CN110004082A - 一种适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌剂及应用,具体为一种高效解磷，并具有好氧反硝化功能的细菌菌株及其菌剂制备，该细菌菌株JP2‑3经16S rRNA鉴定为台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)，于2019年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCC N0.17268。该菌株既能高效活化土壤中的难溶性磷酸盐，又能利用土壤中硝态氮或亚硝态氮作为氮源，同时对植物根系有改善效果，促进植物生长，其菌剂用于设施蔬菜土壤，可减少磷肥使用，消耗硝态氮等氮源污染，从而有利于设施农业土壤的氮磷污染调控与削减。

Description

一种适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种高效解磷，并具有好氧反硝化功能的细菌菌肥及应用，具体为一种适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株及菌肥制备和施用方法，是利用微生物溶解土壤中难溶性磷酸盐，减少磷肥使用，消耗转化土壤中超量的硝酸氮或亚硝酸氮，减少氮源污染，改善植物根系，促进植物对氮磷养分的吸收，从而实现设施农业土壤中氮磷污染调控和消减的目的。
背景技术
20世纪80年代，国家实施“菜篮子”工程，设施蔬菜迅速发展起来，到2016年，全国设施蔬菜面积达5872万亩，并仍保持稳定增长态势。设施蔬菜种植过程中，农民缺乏专业指导，过于追求蔬菜高产带来的经济效益，普遍存在过量施肥和过量灌水的现象。我国化肥用量一直是世界平均用量的3.75倍，是发达国家的8.85倍。而利用率却仅为30％，远远低于世界水平。超量的化肥大部分不能被植物吸收利用，氮磷养分积累严重，通常转化为硝态氮、亚硝态氮以及难溶性磷酸盐，难以被植物利用，导致氮磷污染。
化肥的过量施用，引起土壤肥力下降，氮磷积累严重，农产品质量下降。利用微生物技术，减少化肥施用，促进氮磷养分的转化吸收，是促进解决氮磷积累及污染的重要手段。例如解磷菌可以将难溶性的磷酸盐降解为可利用的形态；反硝化细菌可以将植物难以吸收利用的硝态氮还原为N2或N2O等气态产物。其中微生物还可以改善植物根系，促进植物对氮磷养分的吸收利用。目前已经报道的溶磷微生物有很多种类，主要包括细菌、真菌、放线菌等，其中细菌主要包括假单胞菌、芽孢杆菌、沙门氏菌、埃希氏菌以及少量的节杆菌、金黄杆菌、肠杆菌、伯克氏菌，明串珠菌等，真菌主要有曲霉属、根霉属、镰刀菌、假丝酵母等，而放线菌主要为链霉菌属。针对好氧反硝化细菌主要以假单胞菌、产碱杆菌、副球菌为主，也有不动杆菌、克伯氏菌等种类的报道，主要用于污水处理，少见用于土壤处理。
发明内容
本发明的目的就是针对国内设施农业土壤中存在严重氮磷污染等实际问题和需求而提供一种适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株及应用。本发明的细菌菌株，可以改善植物根系，促进植物生长，同时作为生物菌肥施用。
本发明的技术方案为：
一种适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株，采用的细菌菌株为台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)JP2-3，保藏编号为：CGMCC N0.17268，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明的适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株是从多年连作的设施蔬菜土壤中分离筛选出来的，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏日期为2019年2月27日，保藏编号为：CGMCC N0.17268，分类命名为：台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis，参据的生物材料(株)：JP2-3。
本发明的适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株在土壤中解磷、反硝化功能方面的应用；进一步为在消耗土壤中硝酸氮、亚硝酸氮，以及活化土壤中难溶性磷酸盐方面的应用。
本发明的适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株在设施蔬菜根系改善及促进植物生长方面的应用。
本发明的适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株的应用，具体为将台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)JP2-3制备成菌肥制品，该菌肥有效成分为活体台湾假单胞菌JP2-3≥5×108cfu/g。
进一步的，所述菌肥制品为可湿性粉剂，由按重量比的以下成分组成：有机质40～45％，无机养分(N-P2O5-K2O)8～15％，台湾假单胞菌活菌体每克不少于5亿，含水量控制在10～15％，pH 5.5-7.5。
本发明的菌肥制品的制备是由细菌发酵菌液按重量比1％与腐熟有机培养基质混合，通过二次固态扩大发酵培养制备；并通过添加硫酸铵，调节氮磷钾含量。
进一步的，本发明上述所述的细菌发酵菌液的制备具体包括以下步骤：将活化的台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)JP2-3菌种，转接于LB液体培养基中，置于28～30℃摇床，140rpm/m,培养18～24h,得种子液；将种子液按1％比例无菌条件下接种至液体发酵培养基，于28～30℃，140～200r/min，培养36～48h，得到JP2-3菌株的细菌发酵菌液；所述的液体发酵培养基配方为：玉米粉3％，豆粕粉1％，葡萄糖0.5％，硝酸铵0.2％，磷酸氢二钠0.2％，碳酸钙0.2％，硫酸镁0.05％，余量为水，pH7.0-7.5。
进一步的，所述的腐熟有机培养基质的制备具体包括以下步骤：将玉米秸秆粉碎过20目，与禽畜粪便混合，C/N调整至25±2，含水量在50-60％，堆肥，设堆长10米，宽5米，堆高1米；每3天翻堆一次，连续堆肥15-20天；待物料温度降至30℃以下,即得腐熟有机培养基质，用于所述菌株的二次固态扩大发酵培养。
进一步优选，本发明的细菌菌肥的制备方法，具体包括以下步骤：
a.将活化的台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)JP2-3转接于LB液体培养基中，置于28～30℃摇床，140rpm/m,培养18～24h,得细菌种子液；
b.制备液体发酵培养基：发酵培养基配方为：玉米粉3％，豆粕粉1％，葡萄糖0.5％，硝酸铵0.2％，磷酸氢二钠0.2％，碳酸钙0.2％，硫酸镁0.05％，余量为水，pH7.0-7.5，121℃条件下湿热灭菌60min，冷却，得到细菌液体发酵培养基；
c.将所述步骤a所得种子液按1％比例无菌条件下接种至步骤b液体发酵培养基，于28～30℃，140～200r/min，培养36～48h，得到JP2-3菌株的细菌发酵液，活菌数≥100×108cfu/g；
d.将玉米秸秆粉碎过20目，与禽畜粪便混合，C/N调整至25±2，含水量在50-60％，堆肥，设堆长10米，宽5米，堆高1米；每3天翻堆一次，连续堆肥15-20天；待物料温度降至30℃以下,得到腐熟有机肥基质；
e.将所述步骤c所获JP2-3菌株的细菌发酵液按重量比1％的比例与步骤d所得的腐熟有机肥基质吸附混合，进行二次固态扩大发酵培养7-10天，活菌数不少于5亿/克。
f.通过添加硫酸铵调整无机养分(N-P2O5-K2O)达8-15％，调整pH5.5-7.5,含水量10-15％，即为所述细菌菌肥制品。
本发明的适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株的应用，主要针对设施农业土壤氮磷污染调控，施用方法主要包括沟施、穴施、蘸根、灌根、喷施。
本发明的有益效果为：
本发明所用菌株Pseudomonas taiwanensis JP2-3是从多年设施栽培的蔬菜大棚土壤中分离，对设施蔬菜土壤有较强的适应性，对环境友好，不仅能高效降解难溶磷酸盐，还具有较强的好氧反硝化功能，同时能改善植物根系，促进植物生长。
制成的细菌菌肥，组分中的有机养分利于细菌菌体储存期的存活，施入土壤后，利于在土壤中的存活和定殖；同时可改善土壤理化特征，为植物生长提供速效营养，增加增产功效，利于在现代设施农业蔬菜栽培上推广和应用，具有更高的应用推广价值。
菌肥中有机质及氮磷钾等无机养分，利于细菌菌体的存活和定殖，可改善土壤环境，为植物生长提供速效养分，利于该菌肥在实际生产中的推广和应用。
附图说明
图1为实施例4细菌JP2-3对液体培养基中的难溶性磷的降解效果图。
图2为实施例6中菌剂盆栽条件下对黄瓜植株的促生长效果图。
图3为实施例6中菌剂盆栽条件下解磷及反硝化效果图。
图4为实施例7中菌剂温室条件下对土壤中的氮磷调控效果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株
本发明采用的细菌菌株为台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)JP2-3，是从多年连作的设施蔬菜土壤中分离筛选出来的，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏日期为2019年2月27日，保藏编号为：CGMCC N0.17268。将该菌株16S rRNA序列提交NCBIBlAST进行相似性对比，与台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)BCRC17751相似性100％，鉴定该菌株台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)，16S rRNA基因序列已经提交到了Genbank数据库，登录号MK226961。
实施例2用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌肥及制备
该细菌菌肥的组成成分：有机质40～45％，无机养分(N-P2O5-K2O)8～15％，台湾假单胞菌活菌体每克不少于5亿，含水量控制在10～15％，pH 5.5-7.5。
该细菌菌剂的制备具体包括以下步骤：
a.将台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)JP2-3菌种接入LB固体平板培养基中活化后，转接于LB液体培养基中，置于28～30℃摇床，140rpm/m,培养18～24h,得种子液。
b.制备液体发酵培养基：发酵培养基配方为：玉米粉3％，豆粕粉1％，葡萄糖0.5％，硝酸铵0.2％，磷酸氢二钠0.2％，碳酸钙0.2％，硫酸镁0.05％，余量为水，pH7.0-7.5。121℃条件下湿热灭菌60min,冷却,得到液体发酵培养基。
c.将所述步骤a所得种子液按1％比例无菌条件下接种至步骤b液体发酵培养基，于28～30℃，140～200r/min，培养36～48h，得细菌发酵菌液。
d.将玉米秸秆粉碎过20目，与禽畜粪便混合，C/N调整至25左右，含水量在50-60％，堆肥，设堆长10米，宽5米，堆高1米；每3天翻堆一次，连续堆肥15-20天；待物料温度降至30℃以下,得到腐熟有机培养基质；
e.将所述步骤c所获细菌发酵液按重量比1％的比例与步骤所得的有机培养基质混合进行二次扩大发酵培养，通过添加硫酸铵调整氮磷钾总养分8-15％，调整pH5.5-7.5，含水量10-15％，即为细菌可湿性菌肥制品。
实施例3
促进土壤氮磷污染消减的细菌菌剂的制备
该菌剂的制备包括以下步骤：
本实施案例同实施例2，所不同之处在于：步骤b中，发酵培养基于发酵罐中配比，灭菌。步骤c中，种子液按1％比例无菌条件下接种至步骤b发酵罐液体发酵培养基，罐压0.04～0.06Mpa,温度28～30℃，搅拌速度120r/min，通气量1:0.8～1:1.2。培养时间32～36h。
实施例4
本发明细菌菌株在液体摇瓶条件下对难溶磷的降解试验
步骤一：将保存的台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)JP2-3菌种接入LB平板培养基中活化后，转接于500mL三角瓶中的100mL LB液体培养基中，置于140r/min，30℃摇床活化培养24h，取50mL菌液，于5000r/min离心10min，弃上清，再用0.85％生理盐水洗涤沉淀，再次离心，重复3次，最后用100mL生理盐水制备菌悬液，备用。
步骤二：取1mL菌悬液，接种到100mL无机磷培养基中，30℃，140r/min摇床培养10d。无机磷培养基配方：葡萄糖10g；(NH4)2SO4 0.5g；NaCl 0.3g；KCl 0.3g；MgSO4·7H2O0.3g；FeSO4·7H2O 0.03g；MnSO4·4H2O 0.03g；酵母粉0.5g；Ca3(PO4)2 10g；琼脂18g；蒸馏水1000ml。PH7.0～7.5。
步骤三：121℃灭活40min后加6％H2O2 2滴于三角瓶中,60℃水浴48h以使微生物量磷释放出来。发酵液用无磷滤纸过滤至澄清,定容,用钼锑抗比色法测滤液有效磷含量。结果如图1所示，施用菌剂，活化速效磷68.7％，表现显著的解磷活性。
实施例5
本发明细菌菌株在液体摇瓶条件反硝化能力测定试验
步骤一：同上实施例4制备菌悬液，备用。
步骤二：取1mL菌悬液，接种到100mL反硝化菌培养基中，30℃，140r/min摇床培养48h。所述反硝化菌培养基：KNO3 3.0g；柠檬酸钠5.0g；K2HPO4 1.0g；KH2PO4 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；H2O 1000ml；pH7.2～7.6。
步骤三：取20mL培养液，于8000r/min离心5min，测定上清液中NO3-N的含量，以未接种的培养基作为对照。NO2 --N的测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法；NO3 --N的测定采用紫外分光光度法，结果如表1所示。
表1细菌JP2-3的对硝酸氮和亚硝酸氮的去除率
实施例6
本发明细菌菌剂盆栽条件下应用效果试验
步骤一：同上实施例2制备菌肥，备用。
步骤二：土样取自寿光温室大棚，过筛，自然风干，装入一次性纸杯，每隔纸杯装干土150g。按常规方式播种，每盆种黄瓜种子5粒，出苗后统一留下2株，同时用步骤一制备的菌菌肥1g，用清水20mL稀释，灌根；10d后，再同等剂量灌根一次。
步骤三：二次灌根处理10天后，将整个植株水洗，烘干，分别称量黄瓜植株地上及地下部分干重，结果如图2所示，细菌JP2-3对黄瓜植株具有明显的促生长效果。全取纸杯内的土样，测定土壤中的速效磷含量及硝酸氮指标含量，结果如图3所示，施用菌剂JP2-3可显著增加土壤中速效磷的含量，同时硝态氮含量明显减少。
实施例7
本发明细菌菌肥在设施黄瓜温室的应用效果试验
步骤一：在山东兰陵选择一多年种植的辣椒温室大棚(80×12m)，进行田间应用试验，菌肥制备同实施例2所述。
步骤二：试验共设3个处理，每处理设4陇，每陇2行，每行35棵；各处理均设3个重复。处理(JP2-3)组基肥及追肥均用常规的70％用量，在辣椒移栽前蘸根(步骤一制备菌肥，用灌溉水稀释100倍)，间隔15天后，用本发明菌肥稀释500倍灌根，每棵50mL，连续两次。两个月后，取土样，测定土壤中的速效磷含量及硝酸氮指标含量，并测辣椒产量。对照组均不用本发明菌肥，其中对照1(CK1)组基肥及追肥为常规的70％用量，对照2(CK2)组基肥及追肥按常规100％用量。结果如图4所示，在温室条件下，施用菌剂能有效提高土壤中的速效磷含量，与未减施化肥的处理相当；同时对土壤中硝酸氮有明显地消减。

Claims (9)

1.一种适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株，采用的细菌菌株为台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)JP2-3，保藏编号为：CGMCC N0.17268，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株在土壤中解磷、反硝化功能方面的应用；进一步为在消耗土壤中硝酸氮、亚硝酸氮，以及活化土壤中难溶性磷酸盐方面的应用。
3.如权利要求1所述的适用于设施农业氮磷污染调控的细菌菌株在设施蔬菜根系改善及促进植物生长方面的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，将台湾假单胞菌(Pseudomonastaiwanensis)JP2-3制备成菌肥制品，该菌肥有效成分为活体台湾假单胞菌JP2-3≥5×108cfu/g。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌肥制品为可湿性粉剂，由按重量比的以下成分组成：有机质40～45％，无机养分(N-P2O5-K2O)8～15％，台湾假单胞菌活菌体每克不少于5亿，含水量控制在10～15％，pH 5.5-7.5。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，该菌肥制品的制备是由细菌发酵菌液按重量比1％与腐熟有机培养基质混合，通过二次固态扩大发酵培养制备；并通过添加硫酸铵，调节氮磷钾含量。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的细菌发酵菌液的制备具体包括以下步骤：将活化的台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)JP2-3菌种，转接于LB液体培养基中，置于28～30℃摇床，140rpm/m,培养18～24h,得种子液；将种子液按1％比例无菌条件下接种至液体发酵培养基，于28～30℃，140～200r/min，培养36～48h，得到JP2-3菌株的细菌发酵菌液；
所述的液体发酵培养基配方为：玉米粉3％，豆粕粉1％，葡萄糖0.5％，硝酸铵0.2％，磷酸氢二钠0.2％，碳酸钙0.2％，硫酸镁0.05％，余量为水，pH7.0-7.5。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的腐熟有机培养基质的制备具体包括以下步骤：将玉米秸秆粉碎过20目，与禽畜粪便混合，C/N调整至25±2，含水量在50-60％，堆肥，设堆长10米，宽5米，堆高1米；每3天翻堆一次，连续堆肥15-20天；待物料温度降至30℃以下,即得腐熟有机培养基质，用于所述菌株的二次固态扩大发酵培养。
9.如权利要求2或3或5或6或7或8所述的应用，其特征在于，所述细菌菌肥的施用方法为：沟施、穴施、蘸根、灌根、喷施。
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