CN109355197A - 用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌及其微生物有机肥料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于盐碱地苜蓿生长的促生菌株及其微生物有机肥料，属于畜牧业集约化生产技术。本发明分离到了一株用于促进苜蓿生长的促生菌，该菌株NAU‑T14分类命名为哈茨木霉属(Trichoderma harzianum)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 2018520。本发明提供的利用上述菌株发酵制备的促生生物有机肥营养丰富，可以有效增加土壤微生物多样性，显著促进苜蓿生长。

Description

用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌及其微生物有机肥料
技术领域
本发明涉及用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌株及其微生物有机肥料，属于畜牧业集约化生产技术领域。
背景技术
苜蓿是我国广泛种植的饲用牧草，在所有常见牧草作物中营养价值最高。在盐碱地上由于受到土壤养分及结构的限制，苜蓿的生长也受到明显的抑制。目前中国盐碱地面广量大，西北、华北、东北西部和滨海地区都有分布，其土壤含盐量高、碱性强、肥力弱，生态环境十分脆弱，目前已成为影响地区农牧业发展的主要障碍因素。通过施用有机肥，可以在一定程度上改善土壤理化性质、提高土壤肥力，但是改良效果具有一定的局限性。因此，开发促进盐碱地苜蓿生长的新型肥料，对于盐碱地苜蓿的生产至关重要。
生物有机肥除了含有较高的有机质和养分外，还包含具有特定功能的微生物，并且这些功能型微生物的生命活动是生物有机肥优于普通有机肥的关键因素。功能微生物群体在生命活动周期中会产生大量有机酸，可以有效降低土壤的碱性，并产生腐殖酸钠副产物，刺激植物生长。同时，腐殖酸钠能增强植物的抗盐能力，提高土壤的缓冲能力，促进土壤颗粒团粒化，增加土壤颗粒间的孔隙度和土壤的透水能力，令土壤中的盐分得到充分的淋溶，有效缓解土壤返盐现象。此外，施用生物有机肥，可以在较短期内重建健康并具有活力的土壤微生物区系，有效改善土壤理化性质，达到土壤肥力保育和提高牧草产量的双重目的。因此，将有机肥用于功能菌的载体，制成功能明确的微生物有机肥料，将会有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一株用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌及其应用。
本发明的另一目的在于提供一种微生物有机肥料及其制备方法。所述的用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌及其微生物有机肥料，促生功能明显，能确保畜牧业集约化的顺利发展。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一株用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌，该菌株NAU-T14分类命名为哈茨木霉属(Trichoderma harzianum)，于2018年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018520。
通过形态、生理生化特征及真菌18S rDNA/ITS鉴定NAU-T14菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，其最适生长条件为：培养温度28℃，pH 5.0-6.0，碳源为葡萄糖或蔗糖，置于PDA培养基上培养。木霉菌株NAU-T14生长迅速，在最适条件下培养60h 后，菌落即可全部覆盖平皿(9cm)；菌落初始为棉絮状，颜色为灰白色；当分生孢子成熟后，菌落自中央到边缘，渐渐变为绿色；当菌丝慢慢老化的时候，培养基表面密布致密的墨绿色孢子。
上述的用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌在制备微生物有机肥料中的应用。
一种微生物有机肥料，该微生物有机肥料中包含上述的用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌。
优选的，上述的用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌在微生物有机肥料中的含量不低于 1.0×108CFU/g。进一步优选的，该微生物有机肥料中含有1×108个/g以上的促生菌NAU- T14、全氮含量质量比为3.0～4.5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质含量质量比为30～40％。
一种微生物有机肥料的生产方法，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的促生菌接种到PDA培养液，进行液体发酵得到促生菌发酵液，所述的促生菌发酵液中促生菌孢子数量≥108个/ml；
(2)向粉碎的纯小麦秸秆中添加尿素并接种步骤(1)制备的促生菌发酵液，调节含水量和pH值，然后发酵培养至促生菌产孢量达到1010个/g；
(3)将腐熟的鸡粪堆肥和步骤(2)制备的发酵物按比例混合均匀进行二次固体发酵，发酵结束后促生菌含量达到1.0×108个/g以上，获得促生菌的鸡粪和秸秆堆肥混合物；最后在不超过60℃的条件下将促生菌的鸡粪和秸秆堆肥混合物的含水量蒸发至30％以下，即得到能促进苜蓿植株生长的微生物有机肥。
步骤(1)中，所述液体发酵的发酵条件为：温度为28～30℃，搅拌速度为180～200转/分钟，发酵时间为6～8d(优选为7d)。
步骤(2)中，所述尿素的添加量为所述纯小麦秸秆质量的0.5～1.5％(优选为1％)，所述促生菌发酵液的接种量为8～10％(优选为9％)；调节含水量为65～75％(优选为70％)，调节pH值至4.5-6；所述发酵培养的条件为27～29℃浅盘培养6～8d(优选为28℃浅盘培养 7d)；
步骤(3)中，所述腐熟的鸡粪堆肥和步骤(2)制备的发酵物的混合比例为97～98：2～3(优选为98：2)，所述二次固体发酵的条件为：发酵过程中每天翻堆1次，温度不超过 50℃，发酵6～8天(优选为7天)。
步骤(3)中，所述腐熟的鸡粪堆肥的发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2.0％，含水量质量比25-30％。
上述微生物有机肥料的生产方法的最优选技术方案为：
(1)将上述的促生菌NAU-T14接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，控制发酵温度范围为28～30℃，搅拌速度为180～200转/分钟，发酵时间为7d，保证促生菌发酵液中 NAU-T14孢子数量≥108个/ml。
所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：200g土豆削皮后切成小块放至水中煮，沸腾后煮30min，然后用四层医用纱布过滤，滤液加20g葡萄糖，定容至1000 ml，pH值自然，115℃灭菌30min。
(2)向粉碎的纯小麦秸秆中添加1％(m/m)尿素并接种9％(v/m)促生菌发酵液(3.0×108个/ml)，调节含水量在70％，用0.05mol/L硝酸调节混合物的pH在4.5-6之间，放置在28℃浅盘培养7天，使得木霉产孢量达到1010个/g。
(3)将腐熟的鸡粪堆肥和步骤(2)制备的发酵物按质量比98：2的比例混合均匀进行二次固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，温度不超过50℃，发酵7天，发酵结束后促生菌NAU-T14含量达到1×108个/g以上，获得促生菌NAU-T14的鸡粪和秸秆堆肥混合物的固体混合菌剂。最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为能促进盐碱地苜蓿生长的微生物有机肥。
所述腐熟的鸡粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2.0％，含水量质量比25-30％。
发芽指数＝(堆肥浸提液处理的种子发芽率×堆肥浸提液处理的种子根长)/(对照组的种子发芽率×对照组的种子根长)×100％。公式中“堆肥浸提液”指的是腐熟鸡粪普通肥的浸提液，对照组用的是水。
本发明筛选的哈茨木霉菌株促进苜蓿生长与现有技术中防控作物真菌病害的机理不同。 2011和2013年Nature分别发表根际微生物区系的综述文章，强调了根际微生物区系的重要性，指出：“一个良好的根际微生物区系，具有促进植物生长的功能”，通过引入关键微生物类群来重建土壤微生物区系。施用含有本发明筛选功能菌的生物有机肥，可以在较短期内重建健康并具有活力的土壤微生物区系，有效改善土壤理化性质，达到土壤肥力保育和提高牧草产量的双重目的。本研究中施用木霉生物有机肥料可显著影响土壤微生物的生长，进而提高土壤微生物的多样性。土壤微生物多样性的增加有利于增加生态系统的稳定性，有利于地上部生物量的提高。
本发明与目前市场上的有机肥料产品相比具有如下优点：
(1)该肥料产品中含有促进盐碱地苜蓿生长的专一性高效菌株NAU-T14，其促生效果显著。
(2)该微生物有机肥料养分丰富，为功能菌木霉提供了十分优越的生长环境，有利于肥料中的有益菌株施入土壤后形成优势种群，提高其定殖和发挥功能的能力，可有效改善土壤微生物区系。
(3)该微生物有机肥料方便在大田使用，除了具有有机肥的功能，其中所含的促生菌还可以通过多种促生机制发挥作用，从而达到促进苜蓿生长的目的，增产的同时为牧民增加收入。
(4)由于该产品是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列隐患，有利于牧草的无公害生产，同时利于牧草产品的出口。
四、附图说明
图1不同菌株对苜蓿幼苗的影响
图2用于促进苜蓿生长的促生菌株NAU-T14菌落形态图；
图3 NAU-T14的18S rDNA/ITS鉴定结果图
图4盆栽实验条件下各处理苜蓿的生物量
图5不同处理条件下土壤微生物多样性与苜蓿生物量的关系
具体实施方式
(一)盐碱土中促生菌株的分离、筛选
促生菌株的分离：所用土壤为盐碱土(pH为8.7，电导率为0.54mS cm-1)，采集自山东省农科院东营综合试验站(北纬118°38’15”，东经37°18’26”)，采用稀释涂布的方法进行木霉菌株的筛选，共获得87株木霉菌株，将所有菌株于-80℃甘油保存。
促生菌株的初筛和复筛：由于木霉最主要的促生机制是竞争作用，该机制与木霉的生长速度密切相关，因此，将木霉的生长速度作为初筛指标，得到7株具有代表性的菌株，分别为NAU-T8，NAU-T11，NAU-T14，NAU-25，NAU-T46，NAU-T58，NAU-T78。在此基础上将对苜蓿幼苗生长的影响作为复筛指标进行筛选：将生长速度较快的木霉菌株的木霉菌液分别施入苜蓿幼苗根部，通过观察苜蓿幼苗的生长，筛选出对苜蓿促生最好的菌株(如图 1)，NAU-T14对苜蓿幼苗的促生效果最好。综合初筛、复筛的结果，选定NAU-T14作为最优菌种进行后续的生物有机肥料的生产。
(二)促生菌株的鉴定
促生菌株NAU-T14鉴定为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。
NAU-T14的生物学特性主要为(如图2)：通过形态、生理生化特征及真菌18S rDNA/ITS鉴定NAU-T14菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，其最适生长条件为：培养温度28℃，pH 5.0-6.0，碳源为葡萄糖或蔗糖，置于PDA培养基上培养。木霉菌株 NAU-T14生长迅速，在最适条件下培养60h后，菌落即可全部覆盖平皿(9cm)；菌落初始为棉絮状，颜色为灰白色；当分生孢子成熟后，菌落自中央到边缘，渐渐变为绿色；当菌丝慢慢老化的时候，培养基表面密布致密的墨绿色孢子。
NAU-T14的18S rDNA/ITS鉴定结果如图3。
该菌株2018年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M2018520。
(三)菌剂生产
(1)将促生菌株NAU-T14，接种到PDA培养液中进行液体发酵生产，控制发酵温度范围为28～30℃，搅拌速度为180～200转/分钟，发酵时间为7d，保证促生菌发酵液中 NAU-T14孢子数量≥108个/ml。
(2)将粉碎的纯小麦秸秆(100g)中添加1％(m/m)的尿素，接种9％(v/m， ml/100g)木霉(3.0×108个/ml)，调节含水量在70％，用0.05mol/L硝酸调节混合物的pH 在4.5-6之间，放置在28℃浅盘培养7天，使得木霉产孢量达到1010个/g。
(3)将腐熟的鸡粪堆肥和上述木霉发酵物按质量比98：2的比例混合均匀进行二次固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，温度不超过50℃，发酵7天，发酵结束后促生菌NAU-T14含量达到1×108个/g以上，获得促生菌NAU-T14的鸡粪和秸秆堆肥混合物的固体混合菌剂。最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为能促进苜蓿植株生长的微生物有机肥。
所用腐熟的鸡粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2.0％，含水量质量比25-30％。该微生物有机肥料(促进苜蓿生长的专用微生物有机肥)中含有1×108个/g以上的NAU-T14、全氮含量质量比为3.0～4.5％，全氮中质量比 90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质含量质量比为30～40％。
(四)盆栽促生试验
(1)盆栽实验
实验所用土壤为原位盐碱土，采自山东省农科院东营综合试验站(北纬118°38’15”，东经37°18’26”)，土壤理化性质如下：有机质7.4g kg-1，全氮0.38g kg-1，速效磷66.5mg kg-1，速效钾225.3mg kg-1，电导率0.54mS cm-1，pH 8.7。实验所用苜蓿种子为中苜1号，播种前应进行种子清选；盆栽试验采用双因素试验设计，因素一为肥料处理：CK：不施肥料；OF：施用鸡粪堆肥(1.5％)；BOF：含有NAU-T14的腐熟鸡粪堆肥(1.5％)，因素二为利用方式：刈割、不刈割。每个处理3个区组，每个区组5个重复，总共90盆；每盆1.0kg 土，随机区组排列。整个实验在温室条件下常规管理，收获时测定苜蓿地上部生物量。结果如图4所示，无论在何利用方式下，施用含促生菌NAU-T14的生物有机肥(BOF)的处理，其长势远好于CK和OF处理的苜蓿。
(2)不同处理土壤微生物多样性及与苜蓿生物量的相关关系
如表1所示，细菌和真菌潮指数(SChao1)和香浓指数(HShannon)在不同处理间差异显著。不论在何利用方式下，OF和BOF的细菌SChao1和HShannon均是普遍高于CK的；而真菌的SChao1和HShannon在OF处理中是显著高于其他处理的。图5是不同处理土壤微生物多样性与苜蓿生物量的相关关系。细菌SChao1(图5a，R2＝0.411,P＝0.004)和HShannon(图 5b，R2＝0.220,P＝0.049)均与苜蓿的生物量呈显著正相关关系；而真菌SChao1(图5c，R2＝0.411,P＝0.004)和HShannon(图5d，R2＝0.220,P＝0.049)与苜蓿的生物量没有显著正相关关系。
表1不同处理的土壤微生物多样性
注：CK：不施肥料；CK+M：不施肥料+刈割；OF：施用鸡粪堆肥(1.5％)；OF+M：施用鸡粪堆肥(1.5％)+刈割；BOF：含有NAU-T14的腐熟鸡粪堆肥(1.5％)，BOF+M：含有NAU-T14的腐熟鸡粪堆肥(1.5％)+刈割。
本发明专利从改善土壤结构和丰富微生物多样性的角度着手，研制出一种能显著促进盐碱地苜蓿生长的微生物有机肥料产品。本肥料产品的作用机制在于本肥料产品中的有效碳和有效氮源给产品中的功能菌微生物的培育提供了很好的条件，使之迅速建立外源有益功能菌微生物的生态及其食物链，并有效增加土壤微生物多样性；另一方面，本肥料产品中含有较高含量的养分含量，这些营养物质对苜蓿的生长十分有利，大大提高了苜蓿的立苗率和收获生物量。

Claims (10)

1.一株用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌，该菌株NAU-T14分类命名为哈茨木霉属(Trichoderma harzianum)，于2018年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 2018520。
2.权利要求1所述的用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌在制备微生物有机肥料中的应用。
3.一种微生物有机肥料，其特征在于，该微生物有机肥料中包含权利要求1所述的用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌。
4.根据权利要求3所述的微生物有机肥料，其特征在于，权利要求1所述的用于促进盐碱地苜蓿生长的促生菌在微生物有机肥料中的含量不低于1.0×108CFU/g。
5.根据权利要求3或4所述的微生物有机肥料，其特征在于，该微生物有机肥料采用以下步骤制备：
(1)将权利要求1所述的促生菌接种到PDA培养液，进行液体发酵得到促生菌发酵液，所述的促生菌发酵液中促生菌孢子数量≥108个/ml；
(2)向粉碎的纯小麦秸秆中添加尿素并接种步骤(1)制备的促生菌发酵液，调节含水量和pH值，然后发酵培养至促生菌产孢量达到1010个/g；
(3)将腐熟的鸡粪堆肥和步骤(2)制备的发酵物按比例混合均匀进行二次固体发酵，发酵结束后促生菌含量达到1.0×108个/g以上，获得促生菌的鸡粪和秸秆堆肥混合物；最后在不超过60℃的条件下将促生菌的鸡粪和秸秆堆肥混合物的含水量蒸发至30％以下，即得到能促进苜蓿植株生长的微生物有机肥。
6.一种微生物有机肥料的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的促生菌接种到PDA培养液，进行液体发酵得到促生菌发酵液，所述的促生菌发酵液中促生菌孢子数量≥108个/ml；
(2)向粉碎的纯小麦秸秆中添加尿素并接种步骤(1)制备的促生菌发酵液，调节含水量和pH值，然后发酵培养至促生菌产孢量达到1010个/g；
(3)将腐熟的鸡粪堆肥和步骤(2)制备的发酵物按比例混合均匀进行二次固体发酵，发酵结束后促生菌含量达到1.0×108个/g以上，获得促生菌的鸡粪和秸秆堆肥混合物；最后在不超过60℃的条件下将促生菌的鸡粪和秸秆堆肥混合物的含水量蒸发至30％以下，即得到能促进苜蓿植株生长的微生物有机肥。
7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，所述液体发酵的发酵条件为：温度为28～30℃，搅拌速度为180～200转/分钟，发酵时间为6～8d。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述尿素的添加量为所述纯小麦秸秆质量的0.5～1.5％，所述促生菌发酵液的接种量为8～10％；调节含水量为65～75％，调节pH值至4.5-6；所述发酵培养的条件为27～29℃浅盘培养6～8d。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述腐熟的鸡粪堆肥和步骤(2)制备的发酵物的混合比例为97～98：2～3，所述二次固体发酵的条件为：发酵过程中每天翻堆1次，温度不超过50℃，发酵6～8天。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述腐熟的鸡粪堆肥的发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2.0％，含水量质量比25-30％。
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谢琳淼等: "哈茨木霉对紫羊茅和草地早熟禾的促生及抗性诱导作用", 《草业科学》 *

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