CN104450552A - 一种硫酸盐还原菌-解磷菌及其在联合修复镉污染土壤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有抗重金属Cd生长和硫酸盐还原活性的菌株b和具有抗重金属Cd生长和解磷能力的菌株，其分类命名分别为：路德维希肠杆菌（ Enterbacter ludwigii ）SRB-2-5u-2和解糖假苍白杆菌（ Pseudochrobactrum saccharolyticum ）LB-4-4-1c，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明能够同时修复土壤表层、较深层和植物根际土壤，降低Cd对地表水和地下水的污染，同时还能够提高土壤的活性和肥力。

Description

一种硫酸盐还原菌-解磷菌及其在联合修复镉污染土壤中的应用

技术领域

本发明涉及一种硫酸盐还原菌-解磷菌及其在联合修复镉污染土壤中的应用，属于环境微生物技术领域。

背景技术

镉是环境中迁移性和毒性最强的重金属元素之一。目前，全球每年排放约3.0×10⁴t镉，过去50年间，排放到全球环境中的Cd约有2.20×10⁴t，其中94%进入土壤，致使世界各国的土壤出现不同程度的Cd污染。据统计，目前我国Cd污染的农田已超过20×10⁴ hm²，涉及11个省市25个地区，每年生产Cd含量超标农产品14.6×10⁸ kg。湖南省污染稻田镉含量为2.8-51.3 mg/kg，为土壤环境质量标准值（二级）的 9.3-171倍。沈阳张土污灌区严重污染区大米中含Cd含量达1-2 mg/kg。保定市污灌区土壤中Cd的检出超标率为87.5％，蔬菜中 Cd 的检出超标率为89.3％。

镉是蓄积性毒物，其毒性是潜在的，且治疗极为困难。土壤中过量的Cd易被植物吸收和积累, 影响植物的生长、细胞分裂及代谢活动, 造成农作物产量和品质下降。长期食用高Cd含量的食物，可以引起肾脏、肺、胎盘、心血管系统、免疫系统、生殖系统和骨矿密度降低等多种疾病。1992年，镉的化合物被国际癌症研究中心(IARC)确认为IA级致癌物，美国毒性物质管理委员会(ATSDR)列为第6位危害人体健康的有毒物质，联合国环境规划署(UNEP) 提出12种具有全球性意义的危险化学物质，镉被列为首位。

目前对于镉污染土壤的治理，主要是通过物理、化学、生物等方法。物理法工程量大，费用高。化学法操作简便，但费用较高，易导致土壤二次污染。生物修复法是一种很有前景的修复方法，目前研究较多的是超富集植物提取修复技术。但是，由于已发现的Cd超富集植物生物量小，修复周期长，目前仍难以用于实际的Cd污染土壤的修复。此外，我国人口众多，已查明受污染或污染情况不明的农田面积很大，现实情况是不得不在受重金属污染或污染情况不明的农田进行农作物生产。但是, 利用超富集植物修复技术历时长且占用大量的农田, 不适宜在污染农田大面积推广应用。

微生物修复技术主要包括微生物固定和微生物转化。微生物能够通过吸附和富集作用或产生某些代谢产物如草酸、磷酸盐和S^2-等物质与重金属形成沉淀，固定土壤中的重金属，降低重金属的生物可利用性，使其转变为潜在的生物可利用态或残渣态。

硫酸盐还原菌(Sulfate-Reducing Bacteria，简称SRB)能够将环境中的SO₄ ^2- 转化为S^2-，S^2-能够与金属离子反应生成硫化物沉淀，达到固定重金属的目的。目前SRB广泛应用于重金属污染废水的处理，而用于土壤修复的报道甚少。在Cd的化合物中，CdS的溶解度最低，其次是磷酸镉。采用SRB修复土壤Cd污染，由于Cd²⁺在土壤中具有很强的亲硫性，S^2-与土壤中的Cd²⁺快速反应生成溶解度很低的CdS沉淀，同时，SRB还原SO₄ ^2- 的过程中还能够生成碱性物质，提高土壤的pH，有利于酸性土壤的修复。研究表明：SRB在土壤的表层、较深层和植物根际都能够大量生长。但是，在镉污染的土壤中野生型SRB的生长受到抑制，另外，形成的CdS在有氧条件下易被氧化为CdSO₄，使Cd的移动性增加。据报道，在植物根际和土壤表层，CdS易被氧化为CdSO₄。因此，在水田晒田期间或旱田中，土壤表层和植物根际的Cd由于氧化作用而导致移动性增加。

发明内容

本发明目的之一是针对现有技术存在的问题，从Cd污染矿区土壤中分别筛选出一株具有较高抗镉生长能力的SRB和解磷菌，通过紫外线-等离子体复合诱变进一步提高SRB的抗镉生长能力和硫酸盐还原活性，获得一株具有高抗镉生长能力和在有氧和缺氧条件下均具有高效硫酸盐还原能力的SRB，通过紫外线-等离子体复合诱变获得具有高抗镉生长能力和解磷能力的解磷菌，该菌株还具有一定的解有机磷能力，能够产生一定量的吲哚乙酸等植物生长刺激因子，促进植物生长；

本发明的目的之二是提供含有上述SRB和解磷菌的微生物菌剂及其制备方法；

本发明的目的之三是提供上述SRB和解磷菌在联合修复土壤Cd污染中的应用。

具有抗重金属Cd生长和硫酸盐还原活性的菌株SRB-2-5u-2b和具有抗重金属Cd生长和解磷能力的菌株LB-4-4-1c，其分类命名分别为：

路德维希肠杆菌（Enterbacter ludwigii） SRB-2-5u-2b，已于2014年1月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No.8801；

解糖假苍白杆菌（Pseudochrobactrum saccharolyticum）LB-4-4-1c，已于2014年1月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No.8749。

含有上述菌株SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的微生物菌剂，其制备方法包括：

1）含菌株SRB-2-5u-2b微生物菌剂的制备方法

①菌种活化

将冻存的SRB-2-5u-2b在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有10-15ml液体培养基A的试管中，30-35℃，静置培养8-12小时，得到SRB-2-5u-2b的一级种子液；

所述的液体培养基A的组成为：K₂HPO₄ 0.5-0.8g，（NH₄）₂SO₄ 2.5-3.0g，NaHCO₃ 0.3-0.5g，CaCl₂ 0.2-0.3g，MgSO₄ 1.0-1.5g，酵母膏1.0-1.5g，乳酸钠1.0-2.0ml，蒸馏水1000ml；pH 7.0~7.2，121℃灭菌20min；L-半胱氨酸分别用无菌蒸馏水配制为50 mg/ml，用0.25μm的无菌过滤器过滤后，临用前以1-2ml/100ml的比例加入已灭菌的培养基中并充分混合均匀；

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照3-5%的接种量接入装有100-200 ml液体培养基A的厌氧培养瓶中，28-32℃，静置培养8-12小时得到二级培养液；

③发酵罐发酵

将SRB-2-5u-2b的二级培养液按照5-10%的接种量分别接入装有液体培养基A的发酵罐中，进行发酵培养，罐温30-35℃，培养pH7.0-7.5，通氮气培养35-40 小时，得菌悬液，有效活菌数不低于10⁹ CFU/ml，即得SRB-2-5u-2b液体菌剂；

④含菌株SRB-2-5u-2b的固体菌剂的制备

将秸秆粉、草炭土、麸皮和豆粕用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为20-30：20-30：5-10：30-50的比例均匀混合，再按照300-500ml/Kg的比例加入液体培养基B，混合均匀后用耐高温塑料袋装，1-1.5Kg/袋，121℃灭菌2-3小时；L-半胱氨酸盐用无菌蒸馏水配制为50mg/ml，用0.25μm的无菌过滤器过滤后，临用前以10-20ml/Kg的比例加入已灭菌的培养基中并充分混合均匀，即得SRB-2-5u-2b发酵固态基质；

所述的液培养基B组成为：K₂HPO₄ 0.5-0.8g，（NH₄）₂SO₄ 2.5-3.0g，NaHCO₃ 0.3-0.5g，CaCl₂ 0.2-0.3g，MgSO₄ 1.0-1.5g，酵母膏1.0-1.5g，乳酸钠1.0-2.0ml，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml；pH 7.0~7.2，121℃灭菌20min；

将步骤③得到的SRB-2-5u-2b液体菌剂按照50-100ml/kg的剂量与上述所得的SRB-2-5u-2b发酵固态基质混匀，30-35℃培养5-7天，即得SRB-2-5u-2b固体菌剂，有效活菌数不低于10⁹ CFU/g；

2）含菌株LB-4-4-1c微生物菌剂的制备方法

①菌种活化

将冻存的LB-4-4-1c在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有10-15ml液体培养基C的试管中，28-32℃，静置培养8-12小时，得到LB-4-4-1c的一级种子液；

所述的液体培养基C的组成为：胰蛋白胨5-10 g，酵母粉 3-5 g，NaCl 5-10 g，蒸馏水1000 ml，pH值 6.8-7.5，121℃灭菌20min；

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照3-5%的接种量接入装有50-100ml液体培养基C的三角瓶中，28-32℃，150-200rpm培养8-12小时得LB-4-4-1c的二级培养液；

③发酵罐发酵

将LB-4-4-1c的二级培养液按照5-10%的接种量分别接入装有发酵培养基D的发酵罐中，进行发酵培养，罐温28-32℃，培养pH 6.8-7.5，通空气培养30-48小时，得菌悬液，有效活菌数不低于10⁹ CFU/ml，即为LB-4-4-1c液体菌剂；

所述的发酵培养基D组成为：葡萄糖10-15g，麸皮5-10g，豆粕30-50g ，玉米粉3-5g, KH₂PO₄ 5-10g/ml, K₂HPO₄ 0.1-0.2g/ml, Ca₂(PO₄)₃ 5-13 g, MgSO₄·7H₂O 5-10 g ，水1000ml，p H 6.8~7.5，121℃灭菌30min；

④含LB-4-4-1c菌株的固体菌剂的制备

将秸秆粉、草炭土、麸皮和豆粕用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为20-30：20-30：5-10：30-50的比例混合均匀，用耐高温塑料袋装，1-1.5Kg/袋，121℃灭菌2-3小时，即得LB-4-4-1c发酵固态基质；

将上述步骤③所得的LB-4-4-1c液体菌剂按照50-100ml/kg的剂量与上述所得的LB-4-4-1c发酵固态基质混匀，28-32℃发酵5-7天，有效活菌数达到不低于10⁹ CFU/g，即得到固体菌剂；

3）含菌株SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合液体菌剂的制备

将上述所得的SRB-2-5u-2b液体菌剂和LB-4-4-1c液体菌剂按照质量百分比为30-50:50-70的比例混合均匀即得SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合液体菌剂；

4）含菌株SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合固体菌剂的制备

将SRB-2-5u-2b固体菌剂和LB-4-4-1c固体菌剂按照质量百分比为30-50:50-70的比例混合均匀即得SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合固体菌剂。

上述菌株可应用在土壤重金属Cd污染环境治理和生态修复，具体使用方法如下：在植物浸种或植物移栽时，用SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合液体菌剂浸泡种子或植物根部1-3小时；育苗期或生长期灌根时，将上述所得的SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合液体菌剂用液体菌剂稀释液稀释500-1000倍，10-40ml/Kg土壤剂量浇灌稀释液，整个生长期灌根1-2次；SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合固体菌剂可作为基肥和追肥使用，使用剂量为5-20g/Kg土壤；

所述的液体菌剂稀释液组成为：葡萄糖10-15 g，Ca₃(PO₄)₂ 5-13 g，MgCl₂·6H₂O 5 g， KCl 0.2-0.5 g， K₂HPO₄ 0.5-0.8g，（NH₄）₂SO₄ 2.5-3.0g，NaHCO₃ 0.3-0.5g，CaCl₂ 0.2-0.3g，MgSO₄ 1.0-1.5g，酵母膏1.0-1.5g，乳酸钠1.0-2.0ml，L-半胱氨酸0.5-1g，蒸馏水1000ml。

本发明采用硫酸盐还原菌-解磷菌联合修复土壤中的Cd污染能够克服现有技术的缺点。解磷菌能将土壤中植物难以吸收利用的固定态磷转化为可溶性的磷酸根离子，当土壤表层或植物根际的硫化镉被氧化时，可溶性的磷酸根离子与Cd²⁺形成磷酸镉沉淀，降低植物对Cd的吸收。另外，部分解磷菌除具有解磷能力外还可产生铁载体、吲哚乙酸、具有ACC脱胺酶活性等促进植物生长，提高作物的产量。

本发明的有益效果：1）与目前的Cd污染修复方法相比，本发明能够实现边修复边进行农业生产的目的，在修复的同时提高农作物的产量和安全性；2）本发明能够同时修复土壤表层、较深层和植物根际土壤，降低Cd对地表水和地下水的污染，同时还能够提高土壤的活性和肥力；3）本发明既能够修复Cd污染的水田土壤又能够用于旱田土壤的修复。

附图说明

图1为1A为SRB-2-5u-2b 在固体培养基上E的菌落形态；1B为革兰氏染色照片；

图2为SRB-2-5u-2b耐Cd生长能力；

图3为SRB-2-5u-2b系统发育树；

图4为4A为LB-4-4-1c在固体培养基上C的菌落形态，4B为LB-4-4-1c在培养基上F的菌落形态，4C为LB-4-4-1c革兰氏染色照片；

图5为LB-4-4-1c耐Cd生长能力；

图6为LB-4-4-1c系统发育树；

图7为SRB、解磷菌及SRB-解磷菌联合修复Cd污染土壤效果比较；

图8为SRB、解磷菌及SRB-解磷菌联合修复对油菜干重及镉含量的影响，其中8A为施用供试菌剂后，油菜地上部分干重的比较；8B为油菜地下部分干重的比较；8C为油菜地上部分含Cd量的比较；8D为油菜地下部分含Cd量的比较；

图9为SRB、解磷菌及SRB-解磷菌联合修复对稻米产量及镉含量的影响，其中9A为施用供试菌剂后，糙米产量的比较；9B为糙米Cd含量的比较；9C为稻米秸秆Cd含量的比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1  高效耐镉硫酸盐还原菌株的诱变选育

（一）本发明提供的SRB菌株的诱变选育方法，包括以下步骤：

1）本实验室从Cd污染土壤中筛选的一株兼性厌氧菌SRB-2作为出发菌株；

2）诱变选育

（1）制备出发菌株SRB-2的单细胞悬液

将出发菌株SRB-2接种于液体培养基A中，28-32℃，无菌液体石蜡封面，静置培养36小时，离心，用无菌生理盐水洗涤，置于装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞的菌悬液；

所述的液体培养基A组成为：K₂HPO₄ 0.5-0.8g，（NH₄）₂SO₄ 2.5-3.0g，NaHCO₃ 0.3-0.5g，CaCl₂ 0.2-0.3g，MgSO₄ 1.0-1.5g，酵母膏1.0-1.5g，乳酸钠1.0-2.0ml，蒸馏水1000ml， pH 7.0~7.2，121℃灭菌20min。用无菌蒸馏水配制50 mg/ml的L-半胱氨酸盐，用0.25μm的无菌过滤器过滤后，临用前以1-2ml/100ml的比例加入已灭菌的上述培养基中。

（2）紫外线诱变

将步骤（1）所得的菌悬液调节浓度至10⁵-10⁷个/ml，取0.1-0.2ml分别涂布于含80, 120或200mg/l Cd²⁺的固体培养基A上，进行紫外诱变，紫外诱变的频率为10-18W，照射距离为25-50cm，照射时间5-10min；处理后的平皿在厌氧手套箱中32-35℃静置培养6-7天，各挑选15-20个较大的单菌落，进行厌氧和有氧培养复筛，用硫酸钡沉淀法测定各菌株在厌氧和有氧条件下还原硫酸根离子活性，选出一株在厌氧和有氧条件下硫酸盐还原能力高且耐受Cd²⁺能力强的菌株SRB-2-5，制成菌悬液用于下一步等离子体的诱变；

所述的厌氧条件为：向厌氧培养瓶中加入200ml液体培养基A，将所选菌株分别接入厌氧培养瓶中，且在液面加入10-20ml的液体石蜡封住液面，在厌氧手套箱中32-35℃静置培养6-7天；

所述的有氧条件为：向三角瓶中加入200ml液体培养基A，在有氧条件下，将所选菌株分别接入三角瓶中，32-35℃在生化培养箱中静置培养6-7天。

所述的含Cd固体培养基A组成为：上述液体培养基A中加入CdCl₂ 0.033-0.392g/1000ml，15-20g琼脂粉/1000ml。

（3）等离子体诱变

将步骤（2）所得的SRB-2-5菌株，制成10⁵-10⁷个/ml的菌悬液，取0.1-0.2ml分别均匀涂布于无菌培养皿中，涂布面积大小近似于电极板，将培养皿放到等离子下面的电极上，调节上电极的位置，使上下电极之间的距离为3-8mm，调节电压为3-5V，电流为0.5-0.8A，使空气或氩气放电，得到均匀的空气或氩气介质阻挡放电等离子体，放电时间为2-7min。诱变后立即用无菌生理盐水或磷酸盐洗脱，涂布于含Cd固体培养基A上，各挑选15-20个较大的单菌落，进行厌氧和有氧培养复筛，用硫酸钡沉淀法测定各菌株在厌氧和有氧条件下还原硫酸根离子活性，选出一株在厌氧和有氧条件下硫酸盐还原能力高且耐受Cd²⁺能力强的菌株SRB-2-5u。

（4）将步骤（3）所得的SRB-2-5u菌悬液活菌数调至10⁵-10⁷个/ml，循环重复紫外线诱变→等离子体诱变1-2次，最后得到一株在厌氧和有氧条件下硫酸盐还原能力高且耐受Cd²⁺能力强的菌株SRB-2-5u-2b。

SRB-2-5u-2b与SRB-2相比其在含Cd的液体培养基A中耐受Cd的生长能力和在有氧条件下硫酸盐还原活性均明显提高，其结果见表1。

（二）、SRB-2-5u-2b的生理特性

1）形态特征

本菌株在固体培养基E上菌落呈黑色，圆形，其菌落形态如图1A所示。

所述的固体培养基E组成为：

K₂HPO₄ 0.5-0.8g，（NH₄）₂SO₄ 2.5-3.0g，NaHCO₃ 0.3-0.5g，CaCl₂ 0.2-0.3g，MgSO₄ 1.0-1.5g，酵母膏1.0-1.5g，乳酸钠1.0-2.0ml，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml。PH 7.0~7.2，121℃灭菌20min。（NH₄）₂Fe(SO₄)₂ ，L-半胱氨酸分别用无菌蒸馏水配制为10mg/ml 和50 mg/ml，用0.25μm的无菌过滤器过滤后，临用前分别以5-8ml/100ml和1-2ml/100ml的比例加入已灭菌的培养基中并充分混合均匀。

2）培养特征 

最适生长条件为：最适的生长温度28-35℃，最适的pH值为7.0-7.2。

3）生理特性 

G^-，兼性厌氧，其革兰氏染色结果如附图1B所示。

4）功能特性 

在厌氧条件下，硫酸盐还原率为97.71-100%，在有氧条件下，硫酸盐还原率为57.62-79.32%；

5）耐镉生长能力

在含Cd的液体培养基A中能够耐受120mg/l的Cd²⁺生长，SRB-2-5u-2b在含120mg/l的Cd²⁺的液体培养基B中的生长情况如图2所示。

（三）、SRB-2-5u-2b的16Sr RNA序列测定

采用通用引物27FP1（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1429R（5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’）。PCR反应体系为：10mMol的dNTP 0.5μl，模板DNA1μl，10×PCR buffer 5μl，25mMol MgCl₂ 3μl，引物各1μl，TaqDNA 聚合酶0.25μl，ddH2O 37.5μl；预变性：95℃ 3分钟，循环一次；变性：95℃ 1分钟，退火55℃1分钟，延伸72℃ 2分钟，循环35次；终延伸：72℃ 5分钟。1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离、提取目标条带，送北京三博远志公司测序。测序结果如SEQ ID No:1所示。

CACCATGCAGTCGACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGGAAGAACCCTTACCTACT

选取以上部分序列输入NCBI数据库进行序列比对，利用MEGA 4.1处理比对结果并建立系统发育树（图3）。该菌株与Enterbacter ludwigii strain EN-119同源性达到99%，因此鉴定SRB-2-5u-2b属于路德维希肠杆菌（Enterobacter ludvigii）。

实施例2  耐镉解磷菌株的诱变选育

（一）本发明提供的LB4-4-1c菌株的诱变选育方法，包括以下步骤：

1）以实验室从Cd污染土壤植物根际筛选的具有较高解磷能力的LB-4作为出发菌株；

2）诱变选育

（1）制备出发菌株LB-4的单细胞悬液

将出发菌株LB-4接种于液体培养基C中，28-32℃，150-180rpm培养8-12小时，离心，用无菌生理盐水洗涤，置于装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞的菌悬液；

所述的液体培养基C组成为：胰蛋白胨5-10 g，酵母粉 3-5 g，NaCl 5-10 g，，蒸馏水1000 ml，pH值 6.8-7.5，121℃灭菌20min。

（2）紫外线诱变

将步骤（1）所得的菌悬液分别调节浓度至10⁵-10⁷CFU/ml，取0.1ml涂布于含80, 120或200mg/l Cd²⁺固体培养基C上，进行紫外诱变，紫外诱变的频率为10-18W，照射距离为25-50cm，照射时间5-10min；28-30℃静置培养5-7天，挑选20-30个较大的单菌落，进行摇瓶复筛，用钼蓝比色法测定各菌株的解磷能力，选择5-8株解磷活性最高的菌株，再分别作摇瓶复筛，选出一株解磷活性高且稳定性好的菌株LB-4-4，制成菌悬液用于下一步等离子体的诱变；

所述的摇瓶复筛的步骤是：首先对上述分离得到的20-30个较大的菌株接种到100ml 上述的液体培养基C中，培养8-12小时。取5ml 菌液接种到装有100ml液体培养基F的250ml的锥形瓶中，28-32℃，150rpm摇床振荡培养5-7天；

所述的含镉固体培养基C组成为：胰蛋白胨5-10 g，酵母粉 3-5 g，NaCl 5-10 g，CdCl₂ 0.033-0.392g，蒸馏水 1000 mL，琼脂粉 15-20 g，pH值 6.8-7.5，121℃灭菌20min。

所述的液体培养基F组成为：葡萄糖10-15 g，Ca₃(PO₄)₂ 5-13 g，MgCl₂·6H₂O 5 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，KCl 0.2-0.5 g，(NH₄)₂SO₄ 0.1 -0.2g，琼脂粉 15-20 g，蒸馏水1000 ml, pH 6.8-7.5，121℃灭菌20min。。

（3）等离子体诱变

将步骤（2）所得的LB-4-4菌株，制成10⁵-10⁷CFU/ml的菌悬液，取0.1-0.2ml均匀涂布于无菌培养皿中，将培养皿放到等离子下面的电极上，调节上电极的位置，使得上下电极之间的距离控制在3-8mm左右，调节电压为3-5V，电流为0.5-0.8A，使空气或氩气放电，得到均匀的空气或氩气介质阻挡放电等离子体，放电时间为2-7min。诱变后立即用无菌生理盐水或磷酸盐洗脱，涂布于含80, 120或200mg/l Cd²⁺的固体培养基C上，再进行摇瓶复筛，挑出解磷活性最高的一株菌LB-4-4-1，制成菌悬液用于下一步的诱变；所述的摇瓶复筛的方法同步骤（2）；

（4）将步骤（3）所得的菌悬液活菌数调至10⁵-10⁷CFU/ml，循环重复紫外线诱变→等离子体诱变1-2次，最后筛选出一株耐受重金属Cd且解磷活性最高的菌株LB-4-4-1c。

LB-4-4-1c与LB-4相比其在含Cd的液体培养基D中耐受Cd的生长能力与解无机磷能力均明显提高，其结果见表2。

（二）、LB-4-4-1c的生理特性

1）形态特征

本菌株在固体培养基C上菌落呈乳白色或淡黄色，圆形，其菌落形态如附图4A所示，在固体培养基F上菌落呈乳白色，圆形，其菌落形态如附图4B所示。

2）培养特征 

最适生长条件为：最适的生长温度28-32℃，最适的pH值为6.8-7.5。

3）生理特性 

G^-，好氧或兼性厌氧，其革兰氏染色结果如图4C所示。

4）功能特性 

在液体培养基F中解无机磷能力为1100±10.4 mg/l，能够使液体培养基F的pH从初始的6.8-7.5降至4.03-4.42；在液体培养基G中解卵磷脂能力为95±2.6mg/l，在液体培养基H中解植酸钙能力为460±8.4mg/l；产吲哚乙酸的能力为32.7±1.2mg/l；

所述的液体培养基F组成为：葡萄糖10g，Ca₃(PO4)₂ 5 g，MgCl₂·6H₂O 5 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH₄)₂SO₄ 0.1 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.0。

所述的液体培养基G组成为：蛋白胨：10g, 牛肉膏：3g, NaCl: 5g，大豆卵磷脂2g, 蒸馏水1000 ml, pH 6.8-7.0。

所述的液体培养基H组成为：葡萄糖：10g, (NH₄)₂SO₄ 0.5g, NaCl:0.3g, KCl 0.3g, MgSO₄·7H₂O:0.3g,  FeSO₄·7H₂O 0.3g, MnSO₄·H₂O 0.03g, 植酸钙5g，蒸馏水1000 ml, pH 7.0-7.5。

5）耐镉生长能力

在含Cd的液体培养基B中能够耐受120mg/l的Cd²⁺生长，LB-4-4-1c在含120mg/l的Cd²⁺的液体培养基C中的生长情况如附图5所示。

（三）、LB-4-4-1c的16Sr RNA序列测定

所用引物、PCR方法等均与SRB-2-5u-2b的测定方法相同，测序结果如SEQ ID No:2所示。

CATGCAGTCGACGGTCTCTTCGGAGGCAGTGGCAGACGGGTGAGTAATGCATGGGAATCTACCGTTCTCTACGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATACGCCCTTTTGGGGAAAGATTTATCGGAGAATGATGAGCCCATGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACTTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAGGAACACCA GTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGGTGTTTACACTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCTCTTGACATGCCTATGAATGTTAGTGGAGACACTTTCAGCCTTTCGGGGCGTAGGACACAGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC 

选取以上部分序列输入NCBI数据库进行序列比对，利用MEGA 4.1处理比对结果并建立系统发育树（图6）。该菌株与解糖假苍白杆菌（Pseudochrobactrum saccharolyticum）同源性达到99%，因此鉴定LB-4-4-1c属于解糖假苍白杆菌。

实施例3 SRB-2-5u-2b还原硫酸根活性测定

将SRB-2-5u-2b接种到装有10ml液体培养基A的试管中，液体石蜡封面，35℃静置培养20小时，取100 μ l（用液体培养基A稀释菌液，使其OD600为0.3）菌液接种于液体培养基A中，35℃，分别在厌氧或有氧条件下，静置培养7天，采用硫酸钡沉淀法进行测定其硫酸盐还原活性。所述的厌氧条件为：向厌氧培养瓶中加入200ml液体培养基A，将SRB-2-5u-2b分别接入厌氧培养瓶中，且在液面加入20ml的液体石蜡封住液面，在厌氧手套箱中35℃静置培养7天；所述的有氧条件为：向三角瓶中加入200ml液体培养基A，在有氧条件下将SRB-2-5u-2b接入三角瓶中，35℃在生化培养箱中静置培养7天。

结果表明：在厌氧条件下，SRB-2-5u-2b还原硫酸盐活性为100%，在有氧条件下，其还原硫酸盐活性为79.32%。

实施例4 LB-4-4-1c解磷菌解无机磷、植酸钙、卵磷脂能力测定

将液体培养基F、G或H按每瓶100ml 分装到250ml的三角瓶中，灭菌备用。将LB-4-4-1c分别接种于50ml液体培养基C中，28℃，静置培养36小时后，取100 μ l（用液体培养基C稀释菌液，使其OD600为0.7）菌液接种于上述的液体培养基F、G或H中，28℃，150rpm培养7天，取上述摇床培养的菌液，10000rpm离心10分钟，取上清液，用钼锑抗法测定上清液中磷含量。实验结果表明：LB-4-4-1c解无机磷（磷酸钙）能力为1110.4 mg/l，解卵磷脂能力为97.6mg/l，解植酸钙能高达468.4mg/l。

所述的液体培养基C组成为：胰蛋白胨5 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，，蒸馏水 1000 ml，pH值 6.8-7.5。

所述的液体培养基F组成为：葡萄糖10g，Ca₃(PO4)₂ 5 g，MgCl₂·6H₂O 5 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH₄)₂SO₄ 0.1 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.0。

所述的液体培养基G组成为：蛋白胨：10g, 牛肉膏：3g, NaCl: 5g，大豆卵磷脂2g, 蒸馏水1000 ml, pH 6.8-7.0。

所述的液体培养基H组成为：葡萄糖：10g, (NH₄)₂SO₄ 0.5g, NaCl:0.3g, KCl 0.3g, MgSO4·7H₂O:0.3g,  FeSO4·7H₂O 0.3g, MnSO4·H₂O 0.03g, 植酸钙5g，蒸馏水1000 ml, pH 7.0-7.5。

实施例5 SRB-2-5u-2b耐镉生长能力测定

将SRB-2-5u-2b接种于液体培养基A中富集培养，生长至指数期，8000 rpm离心10 min，用0.85%的无菌NaCl溶液洗涤三次后，再用0.85%的无菌NaCl溶液调整菌液浓度为10⁷ CFU/ ml，吸取1 ml加入含有100 ml添加不同浓度Cd²⁺ （0、20、40、80、120或200mg/l） 的液体培养基A的250 ml三角瓶中，Cd²⁺以CdCl₂ 的形式加入，35°C，培养6天后测定OD₆₀₀。结果表明：在Cd²⁺浓度达到 120mg/l时，SRB-2-5u-2b仍能够生长，说明能够耐受较高浓度的Cd²⁺，在污染较为严重的Cd污染土壤中能够生长，具有修复Cd污染土壤的潜力。其结果如附图2所示。

实施例6 解磷菌耐镉生长能力测定

将LB-4-4-1c接种于液体培养基C中富集培养，生长至指数期，8000 rpm离心10 min，用0.85%的无菌NaCl溶液洗涤三次后，再用0.85%的无菌NaCl溶液调整菌液浓度为10⁷ CFU/ ml，吸取1 ml加入含有100 ml添加不同浓度Cd²⁺ （0、20、40、80、120或200mg/l） 的液体培养基C的250 ml三角瓶中，Cd²⁺以CdCl₂ 的形式加入，28°C，150rpm培养，培养6天后测定OD₆₀₀。结果表明：在Cd²⁺浓度达到120mg/l时，LB-4-4-1c仍能够生长，说明能够耐受较高浓度的Cd²⁺，在污染较为严重的Cd污染土壤中能够生长，具有修复Cd污染土壤的潜力。其结果如附图5所示。

实施例7 SRB菌剂的制备

SRB-2-5u-2b微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

①菌种活化

将冻存的SRB-2-5u-2b在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有10-15ml液体培养基A的试管中，30-35℃，静置培养8-12小时，得到SRB-2-5u-2b的一级种子液；

所述的液体培养基A的组成为：K₂HPO₄ 0.5-0.8g，（NH₄）₂SO₄ 2.5-3.0g，NaHCO₃ 0.3-0.5g，CaCl₂ 0.2-0.3g，MgSO₄ 1.0-1.5g，酵母膏1.0-1.5g，乳酸钠1.0-2.0ml，蒸馏水1000ml。PH 7.0~7.2，121℃灭菌20min。L-半胱氨酸分别用无菌蒸馏水配制为50 mg/ml，用0.25μm的无菌过滤器过滤后，临用前以1-2ml/100ml的比例加入已灭菌的培养基中并充分混合均匀。

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照3-5%的接种量接入装有100-200 ml液体培养基A的厌氧培养瓶中，28-32℃，静置培养8-12小时；

③发酵罐发酵

将SRB-2-5u-2b的二级培养液按照5-10%的接种量分别接入装有液体培养基A的发酵罐中，进行发酵培养，罐温30-35℃，培养pH7.0-7.5，通氮气培养35-40 小时，得菌悬液，有效活菌数不低于10⁹ CFU/ml，即为SRB-2-5u-2b液体菌剂；

④含菌株SRB-2-5u-2b的固体菌剂的制备

将秸秆粉、草炭土、麸皮和豆粕用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为20-30：20-30：5-10：30-50的比例均匀混合，再按照300-500ml/Kg的比例加入液体培养基B，混合均匀后用耐高温塑料袋装，1-1.5Kg/袋，121℃灭菌2-3小时。L-半胱氨酸盐用无菌蒸馏水配制为50mg/ml，用0.25μm的无菌过滤器过滤后，临用前以10-20ml/Kg的比例加入已灭菌的培养基中并充分混合均匀，即得SRB-2-5u-2b发酵固态基质。

所述的液培养基B组成为：K₂HPO₄ 0.5-0.8g，（NH₄）₂SO₄ 2.5-3.0g，NaHCO₃ 0.3-0.5g，CaCl₂ 0.2-0.3g，MgSO₄ 1.0-1.5g，酵母膏1.0-1.5g，乳酸钠1.0-2.0ml，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml。PH 7.0~7.2，121℃灭菌20min。

将步骤③得到的SRB-2-5u-2b液体菌剂按照50-100ml/kg的剂量与上述所得的SRB-2-5u-2b发酵固态基质混匀，30-35℃培养5-7天，即得SRB-2-5u-2b固体菌剂，有效活菌数不低于10⁹ CFU/g。

实施例8 解磷菌菌剂的制备

含菌株LB-4-4-1c微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

①菌种活化

将冻存的LB-4-4-1c在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有10-15ml液体培养基C的试管中，28-32℃，静置培养8-12小时，得到LB-4-4-1c的一级种子液；

所述的液体培养基C的组成为：胰蛋白胨5-10 g，酵母粉 3-5 g，NaCl 5-10 g，，蒸馏水1000 ml，pH值 6.8-7.5，121℃灭菌20min。

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照3-5%的接种量接入装有50-100ml液体培养基C的三角瓶中，28-32℃，150-200rpm培养8-12小时；

③发酵罐发酵

将LB-4-4-1c的一级培养液按照5-10%的接种量分别接入装有发酵培养基D的发酵罐中，进行发酵培养,罐温28-32℃，培养pH6.8-7.5，通空气培养30-48小时，得菌悬液，有效活菌数不低于10⁹ CFU/ml，即为LB-4-4-1c液体菌剂；

所述的发酵培养基D组成为：葡萄糖10-15g，麸皮5-10g，豆粕30-50g ，玉米粉3-5g, KH₂PO₄ 5-10g/ml, K₂HPO₄ 0.1-0.2g/ml, Ca₂(PO₄)₃ 5-13 g, MgSO₄·7H₂O 5-10 g ，水1000ml，p H 6.8~7.5，121℃灭菌30min。

④含LB-4-4-1c菌株的固体菌剂的制备

将秸秆粉、草炭土、麸皮和豆粕用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为20-30：20-30：5-10：30-50的比例混合均匀，用耐高温塑料袋装，1-1.5Kg/袋，121℃灭菌2-3小时，即得LB-4-4-1c发酵固态基质。

将上述步骤③所得的LB-4-4-1c液体菌剂按照50-100ml/kg的剂量与上述所得的LB-4-4-1c发酵固态基质混匀，28-32℃发酵5-7天，有效活菌数达到不低于10⁹ CFU/g，即得到固体菌剂。

实施例9 SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合液体菌剂的制备

将实施例7和实施例8所得的SRB-2-5u-2b液体菌剂和LB-4-4-1c液体菌剂按照质量百分比为30-50:50-70的比例混合均匀即得SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合液体菌剂。

将实施例7和实施例8所得的SRB-2-5u-2b固体菌剂和LB-4-4-1c固体菌剂按照质量百分比为30-50:50-70的比例混合均匀即得SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合固体菌剂。

实施例10 SRB-解磷菌联合修复土壤Cd污染

具体步骤为：

1）供试土壤Cd含量为1.62mg/kg，供试土壤的pH为8.37，有机质含量为2.36mg/kg，全氮含量为 5.78mg/kg，速效磷含量为 20.35mg/kg，速效钾含量为3.75mg/kg。土壤经风干后过3mm筛, 充分混匀后装入直径为14 cm、高24 cm的花盆，每盆装土1.5 kg。分别按照0、20、40、80、120 或200mg Cd²⁺ /kg土壤的剂量加入CdCl₂溶液，每个剂量组设12个平行，充分混匀后每隔5天浇一次去离子水，室温平衡30天；

2）将上述制备的每盆土壤分别取出100g加入100ml塑料离心管中，每个剂量组分为A、B、C、D 4组，每组3个平行，其中A组为对照组，每管加入20ml液体菌剂稀释液C，B组每管加入20ml LB-4-4-1c液体菌剂、C组每管加入20ml SRB-2-5u-2b液体菌剂，D组每管加入10ml LB-4-4-1c液体菌剂和10ml SRB-2-5u-2b液体菌剂，各组充分混匀后，每隔1周各组均加入10ml蒸馏水，搅拌均匀，室温培养30天后，直接取湿润的土壤加入1M的MgCl₂溶液（按照每克干土加入8 ml 浓度为1M的MgCl₂溶液），pH 7.0，25±1℃，150rpm振荡提取1小时，8000rpm离心15分钟，取上清液用火焰原子吸收光谱法测定土壤中水溶-可交换态Cd的含量。结果表明：加入菌剂组与对照组相比均能够明显降低土壤中水溶-可交换态Cd的含量，其中D组土壤中水溶-可交换态Cd的含量最低，对水溶-可交换态Cd的固定效率为45.5%-91.7%，A组和B组的固定效率分别为39.5%-71.0%和30.1%-55%。因此，SRB和解磷菌联合修复Cd污染土壤效果最佳。结果见附图7。

实施例11 SRB-解磷菌联合修复对减少油菜中镉含量的作用

将实施例7、8、9所得的SRB-2-5u-2b、LB-4-4-1c及LB-4-4-1c和SRB-2-5u-2b混合液体菌剂分别用液体菌剂稀释液稀释10倍，将实施例9步骤1）制备的盆栽土壤每个剂量组分为A、B、C、D 4组，每组3个平行，其中A组为对照组，每盆土壤中加入150ml液体菌剂稀释液， B组每盆加入150ml稀释后的 LB-4-4-1c液体菌剂、C组每盆加入150ml 稀释后的SRB-2-5u-2b液体菌剂，D组每盆加入150ml 稀释后的LB-4-4-1c和SRB-2-5u-2b混合液体菌剂，各组充分混匀后，25℃静置一周。

选取大小均匀的油菜种子（四月慢）放入灭菌小三角瓶中，用95%酒精浸5分钟，倒去酒精，加入3% NaClO溶液表面灭菌2分钟，倒去次氯酸钠，用无菌水洗 6～8次。盆栽育苗，待苗长出四个子叶，选取长势良好，大小均一的油菜苗移栽到上述四组花盆内，每盆定苗5株。，每隔2周浇Hongland 无磷植物营养液一次，每盆浇50ml，植株生长45天后收获，分别测定植株地上和地下部分干重，石墨炉原子分光光度计法测定植物地上和地下部分Cd含量。

所述的液体菌剂稀释液组成为：葡萄糖10-15 g，Ca₃(PO₄)₂ 5-13 g，MgCl₂·6H₂O 5 g， KCl 0.2-0.5 g， K₂HPO₄ 0.5-0.8g，（NH₄）₂SO₄ 2.5-3.0g，NaHCO₃ 0.3-0.5g，CaCl₂ 0.2-0.3g，MgSO₄ 1.0-1.5g，酵母膏1.0-1.5g，乳酸钠1.0-2.0ml，L-半胱氨酸0.5-1g，蒸馏水1000ml。

 所述的Hongland 无磷植物营养液的组成为：Ca(NO₃)₂·H₂O 1.18 g，KNO₃ 0.51 g，KCl 1.4g，FeCl₃ 0.005 g，MgSO₄·7H₂O 0.49g，Gibson微量元素液1ml，蒸馏水1000ml，pH 6.8~7.0。

Gibson 微量元素液：H₃BO₃ 2.28g，CuSO₄·5H₂O 0.08g，ZnSO₄·7H₂O 0.22g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.126g，MnSO₄·4H₂O 2.03g，蒸馏水1000 ml。

实验结果表明：加入菌剂组（B、C、D组）油菜地上部分和地下部分干重均高于对照组（A组），其中D组油菜地上部分和地下部分干重分别比对照组高出5.8-57.3%和0.8-38.9%，说明SRB和解磷菌联合修复能够提高油菜的产量。加入菌剂组（B、C、D组）油菜地上部分和地下部分Cd含量均低于对照组（A组），且D组油菜地上部分和地下部分Cd含量最低。因此，SRB和解磷菌联合修复能够同时提高作物的产量和其安全性。结果见附图8。

实施例12 SRB-解磷菌联合修复对减少水稻种Cd含量的作用

采集陕南地区稻田土样，均采自耕层 0~20cm, 供试土壤为潴育性黄褐土，pH 6.3，有机质含量为 25.6mg/kg，全氮含量为 5.78mg/kg，速效磷含量为 8.62mg/kg，速效钾含量为 4.31mg/kg，全Cd含量为 0.28 mg/kg。经风干后过 3 mm 筛, 充分混匀后装入直径 24 cm，高35cm 的塑料水桶中，每盆装土8kg。分别按照0、5、10或15mg Cd²⁺ /kg土壤的剂量加入CdCl₂溶液，每个剂量组设12个平行，充分混匀后每隔5天浇一次去离子水，室温平衡30天；

将上述制备的盆栽土壤每个剂量组分为A、B、C、D 4组，每组3个平行，其中A组为对照组，每盆土壤按照10g/Kg土壤的比例分别加入经过高温灭菌的SRB-2-5u-2b 固体发酵菌剂基质和LB-4-4-1c固体菌剂发酵基质，B组按照20g/Kg土壤的比例加入SRB-2-5u-2b固体菌剂、C组按照20g/Kg土壤的比例加入LB-4-4-1c固体菌剂，D组按照20g/Kg土壤的比例分别加入SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c混合固体菌剂，各组充分混匀后泡水，一周后移栽水稻，水稻品名为金优725，每盆6株。在生长期间，采用分蘖期和灌浆期烤田，其余时间均保持2-3cm水层。成熟后收割，计算糙米产量、石墨炉原子分光光度计法测定糙米和秸秆Cd含量。

实验结果表明：加入菌剂组（D组）糙米的产量均高于对照组（A组），其中D组糙米的产量分别比A、B、C组高出16-60.8%、5.2-29.8%和6.9-41%，说明SRB和解磷菌联合修复能够提高水稻的产量。另外，加入菌剂组（B、C、D组）糙米和秸秆Cd含量均低于对照组（A组），且D组糙米和秸秆Cd含量最低。因此，SRB和解磷菌联合修复能够提高水稻的产量，降低大米中Cd的含量，提高其安全性。结果见附图9。

SRB-2-5u-2b的16Sr RNA序列测定

 

<110> 西北大学

<120>一种硫酸盐还原菌-解磷菌及其在联合修复镉污染土壤中的应用

<160> 2

<170> PatentIn Version 2.1

<210> 1

<211> 939

<212> DNA

<213> 路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii） SRB-2-5u-2b

<220>

<400> 1

CACCATGCAG TCGACGGTAG CACAGAGAGC TTGCTCTCGG GTGACGAGTG GCGGACGGGT 60

GAGTAATGTC TGGGAAACTG CCTGATGGAG GGGGATAACT ACTGGAAACG GTAGCTAATA 120

CCGCATAACG TCGCAAGACC AAAGAGGGGG ACCTTCGGGC CTCTTGCCAT CAGATGTGCC 180

CAGATGGGAT TAGCTAGTAG GTGGGGTAAC GGCTCACCTA GGCGACGATC CCTAGCTGGT 240

CTGAGAGGAT GACCAGCCAC ACTGGAACTG AGACACGGTC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG 300

CAGTGGGGAA TATTGCACAA TGGGCGCAAG CCTGATGCAG CCATGCCGCG TGTATGAAGA 360

AGGCCTTCGG GTTGTAAAGT ACTTTCAGCG GGGAGGAAGG TGTTGTGGTT AATAACCGCA 420

GCAATTGACG TTACCCGCAG AAGAAGCACC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT 480

ACGGAGGGTG CAAGCGTTAA TCGGAATTAC TGGGCGTAAA GCGCACGCAG GCGGTCTGTC 540

AAGTCGGATG TGAAATCCCC GGGCTCAACC TGGGAACTGC ATTCGAAACT GGCAGGCTAG 600

AGTCTTGTAG AGGGGGGTAG AATTCCAGGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATCTGGAGG 660

AATACCGGTG GCGAAGGCGG CCCCCTGGAC AAAGACTGAC GCTCAGGTGC GAAAGCGTGG 720

GGAGCAAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGTCG ACTTGGAGGT 780

TGTGCCCTTG AGGCGTGGCT TCCGGAGCTA ACGCGTTAAG TCGACCGCCT GGGGAGTACG 840

GCCGCAAGGT TAAAACTCAA ATGAATTTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGGT 900

GGTTTAATTC GATGCAACGC GGAAGAACCC TTACCTACT 939

 

<210> 2

<211> 389

<212> DNA

<213> 解糖假苍白杆菌（Pseudochrobactrum saccharolyticum）LB-4-4-1c

<220>

<400> 2

 

CATGCAGTCG ACGGTCTCTT CGGAGGCAGT GGCAGACGGG TGAGTAATGC ATGGGAATCT 60

ACCGTTCTCT ACGGAATAAC TCAGGGAAAC TTGTGCTAAT ACCGTATACG CCCTTTTGGG 120

GAAAGATTTA TCGGAGAATG ATGAGCCCAT GTTGGATTAG CTAGTTGGTG GGGTAAAGGC 180

CTACCAAGGC GACGATCCAT AGCTGGTCTG AGAGGATGAT CAGCCACACT GGGACTGAGA 240

CACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATAT TGGACAATGG GCGCAAGCCT 300

GATCCAGCCA TGCCGCGTGA GTGATGAAGG CCCTAGGGTT GTAAAGCTCT TTCACCGGTG 360

AAGATAATGA CGGTAACCGG AGAAGAAGCC CCGGCTAACT TCGTGCCAGC AGCCGCGGTA 420

ATACGAAGGG GGCTAGCGTT GTTCGGATTT ACTGGGCGTA AAGCGCACGT AGGCGGACTT 480

TTAAGTCAGG GGTGAAATCC CGGGGCTCAA CCCCGGAACT GCCTTTGATA CTGGAAGTCT 540

TGAGTATGGA AGAGGTAAGT GGAATTGCGA GTGTAGAGGT GAAATTCGTA GATATTCGCA 600

GGAACACCAG TGGCGAAGGC GGCTTACTGG TCCATTACTG ACGCTGAGGT GCGAAAGCGT 660

GGGGGAGCAA ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCACGCC GTAAACGATG AATGTTAGCC 720

GTCGGGGTGT TTACACTTCG GTGGCGCAGC TAACGCATTA AACATTCCGC CTGGGGAGTA 780

CGGTCGCAAG ATTAAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC GCACAAGCGG TGGAGCATGT 840

GGTTTAATTC GAAGCAACGC GCAGAACCTT ACCAGCTCTT GACATGCCTA TGAATGTTAG 900

TGGAGACACT TTCAGCCTTT CGGGGCGTAG GACACAGTGC TGCATGGCTG TCGTCAGCTC 960

GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTC 985

Claims (5)

1.具有抗重金属Cd生长和硫酸盐还原活性的菌株SRB-2-5u-2b和具有抗重金属Cd生长和解磷能力的菌株LB-4-4-1c，其分类命名分别为：路德维希肠杆菌（Enterbacter ludwigii）SRB-2-5u-2b，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8801；解糖假苍白杆菌（Pseudochrobactrum saccharolyticum）LB-4-4-1c，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8749。

2.含有权利要求1所述菌株SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的微生物菌剂。

3.权利要求2所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括：

1）含菌株SRB-2-5u-2b微生物菌剂的制备方法

①菌种活化

将冻存的SRB-2-5u-2b在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有10-15ml液体培养基A的试管中，30-35℃，静置培养8-12小时，得到SRB-2-5u-2b的一级种子液；

所述的液体培养基A的组成为：K₂HPO₄ 0.5-0.8g，（NH₄）₂SO₄ 2.5-3.0g，NaHCO₃ 0.3-0.5g，CaCl₂ 0.2-0.3g，MgSO₄ 1.0-1.5g，酵母膏1.0-1.5g，乳酸钠1.0-2.0ml，蒸馏水1000ml；pH 7.0~7.2，121℃灭菌20min；L-半胱氨酸分别用无菌蒸馏水配制为50 mg/ml，用0.25μm的无菌过滤器过滤后，临用前以1-2ml/100ml的比例加入已灭菌的培养基中并充分混合均匀；

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照3-5%的接种量接入装有100-200 ml液体培养基A的厌氧培养瓶中，28-32℃，静置培养8-12小时得到二级培养液；

③发酵罐发酵

将SRB-2-5u-2b的二级培养液按照5-10%的接种量分别接入装有液体培养基A的发酵罐中，进行发酵培养，罐温30-35℃，培养pH7.0-7.5，通氮气培养35-40 小时，得菌悬液，有效活菌数不低于10⁹ CFU/ml，即得SRB-2-5u-2b液体菌剂；

④含菌株SRB-2-5u-2b的固体菌剂的制备

将秸秆粉、草炭土、麸皮和豆粕用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为20-30：20-30：5-10：30-50的比例均匀混合，再按照300-500ml/Kg的比例加入液体培养基B，混合均匀后用耐高温塑料袋装，1-1.5Kg/袋，121℃灭菌2-3小时；L-半胱氨酸盐用无菌蒸馏水配制为50mg/ml，用0.25μm的无菌过滤器过滤后，临用前以10-20ml/Kg的比例加入已灭菌的培养基中并充分混合均匀，即得SRB-2-5u-2b发酵固态基质；

所述的液培养基B组成为：K₂HPO₄ 0.5-0.8g，（NH₄）₂SO₄ 2.5-3.0g，NaHCO₃ 0.3-0.5g，CaCl₂ 0.2-0.3g，MgSO₄ 1.0-1.5g，酵母膏1.0-1.5g，乳酸钠1.0-2.0ml，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml；pH 7.0~7.2，121℃灭菌20min；

将步骤③得到的SRB-2-5u-2b液体菌剂按照50-100ml/kg的剂量与上述所得的SRB-2-5u-2b发酵固态基质混匀，30-35℃培养5-7天，即得SRB-2-5u-2b固体菌剂，有效活菌数不低于10⁹ CFU/g；

2）含菌株LB-4-4-1c微生物菌剂的制备方法

①菌种活化

将冻存的LB-4-4-1c在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有10-15ml液体培养基C的试管中，28-32℃，静置培养8-12小时，得到LB-4-4-1c的一级种子液；

所述的液体培养基C的组成为：胰蛋白胨5-10 g，酵母粉 3-5 g，NaCl 5-10 g，蒸馏水1000 ml，pH值 6.8-7.5，121℃灭菌20min；

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照3-5%的接种量接入装有50-100ml液体培养基C的三角瓶中，28-32℃，150-200rpm培养8-12小时得LB-4-4-1c的二级培养液；

③发酵罐发酵

将LB-4-4-1c的二级培养液按照5-10%的接种量分别接入装有发酵培养基D的发酵罐中，进行发酵培养，罐温28-32℃，培养pH 6.8-7.5，通空气培养30-48小时，得菌悬液，有效活菌数不低于10⁹ CFU/ml，即为LB-4-4-1c液体菌剂；

所述的发酵培养基D组成为：葡萄糖10-15g，麸皮5-10g，豆粕30-50g ，玉米粉3-5g, KH₂PO₄ 5-10g/ml, K₂HPO₄ 0.1-0.2g/ml, Ca₂(PO₄)₃ 5-13 g, MgSO₄·7H₂O 5-10 g ，水1000ml，p H 6.8~7.5，121℃灭菌30min；

④含LB-4-4-1c菌株的固体菌剂的制备

将秸秆粉、草炭土、麸皮和豆粕用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为20-30：20-30：5-10：30-50的比例混合均匀，用耐高温塑料袋装，1-1.5Kg/袋，121℃灭菌2-3小时，即得LB-4-4-1c发酵固态基质；

将上述步骤③所得的LB-4-4-1c液体菌剂按照50-100ml/kg的剂量与上述所得的LB-4-4-1c发酵固态基质混匀，28-32℃发酵5-7天，有效活菌数达到不低于10⁹ CFU/g，即得到固体菌剂；

3）含菌株SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合液体菌剂的制备

将上述所得的SRB-2-5u-2b液体菌剂和LB-4-4-1c液体菌剂按照质量百分比为30-50:50-70的比例混合均匀即得SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合液体菌剂；

4）含菌株SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合固体菌剂的制备

将SRB-2-5u-2b固体菌剂和LB-4-4-1c固体菌剂按照质量百分比为30-50:50-70的比例混合均匀即得SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合固体菌剂。

4.权利要求1所述菌株在土壤重金属Cd污染环境治理和生态修复中的应用。

5.权利要求2所述微生物菌剂的使用方法，其特征在于：在植物浸种或植物移栽时，用SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合液体菌剂浸泡种子或植物根部1-3小时；育苗期或生长期灌根时，将上述所得的SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合液体菌剂用液体菌剂稀释液稀释500-1000倍，10-40ml/Kg土壤剂量浇灌稀释液，整个生长期灌根1-2次；SRB-2-5u-2b和LB-4-4-1c的混合固体菌剂可作为基肥和追肥使用，使用剂量为5-20g/Kg土壤；

所述的液体菌剂稀释液组成为：葡萄糖10-15 g，Ca₃(PO₄)₂ 5-13 g，MgCl₂·6H₂O 5 g， KCl 0.2-0.5 g， K₂HPO₄ 0.5-0.8g，（NH₄）₂SO₄ 2.5-3.0g，NaHCO₃ 0.3-0.5g，CaCl₂ 0.2-0.3g，MgSO₄ 1.0-1.5g，酵母膏1.0-1.5g，乳酸钠1.0-2.0ml，L-半胱氨酸0.5-1g，蒸馏水1000ml。