CN103789224B - 一种具有自生固氮、解磷和解钾能力的土壤杆菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株具有自生固氮、解磷和解钾能力的土壤杆菌，其分类命名为土壤杆菌（Agrobacterium r sp.）X.L.Zhu.SGD06‑8‑33，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5457。该菌株固氮酶活性较高，具有较高的解磷和解钾能力，能够产生一定量的吲哚乙酸和铁载体，无ACC 脱氨酶活性。用含有该菌株的液体或固体菌剂接种玉米、油菜和芥菜等农作物，可以明显促进其生长，提高农作物的产量。该方法工艺简便，原料来源丰富，适于工业化生产。

Description

一种具有自生固氮、解磷和解钾能力的土壤杆菌及应用

技术领域

本发明涉及一株具有自生固氮、解磷解钾能力的土壤杆菌及其应用，该菌株用紫外线-等离子体复合诱变获得，能够促进农作物的生长，属于农业微生物技术领域。

技术背景

氮素是作物生长发育过程中必需的大量元素之一，对作物最终产量的贡献为40%-50%。作物每年都要从土壤中带走大量的氮素，为补充土壤氮素的损失，工业化学氮肥至今仍然是人类向土壤补给氮素的重要来源。虽然化学肥料在促进作物生长、提高粮食产量中发挥了巨大的作用，但长期过量使用化肥会产生一系列问题，如酸沉降、土壤板结、水体富营养化、全球变暖、同温层臭氧耗竭、颗粒物和光化学烟雾形成、饮水和食物中硝酸盐积累等，严重阻碍了农业的可持续发展。

生物固氮可以将空气中的氮气直接转化为植物可利用的氨，供植物生长之需。与施用化学肥料相比，生物固氮毋需消耗非再生能源，固氮产物可直接被植物吸收利用，且不易因挥发、反硝化、淋溶损失而引起农业环境污染。因此开发利用生物固氮资源成为世界各国的研究热点。

生物固氮包括共生固氮、联合固氮和自生固氮。多年来，国内外学者对根瘤菌等共生固氮微生物研究较多，如含茎瘤固氮根瘤菌微生物肥料、慢生根瘤菌、根瘤菌DZY-N33固氮菌剂和固氮噬麦芽窄食单胞菌等均为固氮根瘤菌。根瘤菌肥在低产田或新种植区应用，效果比较显著。但是，一种根瘤菌肥料往往只适用于一种特定的作物，应用范围较窄，且不适于在禾本科粮食作物和非豆科蔬菜作物上应用。

自生固氮菌是一类能够在土壤中独立进行固氮的细菌。据报道, 土壤中自生固氮菌的固氮量可达60 kg·hm^{- 2}·a^{- 1}，虽然与共生固氮体系相比，其固氮量相对较低，但它不需要与特定的植物配合，同时具有资源总量大、分布广泛、适应性强、生产和使用都较为方便等特点。自生固氮微生物可以通过生物固氮途径为水稻、玉米、小麦、棉花、蔬菜、果树等多种农作物提供氮素养分，在农业生产中有巨大的应用潜力。目前，我国用于生产的固氮菌株，其固氮量较低，应用效果不稳定，而且从自然界分离的大部分野生的固氮菌都存在生长缓慢、存活率低、有效期短、固氮和促生长能力较低以及对土壤环境要求苛刻等缺点，不能满足作为促生微生物肥料的需要。为此，需要采用物理和化学诱变进行野生菌种的改性，打破野生菌种的正常代谢，使之产生所需要的目标代谢产物（如提高固氮酶活性）、提高其抗性能力等。

发明内容

本发明的目的之一是通过紫外线-等离子体复合诱变获得一株具有较高自生固氮能力和较高的解磷和解钾能力的土壤杆菌，该菌株能够产生一定量的吲哚乙酸和铁载体，促进植物生长。

本发明的目的之二是提供含有上述土壤杆菌的微生物菌剂及其制备方法。

本发明的目的之三是提供上述土壤杆菌在制备生物固氮菌肥中的应用。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案实现的：

本发明实现过程如下：

一种具有自生固氮、解磷和解钾能力的土壤杆菌，其分类命名为土壤杆菌（Agrobacterium sp.）X.L.Zhu.SGD06-8-33，以下简称SGD06-8-33，已于2011年11月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No.5457。

该菌株具有以下特性：G^-，好氧或兼性厌氧，呈长杆状；在固体培养基A上菌落呈淡黄色，圆形凸起，边缘整齐，菌落周围有透明圈，在无氮固体培养基B上菌落呈白色，圆形，中央凹陷，边缘整齐；其最适的生长温度28~32℃，最适的pH值为6.0~8.0，其固氮酶活性为38.92~49.97nmol·mg^-1·h^-1，解无机磷能力为322.2mg/l，解钾能力为38.6 mg/l，产吲哚乙酸的能力为33.25~45.62μg/ml，产铁载体的能力为0.406~0.63，无ACC脱氨酶活性；

所述固体培养基A组成为：酵母粉5-10g，NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2；

所述的无氮固体培养基B组分为：葡萄糖 10-20 g，KH₂PO₄ 0.2 g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2 g，NaCl 0.15-0.25 g，CaSO₄·2H₂O 0.15- 0.25 g，CaCO₃ 5-8 g，琼脂 15-18 g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2。

本发明土壤杆菌采用紫外线-等离子体复合诱变选育方法获得，为了鉴定SGD06-8-33的系统发育地位，测定了所分离的菌株16Sr RNA序列。

为了鉴定SGD06-8-33的系统发育地位，对所分离的菌株16Sr RNA序列测定。

16Sr RNA序列采用通用引物27FP1（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1429R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR反应体系为：10mMol的dNTP 0.5μl，模板DNA1μl，10×PCR buffer 5μl，25mMol MgCl2 3μl，引物各1μl，TaqDNA 聚合酶0.25μl，ddH2O 37.5μl；预变性：95℃ 3分钟，循环一次；变性：95℃ 1分钟，退火55℃1分钟，延伸72℃ 2分钟，循环35次；终延伸：72℃ 5分钟。1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离、提取目标条带，送北京三博远志公司测序。测序结果如SEQ ID No：1所示。

SEQ ID No：1

TGGGGGGAGCTTACACATGCAGTCGAACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACATACCCTTTCCTGCGGAATAGCTCCGGGAAACTGGAATTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGATTTATCGGGGAAGGATTGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGAGAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCAGAGCTCAACTCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCTCTTGACATTCGGGGTTTGGGCAGTGAGACATTGTCCTTTCAGTTAGGCTGGCCCCAGAACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGGTCGTGAAGATGTTGGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCGGGGAAAAGCCGAGAAGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCTCATGGTCTTACGGGCTGGGCTACCACCGGTGCTACAATGGTGGGTGACGGTGGCAGCGAGAACAGCGAATGTCCGGCCTAATCTCAAGGCATTCCAGTCGGAATGCACTCTGCAACTCGAGGTGCATGAAAATTGGGAAATGC。

该序列与NCBI Genebank数据库中土壤杆菌（Agrobacteriumr sp.）同源性达到99%，因此鉴定SGD06-8-33属于土壤杆菌属。

本发明在具体使用时，是将其制成微生物菌剂。

含有土壤杆菌（Agrobacterium sp.）X.L.Zhu.SGD06-8-33的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)菌种发酵

①将冻存的SGD06-8-33在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有10-15ml液体培养基A的试管中，28-30℃，静置培养15-20小时，得到SGD06-8-33的一级种子液；

所述的液体培养基A组成为：酵母粉5-10g， NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2；

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照3-5%的接种量接入装有50-100ml 发酵培养基C的三角瓶中，28-30℃，130-150rpm，培养15-20小时，得到SGD06-8-33的二级种子液；

所述的培养基C组成为：蔗糖5-10g，淀粉2-3g，豆粕20-30g，KH₂PO₄ 0.2-0.41 g, K₂HPO₄ 0.3-0.52 g, CaCl₂ 0.1-0.2 g, MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2 g ，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，水1000ml，pH 7.0~7.2。

③三级发酵罐发酵

发酵罐体积10L，加入发酵培养基C 7.0L，灭菌并冷却后，将二级培养液按照5-10%的接种量接入发酵罐中，进行发酵培养，罐温28-30℃，搅拌转速为250-280rpm，通风比1：（0.4-0.6），培养48-50 小时，所得即为SGD06-8-33菌悬液；

2）将秸秆粉、草炭土、稻糠用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为50-70:20-30:10-20的比例混合，再加入30-50%的发酵培养基C，再加入一定浓度的钼酸钠和硫酸亚铁，使其中钼酸钠含量为0.2~0.5g/Kg，硫酸亚铁含量为0.05~0.08g/Kg，混合均匀后，用布袋或耐高温塑料袋装，1-1.5Kg/袋，0.1MPa高压灭菌2-3小时，取出冷却备用。

3）将步骤1）中得到的SGD06-8-33菌悬液打入储液罐即得固氮液体菌剂，将发酵液按照100-200ml/kg的剂量与步骤2）中所得的固态基质混匀，28-30℃吸附发酵5-7天，达到每克菌剂中活菌数不低于10⁹CFU，包装后即得到固体固氮菌剂产品。

2、微生物菌剂的使用方法

根据权利要求5所述应用，其特征在于使用方法为：在植物浸种时或植物移栽时以50-100倍的液体菌剂稀释液浸泡种子或植物根部2-4小时，育苗期或生长期灌根采用200-500倍的液体菌剂稀释液10-40ml/Kg土壤剂量浇灌稀释液，整个生长期灌根1-3次；固体固氮菌剂作为基肥和追肥使用，使用剂量为5-20g/Kg土壤。

所述的液体菌剂稀释液为步骤3）所得的固氮液体菌剂与发酵培养基C按照1:50-100或1:200-500的比例混合制备所得；固体固氮菌剂为步骤3）所得的固体固氮菌剂。

本发明土壤杆菌可制备成生物固氮菌肥应用于农业生产。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1）采用等离子体诱变和紫外诱变多次循环处理的方法，传代15次遗传性状稳定，保证了突变菌株的稳定性；

2）提供的自生固氮菌与现有自生固氮菌相比，既具有较高的固氮能力，又具有一定的解磷解钾能力，能够分泌吲哚乙酸、产生铁原子，具有ACC脱胺酶活性等，能够促进植物的生长，提高农作物的产量。

3）本发明的菌剂营养要求简单、易培养、生长周期短、能够进行规模化的大生产。

附图说明

图 1：A为SGD06-8-33在培养基上A的菌落形态；B为在培养基B上的菌落形态；C为SGD06-8-33扫描电镜照片；D为SGD06-8-33革兰氏染色照片；

图 2为SGD06-8-33传代过程中固氮酶活性的稳定性测定；

图 3为施用供试菌剂或肥料后，油菜鲜重、干重和地上部分含氮量的比较，其中A为油菜鲜重比较；B为油菜干重比较；C为油菜地上部分含氮量的比较；

图 4为施用供试菌剂或肥料后，玉米鲜重、干重和地上部分含氮量的比较，其中A为玉米鲜重比较；B为玉米干重比较；C为玉米地上部分含氮量的比较；

图 5为施用供试菌剂或肥料后，芥菜鲜重、干重和地上部分含氮量的比较，其中A为芥菜鲜重比较；B为芥菜干重比较；C为芥菜地上部分含氮量的比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例 1

本发明固氮菌株采用紫外线-等离子体复合诱变选育方法获得，具体步骤如下：

1）以实验室从植物根际筛选的土壤杆菌SGD06作为出发菌株；

2）诱变选育

（1）制备出发菌株SGD06的单细胞悬液

将出发菌株SGD06接种于液体培养基A中，28-32℃，120-150rpm培养15-20小时，离心，用无菌生理盐水洗涤，置于装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞的菌悬液；

所述的培养基A组成为：酵母粉5-10g， NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2。

（2）紫外线诱变

将步骤（1）所得的菌悬液分别调节浓度至10⁵-10⁷个/ml，取0.1ml分别涂布于无氮固体培养基B上，进行紫外诱变，紫外诱变的频率为10-18W，照射距离为25-50cm，照射时间5-10min；28-32℃静置培养5-7天，各挑选20-30个较大的单菌落，进行摇瓶复筛，用乙炔还原法测定各菌株的固氮酶活性，选择5株固氮酶活性最高的菌株，再分别作摇瓶复筛，选出一株固氮酶活性高且稳定性好的菌株SGD06-8，制成菌悬液用于下一步等离子体的诱变；

所述的无氮固体培养基B组分为：葡萄糖 10-20g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2g，NaCl 0.15-0.25g，CaSO₄·2H₂O 0.15- 0.25g，CaCO₃ 5-8g，琼脂 15-18g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2；

所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：首先对上述分离得到的20-30个接种到100ml 上述的液体培养基A中，培养15-20小时。各取5ml 菌液接种到装有100ml液体培养基D的250ml的锥形瓶中，28℃，150rpm摇床振荡培养48小时后，将棉塞换成橡胶塞，封口膜滴蜡密封，注射器抽取10-15%的空气，注入10-15%的乙炔气体，继续反应，用乙炔还原法测定固氮酶活性；

所述的液体培养基D所含组分为：葡萄糖 10-20 g， KH₂PO₄ 0.2-0.41 g, K₂HPO₄ 0.3-0.52g，CaCl₂ 0.1-0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g, 蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2。

（3）等离子体诱变

将步骤（2）所得的SGD06-8菌株，制成10⁵-10⁷个/ml的菌悬液，取0.1-0.2ml分别均匀涂布于无菌培养皿中，将培养皿放到等离子下面的电极上，调节上电极的位置，使得上下电极之间的距离控制在3-8mm左右，调节电压为3-5V，电流为0.5-0.8A，使空气或氩气放电，得到均匀的空气或氩气介质阻挡放电等离子体，放电时间为2-7min。诱变后立即用无菌生理盐水或磷酸盐洗脱，涂布于无氮固体培养基B上，再进行摇瓶复筛，挑出一株固氮酶活性最高的一株菌SGD06-8-33，制成菌悬液用于下一步的诱变；所述的摇瓶复筛的方法同步骤（2）。

（4）将步骤（3）所得的SGD06-8-33菌悬液活菌数调至10⁵-10⁷个/ml，循环重复紫外线诱变→等离子体诱变1-2次，最后得到一株固氮酶活性最高的菌株X.L.Zhu.SGD06-8-33(简称SGD06-8-33)。

上述诱变得到的菌株X.L.Zhu.SGD06-8-33 的性质如下：

1）形态特征

本菌株在固体培养基A上菌落呈乳白色，圆形凸起，边缘整齐，菌落周围呈现淡黄色，其菌落形态如附图1A所示。

所述培养基A组成为：酵母粉5-10g，NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2。

在无氮固体培养基B上菌落呈白色，圆形，中央凹陷，边缘整齐，其菌落形态如附图1B所示。

所述的无氮固体培养基B组分为：葡萄糖 10-20g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2g，NaCl 0.15-0.25g，CaSO₄·2H₂O 0.15- 0.25g，CaCO₃ 5-8g，琼脂 15-18g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2；

在电子显微镜下呈杆状，其形态如附图1C所示。

革兰氏染色阴性，其结果如图1D所示。

2）培养特征

最适生长条件为：最适的生长温度28℃，最适的pH值为7.0，转速150rpm。

3）生理特性

G^-，好氧或兼性厌氧，扫描电镜显示呈短杆状，两端钝圆。

4）功能特性

其固氮酶活性为38.92~49.97nmol·mg^-1·h^-1，解无机磷能力为322.2mg/l，解钾能力为38.6 mg/l；产吲哚乙酸的能力为33.25~45.62μg/ml，产铁载体的能力为0.406~0.63，无ACC脱氨酶活性。

实施例 2 SGD06-8-33产吲哚乙酸（IAA）能力的测定

向装有100 ml 液体培养基A的250 ml 三角瓶中加入浓度为200 μg·ml^-1 的无菌L-色氨酸，将SGD06-8-33接种于50ml液体培养基A中，28℃，150rpm培养20小时后，取100 μ l（用培养基A稀释菌液，使其OD₆₀₀为0.7）菌液接种于上述含有L-色氨酸的液体培养基A中，28℃，150 rpm培养72小时，4000 g，离心10 min，采用分光光度法测定上清液中IAA的浓度。实验结果表明：SGD06-8-33产生IAA浓度为43.72μg/ml。

实施例 3 SGD06-8-33产生铁载体能力的测定

将液体培养基A按每瓶50ml 分装到250ml的三角瓶中，灭菌备用。将SGD06-8-33接种于50ml液体培养基A中，28℃，150rpm培养20小时后，取100 μ l（用培养基A稀释菌液，使其OD₆₀₀为0.7）菌液接种于上述的液体培养基A中，28℃，150 rpm 培养48小时，取上述摇床培养的菌液，3500rpm离心15分钟，取上清液，采用相对吸光度法定量测定上清液中铁载体的含量，A/A r=0.406，说明SGD06-8-33产生铁载体能力较强。

实施例 4 SGD06-8-33解无机磷能力测定

将液体培养基E按每瓶100ml 分装到250ml的三角瓶中，灭菌备用。将SGD06-8-33接种于50ml液体培养基A中，28℃，150rpm培养20小时后，取100 μ l（用培养基A稀释菌液，使其OD600为0.7）菌液接种于上述的液体培养基A中，28℃，150 rpm 培养7天，取上述摇床培养的菌液，10000rpm离心10分钟，取上清液，用钼锑抗法测定上清液中磷含量，上清液中磷含量为322.2mg/l。

所述的培养基E组成为：葡萄糖10g，Ca₃(PO4)₂ 5 g，MgCl₂·6H₂O 5 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH₄)₂SO₄ 0.1 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.0。

实施例 5 SGD06-8-33解钾能力测定

将液体培养基F按每瓶50ml 分装到250ml的三角瓶中，灭菌备用。将SGD06-8-33接种于50ml液体培养基A中，28℃，150rpm培养20小时后，取100 μ l（用培养基A稀释菌液，使其OD600为0.7）菌液接种于上述的液体培养基A中，28℃，150 rpm 培养5天，将装有发酵液的三角瓶置于水浴锅中，在（85±2）℃条件下水浴浓缩到10 ml左右，加入5 ml 6%H₂O₂，浓缩过程中要不断搅拌，重复加入数次6%H₂O₂，至钾细菌的粘液消失。3500rpm离心10分钟，取上清液定容于50 ml容量瓶中，用火焰原子吸收光谱法测定溶液中钾的浓度。实验结果表明：SGD06-8-33解钾能力为38.6 mg/l。

所述的培养基F组成为：蔗糖10.0 g，（NH₄）₂SO₄ 1.0 g，Na₂HPO₄ 2.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，钾长石粉1.0 g，CaCO₃ 1.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4。

实施例 6

按照本发明提供的制备固氮菌剂的方法，制备固氮酶活性高的固氮菌剂，制备的步骤如下：

含SGD06-8-33菌剂的制备包括以下步骤：

1)菌种发酵

①将冻存的SGD06-8-33在37℃条件下快速解冻，按照1%的接种量接入装有10ml液体培养基A的试管中，28℃，静置培养20小时，得到SGD06-8-33的一级种子液；

所述的液体培养基A组成为：酵母粉5g， NaCl 5g，蛋白胨5g，FeSO₄ ·7H₂O 0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.005 g，蒸馏水1000ml，pH 7.2；

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照5%的接种量接入装有100ml 发酵培养基C的三角瓶中，28℃，120rpm，培养20小时，得到SGD06-8-33的二级种子液；

③三级发酵罐发酵

发酵罐体积10L，加入发酵培养基C 7.0L，灭菌并冷却后，将二级培养液按照5%的接种量接入发酵罐中，进行发酵培养，罐温28℃，搅拌转速为250rpm，通风比1:0.4，培养50 小时，所得即为SGD06-8-33菌悬液；

所述的培养基C组成为：蔗糖10g，淀粉3g，豆粕30g，KH₂PO₄ 0.41 g, K₂HPO₄ 0.52 g, CaCl₂ 0.2 g, MgSO₄·7H₂O 0.2 g ，Na₂MoO₄·2H₂O 0.005 g，水1000ml，pH 7.2。

2）将秸秆粉、草炭土、稻糠用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为30:40:30的比例混合，加入50%的发酵培养基C，再加入一定浓度的钼酸钠和硫酸亚铁，使其中钼酸钠含量为0.5g/Kg，硫酸亚铁含量为0.08g/Kg，混合均匀后，用布袋或耐高温塑料袋装，1.5Kg/袋，0.1MPa高压灭菌2小时，取出冷却备用。

3）将步骤1）中得到的SGD06-8-33菌悬液打入储液罐即得固氮液体菌剂，将发酵液按照100ml/kg的剂量与步骤2）中所得的固态基质混匀，28℃，吸附发酵5天，平板计数法计数固氮液体菌剂和固态菌剂中SGD06-8-33数量分别可以达到2.5×10⁹/ml和1.2×10¹⁰CFU/g，包装后即得到固体固氮菌剂产品。

实施例 7

使用实施例6的固体菌剂，其具体步骤为：

盆栽土壤采自陕西省长安县农田土壤，供试土壤的pH为8.37，有机质含量为2.36mg/kg，全氮含量为5.78mg/kg，速效磷含量为20.35mg/kg，速效钾含量为3.75mg/kg。选取大小均匀的油菜种子放入无菌的小三角瓶中，用95%酒精浸泡5min，倒去酒精，加入3% NaClO 溶液表面灭菌2 min，倒去次氯酸钠，用无菌水洗6～8 次。实验共设置5个处理，处理1（CK）为空白对照组，加等量SGD06-8-33死固体菌剂；处理2为加尿素组，处理3(菌肥1)加入市场上较为畅销的国内某公司生产的具有固氮作用的固体菌剂，处理4（菌肥2）加入日本某公司生产具有固氮作用的固体菌剂，名称为“连作降害”、处理5(SGD06-8-33组)加入SGD06-8-33固体菌剂。选用直径14 cm，高30cm的花盆每盆装土1.5 kg，加菌剂组每盆施用上述15 g固体菌剂，均为与细土拌匀后覆在土层上部，每个处理均做3个平行，种植油菜，每盆播种5-6粒种子，出苗后，选择长势均一的油菜，每盆定植3棵，每隔1周浇Fahraeus无氮植物营养液一次，每盆浇50 ml，处理2为加尿素组，每盆浇50 ml 有氮全营养液（成份为在1000 ml Fahraeus 无氮植物营养液中加入0.12 g 尿素），植株生长45天后收获，分别测定植株叶面面积和干重，凯氏定氮法测定植物地上部分全氮含量。

所述的Fahraeus无氮植物营养液组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 0.15 g，MgSO₄·7H₂O 0.12 g，柠檬酸铁 0.005 g，CaCl₂·2H₂O 0.1 g，KH₂PO₄ 0.1 g，Gibson微量元素1 ml，H₂O 1 000 ml，pH 6.5～7.0。

Gibson 微量元素液的组成为：H₃BO₃ 2.86 g，ZnSO₄·7H₂O 0.22 g ，CuSO₄·5H₂O 0.08 g，MnSO₄·4H₂O 2.03 g ，Na₂MoO₄·2H₂O 1.26 g，H₂O 1000 ml。

实验结果如图3所示。从图3结果可以看出：加菌剂或尿素均能够促进油菜的生长，其中SGD06-8-33菌剂促油菜生长效果最佳。加SGD06-8-33菌剂组油菜的干重、叶面面积和地上部分含氮量比空白对照组分别增加了308%、211.9%和108.3%，比加分别尿素组增加了32.4%、8.27%和29.7%，而比菌肥2（日本“连作降害”）分别增加了51%、47.2%和62.0%。因此，SGD06-8-33的促生长效果明显优于其它菌剂和化学氮肥，具有开发为微生物肥料菌株的潜力。

实施例 8

使用本发明提供的固体菌剂用于促进玉米生长，其具体步骤为：

盆栽土壤与种子处理均与实施例7相同，实验共设置5个处理，处理1（CK）为加等量SGD06-8-33死菌剂作为空白对照组，处理2为加尿素组，处理3(菌肥1)为市场上较为畅销的国内某公司生产的具有固氮作用的固体菌剂，处理4（菌肥2）为日本某公司生产的具有固氮作用的固体菌剂“连作降害”、处理5(SGD06-8-33)为加SGD06-8-33固态菌剂组。选用直径24 cm，高35cm的白皮花盆每盆装土15 kg，加菌剂组每盆施用上述150 g固体菌剂，将固体菌剂与土壤按照10g/kg土壤的用量加入土壤并充分混匀，种植玉米，出苗后，每盆保留2 株，每隔1周浇Fahraeus无氮植物营养液一次，每盆浇50 ml，加尿素组每盆浇50 ml 有氮全营养液（成份为在1000 ml Fahraeus 无氮植物营养液中加入0.12 g 尿素），植株生长45天后收获，分别测定植株鲜重和干重，凯氏定氮法测定玉米地上部分含氮量。

实验结果如图4所示。图4结果表明：加菌剂或尿素均能够促进玉米生长，加SGD06-8-33菌剂组玉米的鲜重、干重和地上部分含氮量均明显高于其它处理组。加SGD06-8-33菌剂组玉米的鲜重、干重和地上部分含氮量分别比对照组增加了26.6%、26.6%；和29.7%，比加尿素组分别增加了10.3%、12.3%和24.7%，且SGD06-8-33菌剂对玉米的促生长作用均优于国内某菌剂（菌肥1处理）和日本的“连作降害”（菌肥2处理），且菌肥1对玉米的促生作用优于菌肥2，加SGD06-8-33菌剂组玉米的鲜重、干重和地上部分含氮量分别比菌肥1增加了2.44%、2.28%；和23.9%。

实施例 9

使用本发明提供的液体菌剂用于促进芥菜的生长，其具体步骤为：

盆栽土壤与种子预处理均与实施例7相同，实验分别设空白对照组（CK）、加尿素组和加SGD06-8-33菌剂组。选用直径14 cm，高35cm的白皮花盆每盆装土1.5 kg，种植油菜，出苗后，每盆定植3棵，用1:200的液体菌剂灌根（用发酵培养基E稀释液体菌剂），每盆植物根部灌入15ml菌剂，空白对照组用相应的SGD06-8-33死菌体灌根，每隔1周浇Fahraeus无氮植物营养液一次，每盆浇50 ml，加尿素组每盆浇50 ml 有氮全营养液（成份为在1000 ml Fahraeus 无氮植物营养液中加入0.12 g 尿素），植株生长40天后收获，分别测定植株鲜重和干重，凯氏定氮法测定植物地上部分全氮含量。

实验结果如图5所示。图5结果表明：加菌剂能够明显促进芥菜的生长，加菌剂油菜的鲜重、干重和地上部分含氮量分别比空白对照组增加了30%、20%和122%；比加尿素组分别增加了15.4%、8.22%和18.8%。

TGGGGGGAGCTTACACATGCAGTCGAACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACATACCCTTTCCTGCGGAATAGCTCCGGGAAACTGGAATTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGATTTATCGGGGAAGGATTGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGAGAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCAGAGCTCAACTCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCTCTTGACATTCGGGGTTTGGGCAGTGAGACATTGTCCTTTCAGTTAGGCTGGCCCCAGAACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGGTCGTGAAGATGTTGGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCGGGGAAAAGCCGAGAAGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCTCATGGTCTTACGGGCTGGGCTACCACCGGTGCTACAATGGTGGGTGACGGTGGCAGCGAGAACAGCGAATGTCCGGCCTAATCTCAAGGCATTCCAGTCGGAATGCACTCTGCAACTCGAGGTGCATGAAAATTGGGAAATGC

Claims (4)

1.一种具有自生固氮能力的土壤杆菌，其分类命名为土壤杆菌（Agrobacterium sp.）X.L.Zhu.SGD06-8-33，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5457。

2.含有权利要求1所述土壤杆菌的微生物菌剂。

3.权利要求2所述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)菌种发酵

①将冻存的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）X.L.Zhu.SGD06-8-33在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有10-15ml液体培养基A的试管中，28-30℃，静置培养15-20小时，得到一级种子液；

所述的液体培养基A组成为：酵母粉5-10g， NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，FeSO₄ ·7H₂O 0.005-0.01g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2；

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照3-5%的接种量接入装有50-100ml 发酵培养基C的三角瓶中，28-30℃，130-150rpm，培养15-20小时，得到二级种子液；

所述的发酵培养基C组成为：蔗糖5-10g，淀粉2-3g，豆粕20-30g，KH₂PO₄ 0.2-0.41 g, K₂HPO₄ 0.3-0.52 g, CaCl₂ 0.1-0.2 g, MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2 g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025-0.005 g，水1000ml，pH 7.0~7.2；

③三级发酵罐发酵

发酵罐体积10L，加入发酵培养基C 7.0 L，灭菌并冷却后，将二级培养液按照5-10%的接种量接入发酵罐中，进行发酵培养，罐温28-30℃，搅拌转速为250-280rpm，通风比1:（0.4-0.6），培养48-50 小时，得菌悬液，即为固氮液体菌剂；

2）将秸秆粉、草炭土、稻糠用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为20-30:40-60:20-30的比例混合，加入30-50%的发酵培养基C，再加入钼酸钠和硫酸亚铁，使其中钼酸钠含量为0.2~0.5g/Kg，硫酸亚铁含量为0.05~0.08g/Kg，混合均匀后，用布袋或耐高温塑料袋装，1-1.5Kg/袋，0.1MPa高压灭菌2-3小时，取出冷却得固态基质；

3）将菌悬液按照100-200ml/kg的剂量与步骤2）中所得的固态基质混匀，28-30℃吸附发酵5-7天，达到每克菌剂中活菌数不低于10⁹CFU，包装后即得到固体固氮菌剂。

4.权利要求1 所述土壤杆菌在制备生物固氮菌肥中的应用。