CN115181675A - 一种贵州木霉菌促生伴侣溜曲霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种贵州木霉菌促生伴侣溜曲霉及其应用,溜曲霉菌株BF21,分类命名为溜曲霉Aspergillus tamarii,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所,保藏日期为2022年1月19日,保藏编号为CGMCC NO.40048。本发明进一步开发的复合微生物生物有机肥,该新型生物有机肥能够促进多种作物生长和提高作物的产量,同时也为其他功能微生物筛选促生伴侣菌提供了思路。

Description

一种贵州木霉菌促生伴侣溜曲霉及其应用
技术领域
本发明属于农业高新技术领域,涉及一种贵州木霉菌促生伴侣溜曲霉及其应用。
背景技术
贵州木霉菌是一种作物促生及防病效果较优的根际促生真菌。近年来,由多种微生物组成的复合微生物对作物促生已然成为研究热点。复合微生物相较于单一微生物菌剂更具优势,比如能适应更复杂环境、功效更强或者更全。在农业生产上使用复合菌,能够有效提高作物的抗病力,从而有效达到减肥减药的效果,而且还可以促进作物的生长,提高作物的产量及品质。
关于复合微生物的组合,目前基本是将已报道的各种根际促生微生物(细菌或者真菌)进行机械的配伍,然后根据促生效果进行评价。这样往往存在作物、土壤或者气候等条件的局限性,比如促生菌A联合促生菌B,在黄瓜作物上面能够共同发挥作用,可能在番茄作物上面没有协同作用。出现这种现象,可能主要是由于促生菌A对黄瓜和番茄均有促生作用,而促生菌B仅对黄瓜有促进效果。换言之,内在原因是促生菌A和促生菌B之间没有互作,仅仅是促生功能的简单叠加。开发能够互作的复合微生物,对促进多种作物生长和提高作物的产量具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种贵州木霉菌促生伴侣溜曲霉及其应用,本发明所述的溜曲霉能够提高贵州木霉的作物促生效果,为贵州木霉生物有机肥产业提供技术支持。
本发明的目的可通过以下技术方案实现:
本发明第一方面提供一种溜曲霉菌株BF21,分类命名为溜曲霉Aspergillustamarii,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所,保藏日期为2022年1月19日,保藏编号为CGMCC NO.40048。
本发明还提供含有溜曲霉菌株BF21的菌液。所述菌液可以按照本领域常规方法获得,例如通过无菌水对菌体重悬获得。
本发明第二方面还提供所述溜曲霉菌株BF21或者含有溜曲霉菌株BF21的菌液在制备微生物复合肥料中的应用。
本发明的第三方面还提供所述溜曲霉菌株BF21或者含有溜曲霉菌株BF21的菌液在制备复合生物有机肥中的应用。
本发明第四方面提供一种微生物复合肥料,所述肥料包括贵州木霉NJAU4742和本发明所述的溜曲霉BF21。在一些实施例中,贵州木霉NJAU 4742和溜曲霉BF21的菌量比为1:(0.8~1.2);在一些优选的实例中,贵州木霉NJAU4742和溜曲霉BF21的菌量比为1:1。
本发明第五方面还提供一种生物有机肥,所述生物有机肥为将微生物的菌液接种到有机肥产品中进行固体发酵获得,所述微生物包括贵州木霉NJAU 4742或溜曲霉BF21中的一种或两种。在一些实施例中,所述微生物包括贵州木霉NJAU 4742和溜曲霉BF21。
本发明所述的微生物的菌液可以按照本领域的常规方法进行制备,例如将菌株贵州木霉NJAU4742或溜曲霉BF21分别接种到PDA液体培养基(常规配制或市面购买)中,在27~30℃、160~180rpm条件下培养3-5天,然后以5000~7000r/min的转速离心3~6min,最后用等量无菌水重悬获得。
本发明所述的生物有机肥的菌液的接种量可以按照本领域的常规方法,在一些实施例中,菌液按照4~6%的接种量(体积/干重)加入到有机肥中。
在一些实施例中,本发明所述的生物有机肥中菌株量为106~108CFU/g。
本发明所述的有机肥产品可以选择本领域常用的有机肥产品,在一些实施例中,所述有机肥产品为腐熟鸡粪。所述的腐熟鸡粪可以通过市面进行购买,也可以通过常规手段发酵获得,例如新鲜的鸡粪添加25~35%的稻壳,调节含水量至60-65%和碳氮比为15~20%,经过30~45天的堆肥发酵腐熟而成。
本发明所述的固体发酵可以按照本领域的常规方法进行发酵即可。
本发明的第六方面还提供所述溜曲霉菌株BF21、含有溜曲霉菌株BF21的菌液、本发明所述的微生物复合肥料或者本发明所述的生物有机肥在植物促生中的应用。
在一些实施例中,本发明所述的植物为黄瓜、白菜或土豆。
本专利基于长期施用贵州木霉菌生物有机肥的田间定位试验,通过高通量分析初步获得了贵州木霉菌的促生伴侣溜曲霉BF21(Aspergillus tamarii BF21),其相对于现有技术具有如下优势:
(1)贵州木霉菌联合溜曲霉相比单独贵州木霉菌,对黄瓜作物具有显著的促生效应。此外,较单独贵州木霉菌,贵州木霉菌联合溜曲霉生物有机肥能够显著提高大田白菜(19.4%)和土豆(11.1%)的产量,说明贵州木霉联合溜曲霉具有较好的广泛适用性。
(2)进一步开发的复合微生物生物有机肥,该新型生物有机肥能够促进多种作物生长和提高作物的产量,同时也为其他功能微生物筛选促生伴侣菌提供了思路。
附图说明
图1为从连续3季施用木霉生物有机肥土壤中分离的曲霉属微生物发育树;
图2为贵州木霉NJAU4742联合溜曲霉BF21对黄瓜作物的促生效应;
图3为贵州木霉NJAU4742联合溜曲霉BF21对白菜的产量影响;
图4为贵州木霉NJAU4742联合溜曲霉BF21对土豆的产量影响。
具体实施方法
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
本发明以及以下实施例中提到的菌株NJAU 4742,分类命名为贵州木霉(Trichoderma guizhouense),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所,保藏日期为2016年4月11日,保藏编号为CGMCC NO.12166。
如无特别说明,以下实施例中所述的有机肥是指鸡粪有机肥,采购于南通惠农生物有机肥有限公司。
实施例1溜曲霉BF21的分离鉴定
将菌株贵州木霉NJAU 4742接种到PDA液体培养基中,在28℃、170rpm条件下培养3-5天,然后以6000r/min的转速离心5min,最后用等量无菌水重悬形成木霉菌液。
向腐熟鸡粪中加入20%的酸解氨基酸液(体积/干重),调节含水量至40%,中和后熟4天后得到有机肥。将制备的NJAU 4742木霉菌液按照5%的接种量(体积/干重)加入到有机肥中,固体发酵4天,目标菌株含量达到106CFU/g(按干重计),得到木霉生物有机肥。
种植小区在覆膜温室大棚内,小区面积为2×4m2,每个小区四周都用深埋入土的水泥板封住。将有机肥和木霉生物有机肥按照400公斤/亩的施肥量作为基肥施入种植小区内,进行深耕保证肥料与土壤充分混匀,两种肥料处理都设置三个重复小区。分别测定有机肥和木霉生物有机肥的养分含量,基于测定的结果补充化肥保证每个小区投入的养分足量且一致。
选用宁丰春秋的黄瓜种子,在育苗温室内进行催芽和育苗。挑选长势一致的黄瓜苗移栽入种植小区内,每个小区种植四列,每列十棵,共计40棵。待黄瓜开始结果后开始采果记产,每两天记一次,持续到果期结束为止。
田间试验共持续三季,第一季由2014年3月20日到2014年6月28日,第二季由2014年8月18日到2014年10月25日,第三季由2015年3月17日到6月29日。实验地点为南京市江宁区横溪县吴楚西路1号南京蔬菜花卉科学研究所三号黄瓜棚。
将田间试验第三季木霉生物有机肥处理土体土壤利用无菌去离子水稀释10倍,170rpm振荡30min,然后将土壤悬液利用PDA固体培养基进行培养,待初步长出菌落后逐一挑取,转移至新的培养皿中进行培养,不断挑选纯化培养直至分离出单菌。利用真菌DNA提取试剂盒提取分离出的单菌的DNA,然后委托上海派森诺生物科技股份有限公司进行菌种鉴定,最终得到编号为BF21(溜曲霉)和BF68(黑曲霉)的两株曲霉被挑选出来。将OTU23、OTU89和从木霉生物有机肥处理土壤中分离到的曲霉属微生物做系统发育树分析,结果如图1所示。其中菌株BF21的ITS序列如SEQ ID NO.1所示,分类命名为溜曲霉Aspergillustamarii,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所,保藏日期为2022年1月19日,保藏编号为CGMCC NO.40048。
实施例2
将贵州木霉NJAU4742、溜曲霉BF21和黑曲霉BF68分别接种到PDA液体培养基中,在28℃、170rpm条件下培养5天,用八层纱布滤去菌丝,然后将菌液以6000r/min的转速离心5min,最后用等量无菌水重悬,得到对应的孢子液备用。将三株单一真菌的孢子液加入到灭菌土壤中,目标菌株含量达到107CFU/g(按干重计),得到含有不同单一真菌的土壤,分别命名为4742、BF21和BF68。
将溜曲霉BF21和黑曲霉BF68的孢子液分别与贵州木霉NJAU4742的孢子液按照1:1的体积比例混匀,加入到灭菌土壤中,目标菌株含量分别达到107CFU/g(按干重计),形成含有不同组合菌群的土壤,分别命名为BF21+4742和BF68+4742。
将实施例1田间试验第三季的有机肥处理和木霉生物有机肥处理的土体土壤用灭菌无菌水稀释10倍,170rpm充分振荡5min,静置5min后取出上清液,加入灭菌土壤中,得到含有不同施肥处理土壤微生物区系的土壤处理,分别命名为OFS和BFS。
黄瓜种子采用10%的次氯酸钠溶液表面消毒10min,然后用湿润纱布包裹置于30℃恒温箱中催芽。发芽后移入装有灭菌基质的穴盘中进行培养,保持光照良好,水分充足。待黄瓜苗长出一片新叶后,挑选长势一致的黄瓜苗移栽入装有不同菌群土壤的花盆中进行培养,不定期补充等量的营养液,随机放置花盆,尽量减小外界环境的影响。待黄瓜生长30天后,采收黄瓜植株,测定植株的鲜重。
黄瓜培养试验时间由2019年8月16日到2019年9月15日,实验地点是南京农业大学资源与环境科学学院一楼温室。
结果如图2所示:BF68和NJAU4742的促生效果显著优于有机肥处理土壤菌悬液,但是不如木霉生物有机肥处理土壤菌悬液;本发明所述的菌株BF21的促生效果与有机肥处理土壤悬液无显著差异。但是本发明所述的菌株BF21与NJAU4742组合之后,具有显著的促生效果,促生效果显著优于单一的BF21和NJAU4742,具有协同增效的效果。而BF68+4742的促生效果相比于单一的BF68和NJAU4742没有显著差异。可见本发明所述的菌株BF21具有显著提高NJAU4742促生效果的作用。
实施例3
将菌株贵州木霉NJAU4742和溜曲霉BF21分别接种到PDA液体培养基中,在28℃、170rpm条件下培养3-5天,然后以6000r/min的转速离心5min,最后用等量无菌水重悬备用。
两种菌液按照5%的接种量(体积/干重)分别加入到腐熟鸡粪中,固体发酵后制成木霉生物肥和溜曲霉生物肥。两种菌液按照1:1的比例混合后按照5%的接种量加入到腐熟鸡粪中,目标菌株含量均达到106CFU/g(按干重计),固体发酵制成木霉+溜曲霉生物肥。
将化肥(尿素,过磷酸钙,硫酸钾)、腐熟鸡粪、木霉生物肥、溜曲霉生物肥和木霉+溜曲霉生物肥以深耕的方式施入实验大田不同小区中,分别命名为CF、OF、木霉、溜曲霉和木霉+溜曲霉,每个处理设置三个重复。施入后以轮作的方式种植白菜作物和土豆作物,待作物成熟后称重记产,比较不同施肥处理的促生效果。
实验时间由2019年3月到2019年10月,实验地点是江苏省南通市海安县露天大田。
白菜作物的产量结果如图3所示。相比于CF(化肥)处理,施用有机肥、木霉生物肥、溜曲霉生物肥和木霉+溜曲霉生物肥在白菜产量方面分别增加了12.3%、19.5%、10.7%和42.7%。相比于木霉生物肥和溜曲霉生物肥,施用木霉+溜曲霉生物肥显著提高了白菜产量,增产幅度分别达到了19.4%和28.9%。
土豆作物的产量结果如图4所示。相比于比于CF(化肥)处理,施用有机肥、木霉生物肥、溜曲霉生物肥和木霉+溜曲霉生物肥在土豆产量方面分别增加了10.7%、19.2%、12.8%和32.4%。相比于木霉生物肥和溜曲霉生物肥,施用木霉+溜曲霉生物肥显著提高了土豆产量,增产幅度分别达到了11.1%和17.3%。
本发明的结果可见,虽然单一真菌溜曲霉BF21对不同作物的促生效果并不显著,但与贵州木霉NJAU4742结合施用后促生效果得到了明显的提升,显著高于单独施用BF21或NJAU4742,具有明显的协同增效的效果。
序列表
<110> 南京思农生物有机肥研究院有限公司
<120> 一种贵州木霉菌促生伴侣溜曲霉及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 602
<212> DNA
<213> Aspergillus tamarii
<400> 1
tttctgtagg ggtaacctgc ggaaggatca ttaccgagtg tagggttcct agcgagccca 60
acctcccacc cgtgtttact gtaaccttag ttgcttcggc gggcccgcct ttaaggccgc 120
cggggggcat cagcccccgg gcccgcgccc gccggagaca ccacgaactc tgtctgatct 180
agtgaagtct gagttgattg tatcgcaatc agttaaaact ttcaacaatg gatctcttgg 240
ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataacta gtgtgaattg cagaattccg 300
tgaatcatcg agtctttgaa cgcacattgc gccccctggt attccggggg gcatgcctgt 360
ccgagcgtca ttgctgccca tcaagcacgg cttgtgtgtt gggtcgtcgt cccctcttcg 420
ggggggacgg gccccaaagg cagcggcggc accgcgtccg atcctcgagc gtatggggct 480
ttgtcacccg ctctgtaggc ccggccggcg cttgccgaac gcaaaacaac cattctttcc 540
aggttgacct cggatcaggt agggataccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg 600
aa 602

Claims (10)

1.一种溜曲霉BF21,其特征在于,分类命名为溜曲霉Aspergillus tamarii,保藏编号为CGMCC NO.40048。
2.含有权利要求1所述的溜曲霉BF21的菌液。
3.权利要求1所述的溜曲霉BF21或权利要求2所述的菌液在制备微生物复合肥或复合生物有机肥中的应用。
4.一种微生物复合肥料,其特征在于,包括贵州木霉NJAU4742和权利要求1所述的溜曲霉BF21。
5.根据权利要求4所述的微生物复合肥料,其特征在于,贵州木霉NJAU 4742和溜曲霉BF21的菌量比为1:(0.8~1.2);优选的,贵州木霉NJAU 4742和溜曲霉BF21的菌量比为1:1。
6.一种生物有机肥,其特征在于,所述生物有机肥为将微生物的菌液接种到有机肥产品中进行固体发酵获得,所述微生物包括贵州木霉NJAU 4742或溜曲霉BF21中的一种或两种;优选的,所述微生物包括贵州木霉NJAU 4742和溜曲霉BF21。
7.根据权利要求6所述的生物有机肥,其特征在于,菌液按照4~6%的接种量(体积/干重)加入到有机肥产品中;优选的,所述的生物有机肥中菌株量为106~108CFU/g。
8.根据权利要求6所述的生物有机肥,其特征在于,所述有机肥产品为腐熟鸡粪;优选的,所述腐熟鸡粪的制备方法为:新鲜的鸡粪添加25~35%的稻壳,调节含水量至60-65%和碳氮比为15~20%,经过30~45天的堆肥发酵腐熟而成。
9.权利要求1所述的溜曲霉菌株BF21、权利要求2所述的菌液、权利要求4或5所述的微生物复合肥料或者权利要求6~8任一项所述的生物有机肥在植物促生中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述的植物为黄瓜、白菜或土豆。
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