CN105385638A - 一种微生物解磷制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种微生物解磷制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种微生物解磷制剂及其制备方法和应用。所述微生物解磷制剂为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)YN2010-KC？CGMCC？No.5722制备的发酵液。其制剂能提高土壤中难溶性磷的生物有效性和土壤磷的利用率，节肥增产，改善土壤环境，能有效促进植物包括农作物对土壤磷元素的吸收，分解作物根系周围的难溶磷元素。其制剂生产成本低，施用方法简单易行。

Description

一种微生物解磷制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一种含解淀粉芽孢杆菌的菌剂及其制备方法和在提高土壤中磷的利用上的应用。
背景技术
磷是植物生长所必需的矿质元素之一，是植物体内核酸及多种酶、辅酶、三磷酸腺苷(ATP)等的重要组成部分，并以多种方式参与植物体内的光合作用和生理生化过程，对促进植物的生长发育和新陈代谢具有重要作用。植物缺磷会影响核酸、蛋白质合成，使细胞形成和增殖受到抑制，导致生长发育停滞，根系发育不良，植物矮小，各类作物分蘖将减少或延迟，抽穗推迟，开花晚，成熟迟，穗粒数减少，籽粒不饱满，玉米果穗秃顶，马铃薯块茎变小等。因此，磷对农业生产来说是非常重要的。
自然界的磷库主要存在于土壤中，其循环主要在土壤、植物和微生物之间进行。土壤作为植物磷素的供给源，其供磷水平的高低影响着植物的生长发育。土壤中的磷含有机磷和无机磷两种，有机磷占土壤全磷的1/3～1/2，主要以核酸、磷酸和植素存在。无机磷占全磷的40％～75％，除少量可溶性磷酸盐外，大部分为不溶性磷酸盐(磷酸钙、磷酸铁、铝磷酸盐等)，这些形态的无机磷化物很难被植物吸收利用，土壤中能被植物直接吸收利用的有效态磷仅占全磷的2％～3％。据统计，全世界有43％的耕地土壤属于缺磷土壤；我国有74％的耕地土壤缺磷，土壤中95％以上的磷以稳定的铝硅酸盐和磷灰石等为无效形式存在，植物很难直接吸收利用，因此绝大多数农作物及林木都要追施磷肥。施入的磷肥当季作物利用率为5％～25％，一部分磷肥随雨水流入江河湖泊，造成水体的富营养化，引起水质污染；大部分磷由于土壤的固定作用，与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+结合，形成难溶性磷酸盐，因此，大部分磷肥作为无效态(难溶态)在土壤中积累。由于长期施用磷肥，事实上大多数农田土壤潜在的磷库含量很大，而且磷肥过多使用会造成土壤重金属含量的增加，土壤理化性质改变，且有机磷农药的大量施用，造成环境污染，影响农产品质量，对人类的健康带来很大的危害。
磷是许多发展中国家农业生产上的重要限制因素，提高土壤中磷的利用效率将具有重大意义。大量研究结果表明，某些微生物具有很强的解磷功能，通过其分泌物或吸收作用可把土壤中无效态磷转化成有效态磷，还分泌生长素等物质刺激植物生长。解磷微生物最直接的作用就是溶解土壤中的难溶性或不溶性磷素。解磷微生物肥料除了有提供作物可吸收磷素以外还具有以下优点：(1)促进农作物对锌、铜、钙等其他营养元素的吸收。(2)增强植物抗病能力。(3)肥效高。(4)减少环境污染。(5)解磷微生物肥料的生产工艺简单，投资少，见效快，效益好，具有极强的市场竞争力。因此，筛选解磷微生物，生产含有解磷功能的微生物有机肥料对解决植物磷素供应问题是一条很好的途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在土壤中磷的利用效率较低，以及植物的生长主要靠施用化肥、化学农药会带来环境污染等缺陷，其发明的目的是通过一种微生物解磷制剂分解土壤难溶无机磷，为植物提供可以直接吸收的磷素。
为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案如下：
1.一种微生物解磷制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722活化后，按5～10％接种量，将活化的所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养24～36h，得到一级种子液，所述种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：葡萄糖0.5～1％，(NH4)2SO40.03～0.05％，NaCl0.02～0.03％，KCl0.02～0.03％，Ca3(PO4)20.1～0.2％，MgSO4·7H2O0.02～0.03％，MnSO4·4H2O0.001～0.003％，余量为水，pH7.0～7.2；
(2)按10～12％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.01～0.03MPa条件下培养36～48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：玉米粉1.5～3％，麸皮粉1～2％，酵母膏0.05～0.3％，蛋白胨0.5～1％，磷矿粉1～2％，MgSO4·7H2O0.01～0.03％，NaCl0.1～0.3％，(NH4)2SO40.03～0.05％，余量为水，pH7.0～7.2；
(3)按10～12％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.01～0.03MPa条件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数≧1×1010cfu/ml时，将发酵液用医用塑料瓶包装，即为所述微生物解磷制剂，所述发酵培养基与步骤(2)所述二级种子培养基相同。
2.一种微生物解磷制剂，其特征在于：它的活性成分为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液。
3.一种微生物解磷制剂，其特征在于：所述生物解磷制剂通过技术方案1所述的一种生物解磷制剂的制备方法制备得到。
4.技术方案2或3所述的微生物解磷制剂在降解土壤难溶无机磷中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明微生物解磷制剂通过本发明保藏号为CGMCCNo.5722的一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KC发酵而成的液体制剂，能提高土壤中难溶性磷的生物有效性和土壤磷的利用率，节肥增产，改善土壤环境，能有效促进植物包括农作物对土壤磷元素的吸收，分解作物根系周围的难溶磷元素，可以作为降解土壤难溶无机磷的解磷制剂。
2、本发明微生物解磷制剂可作为微生物肥料，在生产中避免了“三废”污染，属环境友好型生物制剂，能减少环境污染并能修复土壤。
3、本发明微生物解磷制剂的制备工艺简单，成本低，施用方法简单易行。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensYN2010-KC于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.5722，并于2012年1月12日检测为存活。该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明，各实施例无特殊说明为常规方法。
实施例1本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KC的获得、鉴定和保藏
1、本发明解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的获得
1.1材料
采自云南农业大学后山农场玉米根际周围的土壤。
1.2培养基制备
将LB固体培养基和PSA培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成LB和PSA平板。
1.3分离培养
采用稀释平皿分离法和平板划线分离，将分离纯化所得的一菌株命名为YN2010-KC。
2、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的鉴定
2.1、形态学鉴定
取菌株YN2010-KC在LB培养基上培养，37℃培养36小时，进行形态观察鉴定，菌体为杆状、端圆，周生鞭毛、具运动性，产生椭圆形芽孢；在LB和PSA平板上菌落圆形、淡茶褐色、菌落中央颜色略深、隆起、表面干燥有褶皱。与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社，2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株YN2010-KC属于芽孢杆菌(Bacillusspp.)。
2.2、生理生化鉴定
菌株革兰氏染色、芽孢染色、淀粉水解、葡萄糖利用、柠檬酸盐利用、V-P反应、接触酶反应、硝酸盐还原、明胶液化等均呈阳性。
3、解淀粉芽孢杆菌YN2010-KC的保藏
经上述鉴定表明所分离获得的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，其代号为YN2010-KC，所述的解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensYN2010-KC于2012年1月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.5722，并于2012年1月12日检测为存活。该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编:100101。
实施例2本发明微生物解磷制剂的制备
本发明生物解磷制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种在液体LB培养基上，32℃培养24～36h，得活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722，按10％接种量，将活化的所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.572接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养36h，得到一级种子液，所述种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：葡萄糖1％，(NH4)2SO40.05％，NaCl0.02％，KCl0.03％，Ca3(PO4)20.2％，MgSO4·7H2O0.03％，MnSO4·4H2O0.003％，余量为水，pH7.0～7.2；
(2)按10％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在32℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.01～0.03MPa条件下培养36h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：玉米粉2％，麸皮粉1％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.5％，磷矿粉2％，MgSO4·7H2O0.02％，NaCl0.1％，(NH4)2SO40.03％，余量为水，pH7.0～7.2；
(3)按10％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在32℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.01～0.03MPa条件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数为1×1010cfu/ml时，将发酵液用医用塑料瓶包装，即为所述微生物解磷制剂；所述发酵培养基与步骤(2)所述二级种子培养基相同。
实施例3：本发明菌株解磷能力测试
无机磷液体培养基配方为：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl0.3g，Ca3(PO4)22g，MgSO4·7H2O0.3g，MnSO4·4H2O0.03g，水1000mL，pH7.0～7.2。
按无机磷液体培养基配方将各成分混合后，调pH7.0～7.2，115℃灭菌30min，冷却至室温，得灭菌的无机磷液体培养基。
处理1：在灭菌的培养基中加入灭过菌的Ca3(PO4)21g。
处理2：在灭菌的培养基中加入灭过菌的磷矿粉1g。
处理3：在灭菌的体培养基中加入灭过菌的磷矿石1g。
上述每个处理分别加入2ml解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722菌液，上述接种后在35℃，200转/分钟恒温摇床上培养4天后，取10mL培养液，在4℃下，12000转/分钟离心10min，吸取上清液定容至50ml，然后采用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷含量。设不接种为对照组，每处理重复3次。
试验表明：本发明菌株对难溶性磷酸盐具有较强的解磷作用，见表1，在处理1以Ca3(PO4)2为唯一磷源的液体培养基中培养4d后，培养液中的可溶性磷含量为63.82mg/L，是对照培养液的64.46倍，而处理2以磷矿粉为唯一磷源的液体培养基中培养4d后，培养液中的可溶性磷含量为45.95mg/L,是对照培养液的45.95倍；处理3以磷矿石为磷源时，培养液中的可溶性磷含量为21.26mg/L,是对照培养液的21.47倍；其解磷效果没有处理2粉状的磷矿石好。
表1发明菌株对不同磷源的液体培养基的解磷能力
实施例4本产品对玉米生长及其土壤和植株氮磷钾含量的影响
用实施例2制备的本发明微生物解磷制剂(以下简称：本产品)，实验在云南农业大学温室进行，供试玉米品种为广玉88(购自云南广大种业有限公司)，试验设计为分别为：处理1：本产品1000倍液，处理2：液体LB培养基，处理3：清水对照，共3个处理。将自然土混合均匀，过筛后分装在营养钵中(12cm×13cm，装土约500g)，将表面消毒的玉米种子播种于营养钵中，每盆三粒，表面覆土，各处理按照每盆100mL接种量接入土壤中，各处理重复5次。每天不定时浇水，保持水分。播种后30d测定玉米农艺性状，将植株干样留作氮磷钾测定，同时采集各处理土样进行氮、磷、钾含量测定。
A、本产品对玉米生长量影响效果
分别对玉米出苗后30d调查株高、根长、叶宽等生物学性状(表2)，产品对玉米株高、根长、叶宽等生物学性状均有一定的影响，使用本产品的处理与对照清水处理相比均有不同程度的增加趋势，且各处理间差异显著。
本产品对玉米生物学性状的影响结果可知，玉米株高和根长较对照分别增加33.33％和31.85％，叶宽比对照增加19.88％；植株鲜重比对照增加84.0％，植株干重也增加78.46％。
本产品与液体LB培养基相比，玉米株高比液体LB培养基增高24.91％，玉米根长比液体LB培养基增长24.48％，叶宽比液体LB培养基增宽17.06％，植株鲜重比液体LB培养基增加65.96％；植株干重比液体LB培养基增加46.84％，由此可见，本产品能显著提高玉米生长量，促使植物生长，本发明微生物发酵液分解了土壤中难溶性的磷钾矿物，使之变为可溶性的磷钾离子供给植物吸收利用。
表2本产品对玉米生长量的影响
B、本产品对玉米植株及土壤营养状况的影响
分别对实施例4中A所述各处理土壤及玉米植株取样测定土壤养分含量状况和玉米植株的养分吸收量(表3、4)。
本产品对土壤磷素影响的测定结果(表3)可知，施入本产品后，土壤中速效氮、速效磷和速效钾含量均有显著增加，土壤速效氮比没有施入本产品前增加21.28％，土壤速效磷比没有施入本产品前增加112.28％，土壤速效钾比没有施入本产品前增加19.10％，而对照及液体LB培养基处理的速效养分比播种前的含量降低，由此说明：本产品活化了土壤难溶性磷、钾，供给植株吸收利用，而对照中和液体LB培养基中没有本微生物的活化，植物生长消耗了土壤中的速效养分，表现出降低趋势，本产品在提高磷肥钾肥利用率，减少磷钾肥施用量上均有显著作用。
表3本产品对土壤磷素影响的测定
对植株而言：本产品施入后，可使植株吸收氮量比对照和LB处理分别增加46.7％、37.89％；吸收磷量也极显著高于对照和液体LB培养基处理，分别增长127.48％和106.94％；植株吸收钾量也比对照与液体LB培养基处理显著提高，分别增长72.31％和37.76％；说明了本产品的施用对植株氮磷钾素营养的吸收有显著的促进作用，从而促进了玉米的生长。
表4本产品对玉米植株养分吸收效率的影响
以上试验表明：
本发明微生物解磷制剂可使土壤速效氮增加21.28％，土壤速效磷增加112.28％，土壤速效钾增加19.10％。
与液体LB培养基和清水对照相比，本发明微生物解磷制剂可使玉米株高增加24.91～33.33％，玉米根长增加24.48～31.85％，玉米叶宽增加17.06～19.88％，玉米植株鲜重增加65.96～84.0％，玉米植株干重增加46.84～78.46％。
与液体LB培养基和清水对照相比，本发明微生物解磷制剂可使玉米植株吸收氮量增加、37.89％～46.7％；玉米植株吸收磷量分别增长和106.94％～127.48％；玉米植株吸收钾量显著提高37.76％～72.31％。
表明：本发明产品能显著降解土壤难溶无机磷，提高土壤中难溶性磷的生物有效性和土壤磷的利用率，显著促使植物生长，提高植物生长量，促进使植物对氮、磷、钾的吸收。

Claims (4)

1.一种微生物解磷制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722活化后，按5～10％接种量，将活化的所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722接种到种子培养基，在培养温度35℃、转速120rpm/min条件下，摇床培养24～36h，得到一级种子液，所述种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：葡萄糖0.5～1％，(NH4)2SO40.03～0.05％，NaCl0.02～0.03％，KCl0.02～0.03％，Ca3(PO4)20.1～0.2％，MgSO4·7H2O0.02～0.03％，MnSO4·4H2O0.001～0.003％，余量为水，pH7.0～7.2；
(2)按10～12％接种量，将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为1000L/h，罐压保持在0.01～0.03MPa条件下培养36～48h，得到二级种子液；所述二级种子培养基由以质量分数计的以下成分组成：玉米粉1.5～3％，麸皮粉1～2％，酵母膏0.05～0.3％，蛋白胨0.5～1％，磷矿粉1～2％，MgSO4·7H2O0.01～0.03％，NaCl0.1～0.3％，(NH4)2SO40.03～0.05％，余量为水，pH7.0～7.2；
(3)按10～12％接种量，将二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在28～37℃，转速100rpm/min，通气量为10000L/h、罐压保持在0.01～0.03MPa条件下培养48～72h，培养后的发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的有效活菌数≧1×1010cfu/ml时，将发酵液用医用塑料瓶包装，即为所述微生物解磷制剂，所述发酵培养基与步骤(2)所述二级种子培养基相同。
2.一种微生物解磷制剂，其特征在于：它的活性成分为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KCCGMCCNo.5722的发酵液。
3.一种微生物解磷制剂，其特征在于：所述生物解磷制剂通过权利要求1所述的一种生物解磷制剂的制备方法制备得到。
4.权利要求2或3所述的微生物解磷制剂在降解土壤难溶无机磷中的应用。
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