CN113980836A - 贝莱斯芽孢杆菌及其在草莓根腐病防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，提供了一种贝莱斯芽胞杆菌及其在草莓根腐病防治中的应用。所提供的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21827。所提供的贝莱斯芽孢杆菌可以制备微生物菌剂，复合菌剂，以及微生物肥料。所提供的微生物菌剂，复合菌剂，以及微生物肥料可以用来防治植物的根腐病，应用于农作物的施肥中。

Description

贝莱斯芽孢杆菌及其在草莓根腐病防治中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及贝莱斯芽孢杆菌LY149-1及其在草莓根腐病防治中的应用。

背景技术

化肥的产生带来了粮食的增产，但也带来环境的污染以及土地污染。特别是当今社会，环境污染和土地污染的日益严重，造成粮食的可持续发展出现危机。所以如何减少化肥的使用是当今科学家们研究的重要课题。实践证明，微生物肥料具有高效、高产以及绿色健康无污染的植物肥料。微生物肥料的使用是当今农业发展必不可少的因素。

微生物肥料的施放能促进土壤中的有益微生物的生长增殖，从而有益微生物将土壤中氮、磷、钾等更多的分解，促进植物的生长发育。贝莱斯芽孢杆菌是目前农用微生物菌剂中应用最为广泛的一类微生物，据报道，贝莱斯芽孢杆菌能够通过在土壤中分泌代谢产物提高土壤养分，改良土壤结构，提高化肥利用率，同时也能够增强作物抗病、抗旱、抗寒的能力，促进作物生产，提高产量。通过筛选优良菌种，促进微生物产业的发展，对于作物产量以及生态环境都具有积极作用。

草莓(Fragaria Ananassa Duch)是多年生的草本植物，属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属 (Fragaria)。由于果实香甜可口，营养丰富，富含蛋白质及多种维生素，被称作“水果皇后”和“水果牛奶”，深受消费者的喜爱。近年来，因受耕地限制草莓用地不能合理轮作，存在连作障碍，加之有机肥料施用不足、施用的畜禽粪便腐熟度不够，以及缺乏抗病品种等，导致各种草莓病害逐年加重。草莓根腐病是草莓连作障碍的主要病害之一，主要由土传病原真菌引起，容易造成不定根大量死亡，新生根逐渐停滞生长，从而导致吸收能力下降，水分、营养物质和无机盐等不能正常输送，表现出早衰、坐果率低，整株青枯，严重影响草莓产量。

针对植物尤其是草莓的根腐病的防治，还需要进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis、微生物菌剂、复合菌剂、微生物肥料及防治根腐病的方法。

本发明的第一方面提供了一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21827。所提供的贝莱斯芽孢杆菌也命名为LY149-1，其能够用于草莓根腐病的防治。

本发明的第二方面提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌。

本发明的第三方面提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为第二方面所述的微生物菌剂，所述第二微生物菌剂包括选自侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌中的至少一种。

本发明的第四方面提供了一种微生物肥料，所述微生物肥料包括第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌，或者第二方面所述的微生物菌剂，或者第三方面所述的复合菌剂。

本发明的第五方面提供了一种贝莱斯芽孢杆菌在制备微生物菌剂、复合菌剂或者微生物肥料中的用途，所述贝莱斯芽孢杆菌为本发明第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌。

本发明的第六方面提供了一种防治根腐病的方法，包括对植物施用有效量的贝莱斯芽孢杆菌，微生物菌剂，复合菌剂或者微生物肥料，所述贝莱斯芽孢杆菌为本发明第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌，所述微生物菌剂为本发明第二方面所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为本发明第三方面所述的复合菌剂，所述微生物肥料为本发明第四方面所述的微生物肥料。

菌种保藏信息

贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏编号为CGMCC No.21827，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年02月25日。

附图说明

图1为根据本发明的实施例提供的贝莱斯芽孢杆菌对草莓疫霉、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、棒状拟盘多毛孢的拮抗效果图。

图2为根据本发明的实施例提供的贝莱斯芽孢杆菌在TSA培养基上的形态结果。

图3为根据本发明的实施例提供的对贝莱斯芽孢杆菌的16S rDNA进行进化树分析的结果图。

图4为根据本发明的实施例提供的对贝莱斯芽孢杆菌的gyrB基因进行进化树分析的结果图。

具体实施方式

下面结合附图详细描述本发明的实施例，需要说明的是，这些实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本文中，如无特殊说明，当表述某种物质的含量时，是指的该物质的质量占总物质重量的百分比。

本文中，当提到对于疾病的“防治”时，“防治”不仅包括预防某种疾病的发生，还包括治疗某种疾病，从而减轻、降低、缓解疾病的症状。

本发明的第一方面提供了一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21827。所提供的贝莱斯芽孢杆菌也命名为LY149-1，经筛选、分离和鉴定，如通过16S rRNA基因，gyrB保守基因，细胞革兰氏染色和菌落形态以及生理生化特征(例如包括全细胞脂肪酸和API CH)分析，被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，其能够用于草莓根腐病的防治。例如，对于草莓疫霉菌Phytophthora fragariae、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani、棒状拟盘多毛孢Neopestalotiopsis clavispora等草莓根腐病的致病菌，有较好的拮抗作用，平板抑制率在70％以上，且该菌株代谢产物中含有卡那霉素、纳他霉素、生物素等拮抗活性物质。根据本发明的具体实施方式，所提供的贝莱斯芽孢杆菌具有如SEQ IDNO:1所示的16S rDNA序列。所提到的16S rDNA序列编码16S rRNA亚基。根据本发明的具体实施方式，所提供的贝莱斯芽孢杆菌具有如SEQ ID NO:2所示的gyrB基因序列。

本发明的第二方面提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌。所提供的微生物菌剂对于草莓具有显著抗病、促生的作用。例如可以使得草莓根腐病田间发病率降低60％以上，草莓产量增加5％以上，草莓中维生素C含量提高5％以上。

根据本发明的实施例，所提供的微生物菌剂可以通过发酵获得。在至少一些实施方式中，所述微生物菌剂为干粉状，每克所述微生物菌剂中含有所述贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数至少为1000亿CFU。

所述微生物菌剂通过下述步骤获得：对所述贝莱斯芽孢杆菌进行发酵培养，以便获得发酵产物；基于所述发酵产物进行喷雾干燥、粉碎处理，以便获得所述微生物菌剂。在至少一些实施方式中，所述发酵培养包括：对所述贝莱斯芽孢杆菌进行活化发酵培养，以便获得发酵菌液；对所述发酵菌液进行放大发酵培养，以便获得发酵产物。在至少一些实施方式中，用于所述放大发酵培养的培养基包括玉米淀粉、蔗糖、豆粕、酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、氯化钠、和消泡剂。在至少一些优选实施方式中，用于放大发酵培养的培养基以重量份计，包括：2.5-3份的玉米淀粉，0.5-1份的蔗糖，3-4.5 份的豆粕，0.15-0.20份的酵母粉，0.15-0.20份的蛋白胨，0.2-0.3份的磷酸氢二钾、0.2-0.3 份的磷酸二氢钾，0.1-0.15份的碳酸钙、0.1-0.15份的氯化钠，和0.2-0.3份的消泡剂。放大发酵培养基的pH可以控制在7左右。用于放大发酵培养的发酵罐的大小可以为10L、50L 或者500L；不同体积大小的发酵罐逐级放大使用。将发酵产物进行烘干粉碎，可以获得相应的微生物菌剂。在进行液体发酵培养时，所用到的培养基可以为LB培养基。例如，可以在37℃条件下培养4～8小时获得发酵菌液。

所提供的贝莱斯芽孢杆菌不仅可以制备成微生物菌剂，作为单一菌剂使用，还可以同其他微生物菌剂进行复配，制备成复合菌剂。为此，本发明还提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为上述所述的微生物菌剂，所述第二微生物菌剂为不同于第一微生物菌剂的微生物菌剂。所述第二微生物菌剂不做特殊要求，所述第二微生物菌剂只要是能够起到防治病虫害或者疾病的目的即可。在至少一些优选实施方式中，所述第二微生物菌剂包括选自侧孢芽孢杆菌菌剂、巨大芽孢杆菌菌剂中的至少一种。所述第二微生物菌剂包括侧孢芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。所提到的侧孢芽孢杆菌菌剂是指包含有侧孢芽孢杆菌的微生物菌剂，所提到的巨大芽孢杆菌菌剂是指包含有巨大芽孢杆菌的微生物菌剂。所提到的侧孢芽孢杆菌或者巨大芽孢杆菌可以通过购买获得，并可以通过发酵培养、烘干粉碎获得。当然，也可以直接购买获得侧孢芽孢杆菌菌剂或者巨大芽孢杆菌菌剂。

在至少一些实施方式中，所述复合菌剂包括50～55重量份的贝莱斯芽孢杆菌，以及选自下列中的至少一种：20～25重量份的侧孢芽孢杆菌，20～25重量份的凝结芽孢杆菌。

在至少一些实施方式中，每克所述复合菌剂中包括贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数至少为1000亿CFU，以及选自下列中的至少一种：侧孢芽孢杆菌菌的有效活菌数至少为100亿CFU；巨大芽孢杆菌菌的有效活菌数至少为100亿CFU。CFU作本领域通常解释，为菌落形成单位。

在至少一些实施方式中，每克所述复合菌剂中包括贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数至少为1000亿CFU，侧孢芽孢杆菌菌的有效活菌数至少为100亿CFU；和巨大芽孢杆菌菌的有效活菌数至少为100亿CFU。

上述提供的菌株，或者微生物菌剂或者复合菌剂可以单独使用，也可以添加到肥料中使用，用来防治植物的根腐病。为此，本发明还提供了一种微生物肥料，所述微生物肥料包括上述所述的贝莱斯芽孢杆菌，或者上述所述的微生物菌剂，或者上述所述的复合菌剂。所提供的微生物肥料对于植物，尤其是草莓具有防病、增产增收的作用。例如可以表现为可以进草莓产量增加6％以上，草莓中维生素C含量提高6％以上，可溶性糖含量增加10％以上，草莓根腐病发病率降低60％以上。所提供的微生物肥料具有促进作物生长，提高作物产量，防治草莓根腐病的功能。

在一些实施方式中，所述微生物肥料中含有千分之一至千分之五(例如千分之一、千分之二、千分之三、千分之四或者千分之五)的所述贝莱斯芽孢杆菌，或者千分之一至千分之五(例如千分之一、千分之二、千分之三、千分之四或者千分之五)的所述微生物菌剂，或者千分之一至千分之五(例如千分之一、千分之二、千分之三、千分之四或者千分之五)的所述复合菌剂。

所述微生物肥料还进一步包括基础肥料。基础肥料可以为复合肥、有机无机肥等等。例如可以为19-5-25/S。微生物肥料可以通过下述方法制备：将复合肥包膜工段与防结粉混合均匀后，然后添加2-5‰含量的微生物菌剂，获得生物肥料。所提供的微生物肥料中所含有的微生物有效活菌数至少为0.2亿CFU。

本发明还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌在制备微生物菌剂、复合菌剂或者微生物肥料中的用途。

本发明还提供了一种防治根腐病的方法，包括对植物施用有效量的贝莱斯芽孢杆菌，微生物菌剂，复合菌剂或者微生物肥料，所述贝莱斯芽孢杆菌为上述所述的贝莱斯芽孢杆菌，所述微生物菌剂为上述所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为上述所述的复合菌剂，所述微生物肥料为上述所述的微生物肥料。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1贝莱斯芽孢杆菌LY149-1的分离与筛选

从玉米根系表面采用平板涂布法和平板划线法分离获得贝莱斯芽孢杆菌LY149-1，包括如下步骤：

(1)贝莱斯芽孢杆菌的分离筛选

在山东省临沂市河东区梅埠街道侯宅子村黄壤土中选取健康玉米根际土进行筛选。具体步骤为：将根部土壤轻轻抖落，用清水冲洗干净，然后将其放置在称量纸上用刀片轻刮根系，全部收集混匀，称取1g放入100ml无菌水中，150rpm，30℃条件下振荡30min，然后进行梯度稀释，至10⁴倍，选取3个梯度进行涂布，每个梯度3个平行，在30℃培养箱中培养2d后选取不同菌落形态的菌株在LB培养基上划线，定期观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，分别编号保存。

通过菌株分离、纯化和鉴定，获得4株具有应用潜力的贝莱斯芽孢杆菌，分别编号为 012-2、025-2、121-1、LY149-1。

(2)草莓根腐病拮抗菌的筛选。

初筛：采用平板对峙法，制备PDA培养基，用打孔器分别在草莓疫霉菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、棒状拟盘多毛孢的平板边缘打取直径为5mm的菌饼，将其移植在新的PDA平板中央，同时将步骤1中筛选到菌株用牙签分别接种在平板四周，转移到25℃恒温培养箱中培养，观察记录菌株对病原菌的抑制程度。

复筛：通过再次对比筛选，获得对草莓根腐病病原菌具有拮抗效果，且拮抗效果最好的微生物菌株，并测定拮抗率，通过拮抗率计算，最终获得一株拮抗效果最好的菌株，即为贝莱斯芽孢杆菌LY149-1，拮抗效果如图1所示。其中图1中左上角为拮抗草莓疫霉菌效果图，右上角为拮抗尖孢镰刀菌效果图，左下角为拮抗立枯丝核菌效果图，右下角为拮抗棒状拟盘多毛孢效果图。

其中拮抗率通过下述公式计算获得：

拮抗率(％)＝(对照菌落半径–处理菌落半径)/对照菌落半径*100

其中公式中对照菌落半径是指以下述PDA培养基处理，对应的病原菌的菌落半径。

表1中列出了编号为149-1的菌株对于镰刀菌属病原菌的拮抗效果。

表1 149-1菌株对镰刀菌属病原菌的拮抗效果

此外，对菌株代谢产物进行液相色谱质谱联用(LC-MS)分析，结果表明贝莱斯芽孢杆菌LY149-1能够产生卡那霉素、纳他霉素、生物素等拮抗活性物质。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌LY149-1的鉴定

对编号为LY149-1的贝莱斯芽孢杆菌分别进行如下鉴定：

(1)形态特征：

编号为LY149-1的贝莱斯芽孢杆菌进行鉴定，结果表明：革兰氏染色呈阳性，菌体杆状。在TSA培养基上，菌落呈不规则圆形，乳白色，质地粘稠，如图2所示。

(2)生理生化特性：

通过微生物脂肪酸快速鉴定系统(MIDI)检测菌株LY149-1的脂肪酸组成，可知待测菌株的主要脂肪酸为C15:0anteiso、C15:0iso、C17:0anteiso和C17:0iso，其含量分别为42.09％，12.85％，18.71％和10.36％，符合芽孢杆菌属(Bacillus)的主要细胞脂肪酸特征。

API 50CH检测结果：

阳性反应有L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、蔗糖、海藻糖、糖原、拢牛儿糖和D-松二糖；

弱阳性反应有甘油、肌醇、山梨醇、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、麦芽糖、菊糖、淀粉和葡萄糖酸盐；

阴性反应有对照、赤藓糖、D-阿拉伯糖、L-木糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖甙、半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫矛醇、α-甲基-D-甘露糖甙、乳糖、蜜二糖、松叁糖、棉籽糖、木糖醇、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、L-岩糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐和5-酮基-葡萄糖酸盐。

符合芽孢杆菌属(Bacillus)的生化代谢特征。

(3)分子生物学特性：

1)16S rDNA基因序列(1419bp)及系统发育分析

经鉴定，16S rDNA基因序列如下所示：

TTCGGCGGCTGGCTCCTAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTG GTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCC GCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGA GAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATT GTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCT TCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAA GATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGAC GACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATT GTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATG CTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTAC TCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTA ACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCC CCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTG TTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGC ACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCA GACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCA CCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCG TCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGA TCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGA AGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGC CGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAA CTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTG AACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAG TCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGC(SEQ ID NO:1)

对该菌株进行16S rDNA进化树分析，结果如图3所示。

通过菌株16S rDNA进化树分析，该菌株符合芽孢杆菌属(Bacillus.sp)特征。

2)gyrB基因序列(1162bp)及系统发育分析

对编号为LY149-1的菌株进行gyrB基因序列分析，结果如下所示： GGATAACGCGCTTTTTCAAGATTAAAATCTTCTCCGATTCCTGTTCCGAGGGCCGTGAT CATTGATCTGACCTCATTGTTTGAGAGAATCTTATCAAGTCTGGCTTTCTCAACGTTCA GAATCTTACCGCGCAGCGGCAGAATGGCTTGGAAATGACGGTCCCGTCCCTGTTTCGC TGATCCGCCCGCAGAGTCACCCTCTACGATATACAGCTCGGAAATGCTCGGATCTTTAG AAGAACAGTCCGCCAGTTTGCCCGGCAGATTGGAAATCTCAAGCGCACTTTTGCGGC GGGTCAATTCCCGCGCTTTTTTCGCTGCCATCCGCGCTCTTGCGGCCATTAAACCTTTT TCAACGATTTTGCGGGCTGAGTCCGGATTTTCAAGAAGGAATGTTTCCAGCGCAGAA GAAAACAGCGTATCAGTGATCGTTCTCGCTTCGGAGTTGCCGAGCTTCGTTTTCGTCT GCCCTTCGAATTGCGGATCAGGGTGCTTAATTGAAATAATGGCAGTCAGCCCTTCCCT CACATCATCCCCGCTTAAATTCGGATCATTTTCTTTGAAAATCCCTTTTCTTCTTGCATA GTCGTTTATAACACGGGTCAGACCGGTTTTAAATCCGGCTTCGTGCGTGCCGCCTTCGT ATGTGTTGATATTATTTGTGAAAGAATAAATATTGCTTGTATAGCTGTCGTTGTATTGCA ATGCAACTTCAACCGTTATGCCGTCTTTCTCGCCTTCGATATAAATCGGCTCTTCATGA ACGACTTCTTTGGAACGGTTTAAGTACTCAACATAGCTTTTGATTCCGCCTTCGTAGTG GTACTCGTTTTTCCGTTCTTGTCCTTCACGTTTGTCTTCAATCGTGATGTTTACACCTTT TGTCAGGAAGGCCAATTCCCGGACACGGTTTGAAAGCAGGTCATAGTCGTATTCGGTT GTTTCTTTGAAAATTTCCGGATCCGGAACGAAGTGCGTAATCGTTCCGGTCTTATCAGT ATCACCGATCACTTCAAGATCGGCCACAGGTACACCGCGCTCGTACGCCTGATAGTGG ATTTTTCCGTCACGATGAACCGTAACGTCAAGAGTGGTCGACAAGGCGTTTACGACA GACGCCCCTACACCGTGAAGACCGCCGGATACTTATATCCGCCTCCCGT(SEQ ID NO:2)

同时对gyrB基因进行进化树分析，如图4所示。

通过菌株gyrB基因进化树分析，该菌株与Bacillus velezensis strain A2的相似度达到 99.7％，亲缘关系最为相近。

总结：通过上述菌株形态特征、生理生化特性以及分子生物学特性分析，LY149-1菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。将该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21827，保藏时间为2021年02月25日。

实施例3草莓防病微生物菌剂的制备及应用

实施例3利用上述贝莱斯芽孢杆菌制备了微生物菌剂。包括如下步骤：

(1)将平皿中保存的贝莱斯芽孢杆菌LY149-1，用接种环接种至含有100ml LB培养液的三角瓶(250ml)中，37℃，210rpm，于恒温培养箱中培养6h；

(2)将上述发酵菌液接种至中试发酵罐中(10L—50L—500L)，37℃进行培养，发酵完成后进行喷雾干燥，分装，活菌数为2100亿cfu·g^-1。其中发酵过程中所用到的中试培养基配方为(各组分含量为重量占比)：玉米淀粉2.5％-3％，蔗糖0.5％-1％，豆粕3％-4.5％，酵母粉0.15％-0.20％，蛋白胨0.15％-0.20％，磷酸氢二钾0.2％-0.3％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％，碳酸钙0.1％-0.15％、氯化钠0.1％-0.15％，消泡剂0.2％-0.3％，pH调节为7.0。

同时参照上述方法分别制备编号为012-2、025-2、或121-1菌株的相应的微生物菌剂。

将上述步骤所制备的各微生物菌剂，进行田间效果的验证，草莓田间实验在山东省临沂市莒南县草莓基地开展。共设置5个处理，每组处理40m²，每组3个平行。对照组为常规种植，试验组为上述微生物菌剂沾根后种植。其具体效果表现见表2。

表2微生物菌剂草莓试验各处理效果

试验结果显示LY149-1微生物菌剂对草莓具有显著抗病、促生的作用，具体效果为：草莓根腐病田间发病率降低63.9％，草莓产量增加6.4％，草莓中维生素C含量提高6.5％。

实施例4复合菌剂及其制备

实施例4提供了复合菌剂以及相应的制备方法。包括如下步骤：

(1)将平皿中保存的贝莱斯芽孢杆菌LY149-1，用接种环接种至含有100ml LB培养液的三角瓶(250ml)中，37℃，210rpm，于恒温培养箱中培养6h；

(2)将上述发酵菌液接种至中试发酵罐中(10L—50L—500L)，37℃进行培养，发酵完成后进行喷雾干燥，分装，活菌数为2100亿cfu·g^-1。中试培养基配方为：玉米淀粉2.5％-3％，蔗糖0.5％-1％，豆粕3％-4.5％，酵母粉0.15％-0.20％，蛋白胨0.15％-0.20％，磷酸氢二钾0.2％-0.3％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％，碳酸钙0.1％-0.15％、氯化钠0.1％-0.15％，消泡剂0.2％-0.3％，pH调节为7.0。

同时分别按照步骤(1)和步骤(2)所述的方法制备侧孢芽孢杆菌微生物菌剂，巨大芽孢杆菌微生物菌剂。其中侧孢芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌为商购菌株。

(3)按照各重量配比：50～55份贝莱斯芽孢杆菌，20～25份侧孢芽孢杆菌，20～25份巨大芽孢杆菌复配，获得复合菌剂。

将上述步骤所制备的复合菌剂进行田间效果的验证，草莓田间实验在山东省临沂市莒南县草莓基地开展。共设置对照组、市场竞品菌剂试验组、复合菌剂试验组3个处理，每组处理30m²，每组3个平行。对照组为常规种植，市场竞品菌剂试验组为竞品菌剂(解淀粉芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌复配，有效活菌数为0.2亿CFU)灌根施用，复合菌剂试验组为上述复合菌剂灌根施用，其中复合菌剂按照不同施用比例分成3个试验组。其具体效果表现见表3。

表3复合菌剂草莓田间试验效果

试验结果显示复合菌剂试验组对草莓具有显著抗病、促生的作用，具体效果为：草莓根腐病田间发病率降低63.8％，草莓产量增加6.6％，草莓中维生素C含量提高6.2％。

实施例5微生物肥料的制备及应用

实施例5提供了微生物肥料，微生物肥料可以通过将贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂添加到基础肥料中获得；也可以通过将实施例4所制备的复合菌剂添加到基础肥料中获得。下面列出的具体结果以复合菌剂为例，制备了微生物肥料。

首先对于基础肥料进行造粒，所用到的基础肥料为19-5-25/S，然后在基础肥料包膜工段与防结粉混合均匀后，并添加重量配比为2-5‰的实施例4所制备的复合菌剂1，得到相应的微生物肥料。经鉴定，所制备的微生物肥料的有效活菌数不低于0.2亿cfu·g^-1。

然后将所制备的微生物肥料进行田间效果的验证，草莓田间实验在山东省临沂市莒南县草莓基地开展。共设置对照组、市场竞品试验组和微生物肥料组3个处理，每组处理3小区，每个小区40m²，肥料施用量为50kg/亩。对照组1为常规施肥，对照组2为市场竞品试验组(施用市场购买的微生物菌肥)，微生物肥料组为施用上述制备的各微生物肥料，其中微生物肥料按照菌剂的不同施用比例分成4个试验组。具体效果表现见表4。

表4微生物肥料草莓试验各处理效果

试验结果显示施用本发明所提供的微生物肥料效果最好，相比对照组1和对照组2，草莓根腐病发病率分别降低61.1％和39.8％，产量分别增加8.5％和6.7％，维生素C含量分别提高8.1％和5.7％，可溶性糖含量分别增加12.2％和8.8％。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“实施方式”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中化农业（临沂）研发中心有限公司

<120> 贝莱斯芽孢杆菌及其在草莓根腐病防治中的应用

<130> BI3211473

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1419

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

ttcggcggct ggctcctaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt 60

gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120

tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga 180

tttgtgggat tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg 240

tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300

tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg 360

cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420

cctgtcactc tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga 480

cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540

ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat 600

gcgttagctg cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg 660

cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag 720

ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc 780

gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc 840

tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac 900

gcccaataat tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960

tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt 1020

cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc 1080

gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140

gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg 1200

tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga 1260

agccaccttt tatgtctgaa ccatgcggtt cagacaacca tccggtatta gccccggttt 1320

cccggagtta tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1380

aacatcaggg agcaagctcc catctgtccg ctcgactgc 1419

<210> 2

<211> 1162

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 2

ggataacgcg ctttttcaag attaaaatct tctccgattc ctgttccgag ggccgtgatc 60

attgatctga cctcattgtt tgagagaatc ttatcaagtc tggctttctc aacgttcaga 120

atcttaccgc gcagcggcag aatggcttgg aaatgacggt cccgtccctg tttcgctgat 180

ccgcccgcag agtcaccctc tacgatatac agctcggaaa tgctcggatc tttagaagaa 240

cagtccgcca gtttgcccgg cagattggaa atctcaagcg cacttttgcg gcgggtcaat 300

tcccgcgctt ttttcgctgc catccgcgct cttgcggcca ttaaaccttt ttcaacgatt 360

ttgcgggctg agtccggatt ttcaagaagg aatgtttcca gcgcagaaga aaacagcgta 420

tcagtgatcg ttctcgcttc ggagttgccg agcttcgttt tcgtctgccc ttcgaattgc 480

ggatcagggt gcttaattga aataatggca gtcagccctt ccctcacatc atccccgctt 540

aaattcggat cattttcttt gaaaatccct tttcttcttg catagtcgtt tataacacgg 600

gtcagaccgg ttttaaatcc ggcttcgtgc gtgccgcctt cgtatgtgtt gatattattt 660

gtgaaagaat aaatattgct tgtatagctg tcgttgtatt gcaatgcaac ttcaaccgtt 720

atgccgtctt tctcgccttc gatataaatc ggctcttcat gaacgacttc tttggaacgg 780

tttaagtact caacatagct tttgattccg ccttcgtagt ggtactcgtt tttccgttct 840

tgtccttcac gtttgtcttc aatcgtgatg tttacacctt ttgtcaggaa ggccaattcc 900

cggacacggt ttgaaagcag gtcatagtcg tattcggttg tttctttgaa aatttccgga 960

tccggaacga agtgcgtaat cgttccggtc ttatcagtat caccgatcac ttcaagatcg 1020

gccacaggta caccgcgctc gtacgcctga tagtggattt ttccgtcacg atgaaccgta 1080

acgtcaagag tggtcgacaa ggcgtttacg acagacgccc ctacaccgtg aagaccgccg 1140

gatacttata tccgcctccc gt 1162

Claims (10)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21827；

任选地，所述贝莱斯芽孢杆菌具有如SEQ ID NO:1所示的16S rDNA序列；

任选地，所述贝莱斯芽孢杆菌具有如SEQ ID NO:2所示的gyrB基因序列；

任选地，所述贝莱斯芽孢杆菌能够产生拮抗病原菌活性物质，所述活性物质包括选自卡那霉素、纳他霉素、生物素中的至少一种。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌；

任选地，所述微生物菌剂为干粉状，每克所述微生物菌剂中含有所述贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数至少为1000亿CFU。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂通过下述步骤获得：

对所述贝莱斯芽孢杆菌进行发酵培养，以便获得发酵产物；

基于所述发酵产物进行喷雾干燥、粉碎处理，以便获得所述微生物菌剂；

任选地，所述发酵培养包括：

对所述贝莱斯芽孢杆菌进行活化发酵培养，以便获得发酵菌液；

对所述发酵菌液进行放大发酵培养，以便获得发酵产物。

4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，用于所述放大发酵培养的培养基包括玉米淀粉、蔗糖、豆粕、酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、氯化钠、和消泡剂；

任选地，用于所述放大发酵培养的培养基以重量份计，包括：

2.5-3份的玉米淀粉，

0.5-1份的蔗糖，

3-4.5份的豆粕，

0.15-0.20份的酵母粉，

0.15-0.20份的蛋白胨，

0.2-0.3份的磷酸氢二钾，

0.2-0.3份的磷酸二氢钾，

0.1-0.15份的碳酸钙，

0.1-0.15份的氯化钠，和

0.2-0.3份的消泡剂。

5.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为权利要求2～4中任一项所述的微生物菌剂，所述第二微生物菌剂包括选自侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌中的至少一种；

任选地，所述复合菌剂包括50～55重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：

20～25重量份的侧孢芽孢杆菌；

20～25重量份的巨大芽孢杆菌。

6.根据权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，每克所述复合菌剂中包括贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数至少为1000亿CFU，以及选自下列中的至少一种：

侧孢芽孢杆菌菌的有效活菌数至少为100亿CFU；

巨大芽孢杆菌菌的有效活菌数至少为100亿CFU。

7.一种微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，或者权利要求2～4中任一项所述的微生物菌剂，或者权利要求5或6所述的复合菌剂；

任选地，每克所述微生物肥料中所含有的微生物有效活菌数至少为0.2亿CFU；

任选地，所述微生物肥料中含有千分之一至千分之五的所述贝莱斯芽孢杆菌，或者千分之一至千分之五的所述微生物菌剂，或者千分之一至千分之五的所述复合菌剂。

8.根据权利要求7所述的微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料选自复合肥、有机无机肥中的至少一种。

9.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备微生物菌剂、复合菌剂或者微生物肥料中的用途。

10.一种防治根腐病的方法，其特征在于，包括：

对植物施用有效量的贝莱斯芽孢杆菌，微生物菌剂，复合菌剂或者微生物肥料，所述贝莱斯芽孢杆菌为权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，所述微生物菌剂为权利要求2～4中任一项所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为权利要求5或6所述的复合菌剂，所述微生物肥料为权利要求7或8所述的微生物肥料；

任选地，所述根腐病镰刀菌属病原菌引起的根腐病；

任选地，所述镰刀菌选自草莓疫霉菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和棒状拟盘多毛孢中的至少一种；

任选地，所述植物为草莓。

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