CN110591937B - 防控番茄青枯病的拮抗放线菌和生物有机肥及方法、用途 - Google Patents

防控番茄青枯病的拮抗放线菌和生物有机肥及方法、用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防控番茄青枯病的拮抗放线菌和生物有机肥及方法、用途，该拮抗放线菌G33保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.4.7604，保藏日期为2019年7月15日，其属于细黄链霉菌，将其和沼渣、牛粪、水稻秸秆进行发酵，制作生物有机肥，该生物有机肥改善土壤微生物区系，拮抗放线菌G33能很好的定殖在番茄的根际，并产生拮抗物质，抑制番茄根际病原微生物的生长，从而显著降低连作番茄青枯病的发生，防控率达70％以上。

Description

防控番茄青枯病的拮抗放线菌和生物有机肥及方法、用途
技术领域
本发明涉及一种生防菌株，具体涉及防控番茄青枯病的拮抗放线菌和生物有机肥及方法、用途。
背景技术
微生物防治作物病害的机制主要由竞争作用、拮抗作用、群体感应抑制作用、对植物的诱导抗性作用和促生作用，很多研究表明：生防菌在植物根际的存活、成功定殖是其防控作物病害的关键。传统的生物防控技术是将生防菌制成液体或者粉状菌剂进行喷施，对病原菌的繁殖与入侵得到了有效的防控，但生防菌接种到植物根部后因受贫营养等恶劣条件影响很难定殖，甚至存活，导致防效不稳定，持续性不佳。所以，采用直接利用生防菌防控作物病害存在着一定的局限性，需要开发新型生防菌利用工艺。
针对上述问题，有研究认为，为生防菌提供一种适合生长的有机载体能很好的提高生防菌的防控效果，这为生物防控提供了新的研究思路。将生防菌与有机底物结合后接种到土壤中，能够使生防菌在适应土壤环境的过程中，利用有机载体提供的营养物质，合成自身所需的物质更好的生长繁殖，以根际作为其适合的环境正常生长，不断繁殖最后形成一个较大而稳定优势群体，使其在土壤中的存活时间更长。因此，要求添加的有机物料不仅要作为营养载体为生防菌提供充足的养分供其生长繁殖，还要为作物生长提供充足的养分，从而达到既防病又培肥的作用。然而，施用有机物料来控制作物病害往往获得不一致的结果，与具体的有机物料和土传病原菌的种类有关。
发明内容
本发明提供一种防控番茄青枯病的拮抗放线菌和生物有机肥及方法、用途，该生物有机肥解决了现有生防菌接种到植物根部后很难存活的问题，能够定殖在植物的根际，并产生拮抗物质，抑制植物根际病原微生物的生长。
为了达到上述目的，本发明提供了一种防控番茄青枯病的拮抗放线菌G33，该拮抗放线菌G33保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCCNo.4.7604，保藏日期为2019年7月15日，其属于细黄链霉菌。
本发明还提供了一种所述的拮抗放线菌G33在制备放线菌生物有机肥中的应用，该拮抗放线菌G33对番茄土传病原菌具有拮抗作用，该番茄土传病原菌包含：青枯菌。
本发明还提供了一种所述的拮抗放线菌G33的种子液培养方法，该方法包含：将拮抗放线菌G33的分生孢子接种到灭菌的液体种子培养基中，进行液体种子摇床培养，其培养条件为：培养液初始pH＝7.5，培养温度为28℃，摇床转速为180rpm；所述液体种子培养基的制备包含：以质量比为6：1：9：1的黄豆粉、CaCO3、葡萄糖和酵母粉，于水中，pH 7.5，灭菌。
优选地，所述发酵时间为48h。
优选地，所述发酵结束后离心，得到的菌丝体含量为15％～20％。
优选地，所述液体种子培养基中各组分总质量与水的体积之比为85g：1000mL。
本发明还提供了一种含拮抗放线菌G33的生物有机肥，该生物有机肥包含：沼渣、牛粪、水稻秸秆和所述的种子液培养方法得到的拮抗放线菌G33的种子液；其中，所述沼渣、牛粪和水稻秸秆的质量比为2：2：1，所述拮抗放线菌G33的种子液在生物有机肥中的质量分数为10％～15％。
优选地，该生物有机肥是通过将沼渣、牛粪和水稻秸秆按质量比混合，调节含水率为50％～60％，pH为7.5～8.0，灭菌冷却后接入所述拮抗放线菌G33的种子液，并控制温度为28～30℃，通气量为1～3m3/h，压力控制在0.01～0.05Mpa，间断搅拌进行发酵获得的。
本发明还提供了一种所述的含拮抗放线菌G33的生物有机肥的制备方法，该方法包含：将沼渣、牛粪和水稻秸秆按质量比2：2：1混合，调节含水率为50％～60％，pH为7.5～8.0，灭菌冷却后接入所述的种子液培养方法得到的拮抗放线菌G33的种子液，并控制温度为28～30℃，通气量为1～3m3/h，压力控制在0.01～0.05Mpa，间断搅拌进行发酵。
本发明还提供了一种所述的含拮抗放线菌G33的生物有机肥的用途，该生物有机肥用于作为番茄种植的肥料，能够降低番茄青枯病发病率。
本发明提供的防控番茄青枯病的拮抗放线菌G33和生物有机肥及方法、用途，解决了现有生防菌接种到植物根部后很难存活的问题，具有以下优点：
(1)本发明的生物有机肥从改善土壤微生物着手，拮抗放线菌G33能很好的定殖在番茄的根际，并产生拮抗物质，抑制番茄根际病原微生物的生长，从而显著降低连作番茄青枯病的发生，防治率达70％以上。
(2)本发明的生物有机肥，采用牛粪、沼渣和水稻秸秆，沼渣富含营养成分，含有大量的腐殖酸和有机物质，富含氮、磷、钾和微量元素、成本低廉；牛粪营养丰富、量大价廉易得；水稻秸秆，含C量高，孔隙度大，易于堆肥过程中C/N比的调节；通过三者按一定比例配合，可完全满足生防放线菌堆肥发酵生产的营养需求，且生产成本较常规发酵下降30～50％，有利于生物有机肥的推广应用；
(3)本发明的生物有机肥，利用拮抗放线菌G33将沼渣开发成更高附加值的有机肥料，在连作番茄的土壤上施用本产品后，生物防治率达70％以上，对防控番茄土传病害，提高农产品品质，保护环境有重要意义；
(4)本发明的生物有机肥，生物有机肥没有因为化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于番茄的无公害生产，农民可以减少其它防治土传病害化学农药的使用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于提高农产品的质量，从而增加农民的收入；
(5)本发明的拮抗放线菌G33，防控连作番茄青枯病效率达到70％以上，把它用作外加菌剂，参与有机肥的二次发酵，生产出优质的生物有机肥。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、菌株的分离和鉴定
采集成都双流农业部沼气科学研究所基地番茄种植地中，选取发病番茄植株周边的健康番茄植株根际的土壤分离放线菌，利用PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)采用对峙法筛选对番茄土传根部病害的病原菌青枯菌(R.solanacearum)等有强烈抑制作用的拮抗放线菌。再通过盆栽试验复筛，最终获得高效拮抗放线菌G33菌株，并进行菌种生物学鉴定，菌种保存于4℃冰箱，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC4.7604，保藏时间为2019年7月15日。
拮抗放线菌G33属于细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)，主要生物学特性为：在PDA培养基上最佳的生长温度28℃，培养5～7天，形成直径2～4mm的菌落，菌落早期呈粉黄色逐渐变成白色，孢子丝呈紧密螺旋状，分生孢子柱形。
2、生物有机肥制备
(1)G33种子液制备
从斜面上取3环菌株G33的分生孢子，接种到100mL灭菌的液体种子培养基中，进行液体种子培养，其培养条件为：培养液初始pH＝7.5，培养温度为28℃，摇床转速为180rpm，发酵时间48h，3000rpm离心15min，菌丝体含量15％～20％。
上述液体种子培养基的制备：30.0g黄豆粉、5.0gCaCO3、45.0g葡萄糖和5.0g酵母粉，于1000mL蒸馏水，pH 7.5，121℃灭菌20min。
(2)固体发酵配方优化
以沼渣、牛粪与水稻秸秆为发酵原料生产制备生物有机肥，用沼渣、牛粪与秸秆按质量比2：2：1混合作为固体发酵生防放线菌的原料，将原料混合均匀，调节含水率为50％～60％，pH至7.5～8.0，装入30L不锈钢固体发酵罐中，经121℃，30min灭菌后，冷却至30℃。
按10％～15％(w/w)的比例接入放线菌G33的液体种子，控制罐温为28～30℃，通气量1～3m3/h，罐压为0.01～0.05Mpa，每隔6h搅拌一次，转速50～70rpm，搅拌15min，发酵7天后结束，生产出的放线菌G33活菌制剂的孢子总数达108个/g以上。
3、温室试验
为验证本发明的G33生物有机肥对番茄青枯病的防治效果，在成都周边种植园区番茄发病大棚进行了盆栽试验，2.5Kg连作土/盆钵，1棵苗/盆，试验如下：
(1)番茄连作土+与有机肥中N、P和K含量相当的化肥，作为对照组，处理1；
(2)番茄连作土+沼渣有机肥(30g)(猪粪沼渣、水稻秸秆、牛粪共同堆肥)，处理2；
(3)番茄连作土+G33生物有机肥(30g)，处理3；
为了提高青枯劳尔氏菌在土壤中的数量，在番茄移栽1周后，采用灌根法将制备好的病原菌菌悬液，浓度为7.64×1010CFU g-1灌注在番茄的根系附近，接种量为每盆5mL，每个处理设置30个平行。生长周期为90天，定期观察记录番茄生长及发病情况，在盆栽试验结束后，统计分析发病程度及生物量，如表1所示。
移栽后定期到田间观察、采集数据，统计发病率，最后采收后计算不同处理的生物量差异，发现施入本发明的G33生物有机肥处理可以显著降低番茄青枯病的发病率及死亡率，使番茄产量增加40％以上。
表1温室盆栽实验各处理对番茄青枯病病防治效果、番茄生长及产量的影响
Figure BDA0002149519840000051
经计数番茄根际微生物区系的变化，发现施入本发明的G33生物有机肥，不仅可以起到防治番茄青枯病的效果，而且具有减少番茄根际病原菌数量，增加根际放线菌数量的作用，如表2所示。放线菌大多能产生抗菌活性物质，放线菌数量增加与土壤抗病性提高密切有关，因此施入本发明的G33生物有机肥可改善根际微生物群落结构的功能。
表2温室盆栽实验各处理对番茄根际微生物数量的影响(个/g)
Figure BDA0002149519840000052
本发明的生物有机肥从改善土壤微生物着手，拮抗放线菌G33能很好的定殖在番茄的根际，并产生拮抗物质，抑制番茄根际病原微生物的生长，从而显著降低连作番茄青枯病的发生，防治率达70％以上。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (7)

1.一种含拮抗放线菌G33的生物有机肥，其特征在于，该生物有机肥包含：沼渣、牛粪、水稻秸秆和拮抗放线菌G33的种子液；其中，所述沼渣、牛粪和水稻秸秆的质量比为2：2：1，所述拮抗放线菌G33的种子液在生物有机肥中的质量分数为10%~15%；
该拮抗放线菌G33保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.4.7604，保藏日期为2019年7月15日，其属于细黄链霉菌；该拮抗放线菌G33对番茄土传病原菌具有拮抗作用，该番茄土传病原菌包含：青枯菌；
所述的拮抗放线菌G33的种子液培养方法，包含：
将拮抗放线菌G33的分生孢子接种到灭菌的液体种子培养基中，进行液体种子摇床培养，其培养条件为：培养液初始pH=7.5，培养温度为28℃，摇床转速为180rpm；
所述液体种子培养基的制备包含：以质量比为6：1：9：1的黄豆粉、CaCO3、葡萄糖和酵母粉，于水中，pH 7.5，灭菌。
2.根据权利要求1所述的含拮抗放线菌G33的生物有机肥，其特征在于，该生物有机肥是通过将沼渣、牛粪和水稻秸秆按质量比混合，调节含水率为50%~60%，pH为7.5~8.0，灭菌冷却后接入所述拮抗放线菌G33的种子液，并控制温度为28~30℃，通气量为1~3 m3/h，压力控制在0.01~0.05 Mpa，间断搅拌进行发酵获得的。
3.根据权利要求1所述的含拮抗放线菌G33的生物有机肥，其特征在于，培养时间为48h。
4.根据权利要求1所述的含拮抗放线菌G33的生物有机肥，其特征在于，培养结束后离心，以测定得到液体种子培养基中菌丝体的含量为15%~20%。
5.根据权利要求1所述的含拮抗放线菌G33的生物有机肥，其特征在于，所述液体种子培养基中各组分总质量与水的体积之比为85g：1000mL。
6.一种如权利要求1-5中任意一项所述的含拮抗放线菌G33的生物有机肥的制备方法，其特征在于，该方法包含：将沼渣、牛粪和水稻秸秆按质量比2：2：1混合，调节含水率为50%~60%，pH为7.5~8.0，灭菌冷却后接入拮抗放线菌G33的种子液，并控制温度为28~30℃，通气量为1~3 m3/h，压力控制在0.01~0.05 Mpa，间断搅拌进行发酵。
7.一种如权利要求1-5中任意一项所述的含拮抗放线菌G33的生物有机肥的用途，其特征在于，该生物有机肥用于作为番茄种植的肥料，能够降低番茄青枯病发病率，增加根际放线菌数量。
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