤化学固定，提高磷肥利用效率，改善牧草品质和提高产量的效果。

附图说明

图1是各菌株对不同磷源的溶磷量示意图；

图2是Br7溶磷菌在不同温度下的OD值示意图；

图3是pH对溶磷菌生长的影响示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明的实施方式具体步骤如下：①采集扁穗雀麦草地的贫磷土壤放入塑料袋中，置于4℃的冰箱保存；②菌株的分离及筛选；③溶磷能力的测定；④环境适应性评价；⑤促生效应评价。（2）主要特征：①此菌剂环境适应性强，具有耐高温（＜40℃）、抗高盐（NaCl＜5%），并且适宜于在pH值较广的范围内生长（4.0-8.5）；②对土壤溶磷效果显著，具有较强的溶解磷酸钙（98.33 μg·mL^-1）和磷酸铝（111.80 μg·mL^-1）两种难溶性磷的能力；③对牧草品质和产量有显著的促进作用，牧草（扁穗雀麦）地上生物量增产44.64%-61.84%；牧草钙磷比显著降低到1.308:1（最适范围1～2:1），P素利用率提高14.29%，在牧草上应用可明显提高牧草产量、改善品质、减少的磷肥用量。

实施例1：

1、Br7菌株的筛选及溶磷活力分析：

（1）样品采集：以5点法采集扁穗雀麦根际土壤，低温保存并在48小时内带回实验室进行溶磷菌分离。采集地点为贵州省某草业研究所试验地，系喀斯特岩溶地区，气候属中亚热带季风性湿润气候，冬无严冷，夏无酷暑，年均气温在15℃以上，无霜期长，雨量充沛，宜于植物生长，pH值为5.97，速效氮为156.98 mg/kg，有效磷为15.02 mg/kg。

（2）菌株在水溶性培养基里溶解磷酸盐活力测定：钼蓝比色法。接种0.5 mL菌悬液在已装入50 mL灭菌PKO无机磷液体培养基中（重复3次），对照不接菌。28 ℃、150 rpm·min^-1恒温摇床上振荡培养7 d。培养液在10000 rpm·min^-1、4 ℃下离心15 min，取1 mL上清液采用钼锑抗比色法测培养液中可溶性磷含量，菌株溶磷量以可溶性磷素表示[扣除对照值（μg·mL^-1）]；无机磷源为磷酸钙[Ca₃(PO₄)₂]与磷酸铝（AlPO₄）。

（3）Br7菌株解磷活力：

选取Br7株菌株定量测定其溶磷能力（如图1所示）。结果显示，各菌株对不同磷源的溶磷能力差异较大，以磷酸钙为磷源时，菌株Br7溶磷量为98.33 μg·mL^-1。以磷酸铝为磷源时，菌株Br7，为111.80 μg·mL^-1。通过图1还可得出，供试株菌中Br7菌株能同时溶解两种难溶性磷源，说明它们具有溶解多种难溶性磷酸盐的能力。

2、 Br7菌株的环境适应性分析：

（1）菌悬液制备：将各供试促生菌划线接种于LB固体斜面上，在28℃下活化培养24h，加入3mL灭菌水制成菌原液，取1mL配成一系列10倍稀释液涂板，28℃培养48h，根据平板菌落计数法，推算菌原液浓度。根据菌原液浓度，制备菌悬液，使1mL菌悬液涂板长出的菌落数为100个左右。

（2）菌株对特异环境的适应性测定：

温度对溶磷菌生长的影响测定：在无菌条件下，将制备好的菌悬液各0.2mL接种于灭菌的LB培养液（15mL/管）中，以不接菌为对照，摇匀后在不同温度（5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）下静止培养，每处理3个重复，培养48h，用T6新世纪紫外可见分光光度计测定吸光度，确定最适培养温度。

pH对溶菌生长影响测定：将LB培养液分别用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调到pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5共10个pH梯度，分装到试管中（15 mL/管），灭菌后在无菌条件下分别接种0.2mL菌悬液，以不接菌为对照，每处理3个重复，置28℃下振荡培养48h，用T6新世纪紫外可见分光光度计测定吸光度，确定最适pH值。

盐分对溶磷菌生长的影响：在LB培养基中加入NaCl 配成1%、2%、3%、4%、5%、6%、7% 7个浓度梯度，灭菌后制成平板。用接种环挑取在LB斜面上活化的各供试菌株，划线接种，每处理3个重复，以不接菌的为对照，置28℃下培养5d，观察菌体生长情况.

（3）温度对溶磷菌的影响：

     温度主要影响菌株体内酶的活性，在低温时，酶活性较低，酶促反应也较缓慢，利用营养物质能力也较弱，从而影响细菌的生长，随着温度的升高，酶活性也逐渐升高，酶促反应也较快，加快了对营养物质的利用、细菌的分化速度，从而提供了培养液中的活菌数，但温度上升到一定程度如超过35℃时，许多酶逐渐失活，酶促反应也开始降低，降低了对营养物质的利用率，细菌数量大量减少，当超过45℃时，大批的酶失活，菌体不能利用溶液中的营养物质，从而细菌大批死亡，溶液中的细菌数量达到最低值；温度还会通过影响发酵液的理化性质，间接影响菌体生长。许多研究表明，细菌的温度培养控制在28~30℃比较适合。

Br7溶磷菌株在不同的温度梯度下生长情况见表1和图2。从表1可以看出，供试菌株在5~45℃范围内均能生长，其适应范围较广。菌株从5~45℃的D660nm值先增加，到30℃时到达峰值，随后开始下降。菌株Br7在10℃和40℃条件下的OD值在0.2以上，菌体数量较多，可以适应高温的不良环境。

（4）pH值对促生菌生长的影响：

    pH值是菌种生长的化学因子，对微生物生长的影响很大。在培养微生物时，pH值可以引起细胞膜电荷变化，以及影响营养物离子化程度，从而影响微生物对营养物的吸收。另外，生物体内的所有代谢过程都受酶的控制，酶的催化反应又依赖pH，进而影响细菌对营养物质的分解利用。pH过高或过低都不利于细菌的生长和代谢物质的产生，钟传青发现，培养时pH在7~8菌体数最多，是最佳培养酸碱度。汤春梅等发现燕麦或小麦根际促生菌在中性或偏碱的条件下生长好。胡子全等发现一株有机磷细菌最适初始pH为8.0~9.0，在初始pH为5.5~10.0内时，pH对有机磷细菌生长影响不显著。刘青海等发现混合菌在初始pH为5.0~8.5菌能正常生长。

    pH值对供试菌株生长的结果（表2和图3）表明：溶磷菌在pH值4.0~8.5范围内均能生长，说明菌株对酸碱度的适应性较广；试验结果经方差分析表明，菌株在酸性环境pH4.0-5.5时生长最快；碱性环境里Br7在pH值为7.0时生长最快，从总体来看酸性＞弱碱性＞中性。

（5）盐分对溶磷菌生长的影响：

Na⁺和Clˉ是维持细胞外液渗透压的主要离子，高盐条件下，引起菌体细胞壁和细胞质中的核质都变的更紧密，多核糖体的比例不断上升。不同的NaCl浓度下，细菌中的细胞脂肪酸的组成也不同,高盐浓度下，细胞的脂肪酸含量不断上升，达到一定浓度不再上升，当盐浓度继续增加时，细菌细胞便会发生质壁分离，细菌细胞脱水死亡。

盐分对Br7溶磷菌生长影响的结果见表3所示。菌株在1%NaCl的培养基上生长良好，随盐分浓度的升高，菌株生长逐渐减弱。当NaCl达7%时，菌株不能生长。在NaCl为5%时，菌株生长一般。Br7菌株有一定的耐盐性，可以利用于偏盐碱地。

 

3、Br7菌株对扁穗雀麦的促生效应分析：

（1）试验处理：取田间耕作层土壤（0-20cm），除去砾石及杂草枯枝后，混匀过2mm筛，高温高压蒸汽间歇灭菌2h后装于栽培盆中，每盆约1.5kg。扁穗雀麦种子用50℃温水浸泡过夜，用75%酒精浸种5 min无菌水冲洗2 - 3次，1%的氯化汞消毒30 min，用无菌水冲洗5-6次后浸泡于上述准备好的菌悬液中2-3h，取出按常规方法播种于栽培盆中，每盆播种25粒，每菌株3个重复，以不接种菌株为对照，置于生长室，种子发芽后每盆保存10株进行观察。每次刈割后追施尿素7kg/666.7m²，盆0.19×0.19m。

播种时间为4月19日，第一次观察时间为34d（5月23日），第二次为21 d（6月14日），第三次为35 d（7月19日），第四次为33 d（8月21日），第五次为29 d（9月19日）。每盆随机用5株测定株高，干重、干鲜比。最后一次测产时选取15株差异不大的根系进行根长、鲜重、干重，和植株分蘖数，用五次测产的地上部分进行营养成份分析。

土壤样品分析方法：全磷(酸溶-钼锑抗比色法)；有效磷(NaHCO₃浸提－钼锑抗比色法)。

植株营养分析方法：全磷(H₂SO₄-H₂O₂消煮—钼黄比色法) ；全钙(干灰化—原子吸收分光光度法)；土壤、植物样的测定均在贵州大学环境与资源研究所实验室进行测试。

 （2）Br7菌株对扁穗雀麦产量的影响：

从表4可知，接种菌株对扁穗雀麦干重影响较小，相比对照CK，Br7在第二茬中干重与对照达极显著水平，其它茬数干重显著高于对照，但达不到显著水平。

（3）Br7菌株对扁穗雀麦品质的影响：

全磷量测定其结果显示，溶磷菌Br7处理的植株含磷量比CK提高14.29%。钙磷比为1.308:1，显著低于CK为7.34:1。反刍动物对饲草钙磷比承受的范围（1:1～7:1），而最适宜的钙磷比为1～2:1，说明扁穗雀麦牧草磷含量较高，可提供钙磷利用量增大，对扁穗雀麦的生长有明显的促进作用，同时为反刍动物提供最适宜的钙磷比，可有效地促进放牧家畜骨骼生长，进一步提高家畜生产力。

当然，以上只是发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种牧草根际溶磷促生菌的应用，该牧草根际溶磷促生菌为扁穗雀麦根际溶磷菌Br7菌株；其特征在于：包括Br7菌株在制备用于提高禾本科牧草营养供给和生产性能的生物菌肥上的应用；包括Br7菌株的筛选方法、Br7菌株的环境适应性评价方法和Br7菌株对扁穗雀麦的促生效应评价方法。

2.根据权利要求1所述的牧草根际溶磷促生菌的应用，其特征在于所述Br7菌株的筛选方法包括：

1）菌株分离及初筛：选用PKO无机培养基分离菌株，用LB培养基保存；将分离具有溶磷圈的菌株分别接种于PKO上，挑选菌株纯化后保存备用；

2）菌株溶解磷酸盐活力测定：采用钼蓝比色法，接种菌悬液在已装入灭菌PKO无机磷液体培养基中，对照不接菌；恒温摇床上振荡培养；培养液离心处理；取上清液采用钼锑抗比色法测培养液中可溶性磷含量，菌株溶磷量以可溶性磷素表示；

3）菌株溶磷量测定：选取溶磷量好的菌株转接在PKO无机磷液体培养基中，对照不接菌；恒温摇床上振荡培养；测量溶磷圈直径和菌落直径，同时用酸度计测定培养液pH值；

4）菌株分泌IAA能力测定：①定性判断：以加前体和不加前体的king液体培养基培养菌株；菌株用LB培养基活化后制作菌悬液，接种量及重复数同步骤2）菌株溶解磷酸盐活力测定；接种后培养基经摇床培养；取菌株悬浮液滴置于白色陶瓷检测板上，加入等量PC比色液，同时在比色液中分别加植物生长激素IAA作梯度对照，摇匀后室温下观察其颜色变化，确定菌株是否分泌IAA及其强度；②定量测定：挑选具有分泌IAA能力的菌株悬液离心，取上清液等比例加S₂比色液，混匀，黑暗中静置后立即测定吸光度，计算菌液中IAA含量。

3.根据权利要求2所述的牧草根际溶磷促生菌的应用，其特征在于：所述PKO无机培养基配方为：Ca₃(PO₄)₂  3.0g、葡萄糖 10g、 (NH₄)₂SO₄  0.5g、 NaCl  0.2g、KCl  0.2g、MgSO₄.7H₂O  0.03g、MnSO₄  0.03g、 FeSO4. 7H₂O 0.003g、 酵母粉0.5 g、 琼脂 20 g、蒸馏水1000mL 、PH 6.8-7.2；所述LB培养基配方为：酵母粉 5 g、蛋白胨 10.0 g、NaCl  6.0 g、琼脂 20.0 g、蒸馏水1000mL 、PH 7.0；所述king液体培养基配方为：蛋白胨 20.0 g、甘油 15mL、K₂HPO₄  1.15g、MgSO₄.7H₂O 1.5g、蒸馏水1000mL 、PH 6.8-7.0；所述S₂比色液配方为：FeCl₃ 4.5g 、10.8moL·L^-1 H₂SO₄  1L；所述PC比色液配方为：FeCl₃  12 g，7.9 mol·L^-1H₂SO₄ 1000 mL。

4.根据权利要求1所述的牧草根际溶磷促生菌的应用，其特征在于所述Br7菌株的环境适应性评价方法包括菌悬液制备和促生菌最适培养条件测定；促生菌最适培养条件测定包括温度对溶磷菌生长的影响测定、pH对溶菌生长影响测定、光照对溶磷菌生长影响测定、培养方式对溶磷菌生长影响测定、盐分对溶磷菌生长的影响、溶磷菌产酸、碱性能的测定、不同碳源下溶磷菌生长的观测。

5.根据权利要求1所述的牧草根际溶磷促生菌的应用，其特征在于所述Br7菌株对扁穗雀麦的促生效应评价方法包括：

1）菌株对扁穗雀麦的试管试验：在试管加入Hoagland半固体有氮培养液，灭菌；扁穗雀麦种子去皮用酒精浸种后无菌水冲洗，氯化汞消毒后无菌水冲洗，然后在水琼脂培养基上培养，长出2 - 4 cm后移入试管中，每管1粒种子，加入菌液，对照不接菌；收获后测量扁穗雀麦株高、根长与根数，地上生物量和地下生物量；

2）盆栽试验：①试验处理： 取田间耕作层土壤，除去砾石及杂草枯枝后，混匀过筛，灭菌后装于栽培盆中；扁穗雀麦种子用温水浸泡过夜，用酒精浸种无菌水冲洗，氯化汞消毒，用无菌水冲洗后浸泡于准备好的菌悬液中，取出播种于栽培盆中，以不接种菌株为对照，置于生长室，种子发芽后每盆保存10株进行观察；每次刈割后追施尿素；②测定时间和项目：播种时间为春季或秋季，第一次观察时间为34d，第二次为21 d，第三次为35 d，第四次为33 d，第五次为29 d；每盆随机用5株测定株高，干重、干鲜比；最后一次测产时选取15株差异不大的根系进行根长、鲜重、干重，和植株分蘖数，用五次测产的地上部分进行营养成份分析。