CN111286479A - 一种抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养方法和应用 - Google Patents

一种抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，所述抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K3菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年12月30日，保藏编号为CGMCC No.19256，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明所涉及的贝莱斯芽孢杆菌具有对植物病原菌尤其是草莓病原菌抑制或拮抗的特性，能使植物的长势显著优化，叶片数增加、开花数增加，土壤微生物数量增多，活性增强，对作物健康和病害防控非常有利。

Description

一种抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养 方法和应用
技术领域
本发明属于植物种植技术领域，涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，具体涉及一种抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，尤其涉及一种抑制或拮抗草莓病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养方法和应用。
背景技术
目前，常用的生防菌包括芽孢杆菌、假单胞杆菌、链霉菌以及其它一些有益细菌，其中芽孢杆菌的应用最广泛。芽孢杆菌广泛存在于空气、水和土壤等环境中，广泛应用于植物病害的生物防治，通过产生抑菌蛋白或抗菌肽等发挥其生防作用。例如，枯草芽孢杆菌F3能够产生一种抑制桃褐腐病菌的抗菌蛋白；蜡样芽孢杆菌能够对梨黑斑病菌和柑橘绿霉菌具有较强的抑菌活性。
贝莱斯芽孢杆菌作为一种新型的生防芽孢杆菌，根据已有的研究表明，贝莱斯芽孢杆菌能够对棉花黄萎病菌、白菜黑斑病菌、番茄灰霉病菌、兰花枯萎病菌等多种植物病原菌具有拮抗作用。贝莱斯芽孢杆菌产生的次生代谢产物主要包括脂肽类和聚酮类化合物，脂肽类和聚酮类化合物的合成功能基因有srfAA、bmyB、ituC和fenD等。
草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物，是经济价值较高的一种水果，其果实含有丰富的蛋白质和维生素，且柔软多汁、酸甜适口，被誉为“水果皇后”，深受大家喜爱。随着市场需求量的增加，草莓种植面积也越来越大，对于草莓苗的需要也相应增加。
草莓炭疽病是设施草莓移栽后成活率低的主要原因之一，给草莓生产带来了严重障碍，炭疽病的病原菌为炭疽菌属的多种真菌，目前主要是胶孢炭疽菌、草莓炭疽菌和尖孢炭疽菌。随着研究的深入，发现还有一些其他种的炭疽菌也能引起草莓炭疽病。草莓枯萎病通过病株和病土传播，主要以菌丝体和厚垣孢子随病残体遗落土中或在未腐熟的带菌肥料及种子上越冬。病菌在病株分苗时进行传播蔓延，当草莓移栽时厚垣孢子发芽，病菌从根部自然裂口或伤口侵入，在根茎维管束内进行繁殖、生长发育，形成小型分生孢子，并在导管中移动、增殖，通过堵塞维管束和分泌毒素，破坏植株正常输导机能而引起萎蔫。连作或土质黏重、地势低洼、排水不良都会使病害加重。
目前，关于贝莱斯芽孢杆菌对植物病原菌尤其是草莓病原菌具有拮抗防治作用的报道较少，因此，开发出一种能够抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，具体提供一种抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，尤其提供一种抑制或拮抗草莓病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌，所述抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K3菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年12月30日，保藏编号为CGMCC No.19256，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所涉及的贝莱斯芽孢杆菌具有对植物病原菌尤其是草莓病原菌抑制或拮抗的特性，该菌株对作物健康和病害防控具有重要的意义。
优选地，所述植物病原菌包括草莓枯萎病病原菌或草莓炭疽病病原菌。
第二方面，本发明提供一种如上所述的抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌的分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法包括：
(1)以草莓种植棚土壤为分离源，制备土壤悬液，加热，稀释；
(2)将步骤(1)得到的稀释液接种于筛选平板上，涂布，然后将平板倒置于恒温培养箱中，避光培养；
(3)根据平板上抑菌圈的有无和大小筛选出目标菌落，并进一步纯化，得到所述贝莱斯芽孢杆菌。
优选地，步骤(1)所述草莓种植棚土壤为距地面0-20cm(例如0cm、5cm、10cm、15cm或20cm等)的土壤。尤其以连续多年设施草莓种植棚0-20cm土壤为分离源。此处选择0-20cm土壤因为：一是0-20cm处土壤微生物最为活跃，种类和数量相对较多；二是草莓根系不深，多分布于0-20cm处，与其关联度高的土壤微生物多分布栖居于其根系上及根系周围土壤中。连续多年是因为草莓连续多年设施种植土壤形成了次生盐渍化、酸化、物理结构改变、自毒物质累积等多种不利于作物生长的外在环境，此外土壤中还潜藏着种类多、数量高的植物病原菌，这样的土壤环境形成了一种天然的前期筛选和富集条件。在长时间的生存竞争中，能在其中生存的益生菌对病原菌的拮抗性或抑制性会不断增强，因此筛选到优良菌株的可能性更高。
所述分离源的取样方法为：以S型取样方法对设施种植棚土壤进行多点取样，然后混合均匀，装入灭菌纸袋，冰箱冷藏备用。
优选地，步骤(1)所述土壤悬液的制备方法包括：将土壤与灭菌蒸馏水混合后置于摇床上以100-300rpm(例如100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm、250rpm或300rpm等)振荡10-30min(10min、15min、20min、25min或30min等)。
示例性地，称取靶标土壤10g放入装有100mL灭菌蒸馏水的250mL三角瓶中，置于摇床上以100-300rpm振荡10-30min。
优选地，步骤(1)所述加热的时间为10-20min，例如10min、12min、15min、18min或20min等，加热的温度为90-100℃，例如90℃、92℃、95℃、98℃或100℃等。
优选地，步骤(2)所述筛选平板的制备方法包括：将草莓枯萎病病原菌孢子悬液与35-45℃(例如35℃、38℃、40℃、42℃或45℃等)灭菌PDA培养基混合，制备得到所述筛选平板。
优选地，步骤(2)所述培养的温度为26-30℃，例如26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，培养的时间为40-55h，例如40h、42h、45h、48h、50h或55h等。
在本发明中，步骤(3)所述根据平板上抑菌圈的有无和大小筛选出目标菌落的具体操作为：将筛选平板上抑菌圈≥菌落直径的菌落初步定为目标菌株，在无菌操作技术下挑取单个菌落重新划线于备用的筛选平板上，验证其对病原菌的拮抗性或抑制性。步骤(3)所述进一步纯化的操作为：经过验证的菌株，在无菌操作条件下于PDA培养基或LB培养基平板上划线分离单菌落，单菌落反复接种传代，对确保无病原菌污染的单菌落再进行保存、扩繁和功能验证。
在本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌的鉴定采用形态特征、生理生化特性及16SrDNA分子序列分析进行。
作为本发明的优选技术方案，所述分离培养方法具体包括：
(1)以草莓种植棚距地面0-20cm的土壤为分离源，以s型取样方法进行多点取样，然后混合均匀；
(2)将步骤(1)得到的土壤与灭菌蒸馏水进行混合，置于摇床上以100-300rpm振荡10-30min，得到土壤悬液，置于90-100℃水浴锅中，加热10-20min，稀释；
(3)将草莓枯萎病病原菌孢子悬液与35-45℃灭菌PDA培养基混合，制备筛选平板；
(4)将步骤(2)得到的稀释液接种于筛选平板上，涂布，然后将平板倒置于恒温培养箱中，26-30℃下避光培养40-55h；
(5)根据平板上抑菌圈的有无和大小筛选出目标菌落，并进一步纯化，得到所述贝莱斯芽孢杆菌。
再一方面，本发明提供一种如上所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备植物病原菌抑制剂或拮抗剂中的应用。
优选地，所述植物病原菌抑制剂或拮抗剂为草莓枯萎病病原菌抑制剂、草莓枯萎病病原菌拮抗剂、草莓炭疽病病原菌抑制剂或草莓炭疽病病原菌拮抗剂。
实验表明，经过本发明所涉及的贝莱斯芽孢杆菌发酵液处理后的草莓长势显著优于未处理组，叶片数增加、开花数增加，土壤微生物数量增多，活性增强，对作物健康和病害防控非常有利。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的贝莱斯芽孢杆菌具有对植物病原菌尤其是草莓病原菌抑制或拮抗的特性，该菌种应用于制备植物病原菌抑制剂或拮抗剂中，能使植物的长势显著优化，叶片数增加、开花数增加，土壤微生物数量增多，活性增强，对作物健康和病害防控非常有利。
附图说明
图1是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在LB培养基上的菌落形态图；
图2是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在PDA培养基上的菌落形态图；
图3是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在LB培养基上的菌落显微图(20倍放大)；
图4是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在PDA培养基上的菌落显微图(20倍放大)；
图5是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在无机磷培养基上的菌落显微图(20倍放大)；
图6是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在有机磷培养基上的菌落显微图(20倍放大)；
图7是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在光学显微镜油镜下的菌体形态图(1000倍放大)；
图8是本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在光学显微镜油镜下的芽孢形态图(1000倍放大)；
图9是K3与草莓炭疽病原菌(型号为1—Colletotrichum aenigma)平板对峙结果图；
图10是K3与草莓炭疽病原菌(型号为2—Colletotrichum siamens)平板对峙结果图；
图11是K3与草莓炭疽病原菌(型号为3—Colletotrichum fructicola)平板对峙结果图；
图12是K3对草莓炭疽病原菌菌丝(型号为1—Colletotrichum aenigma)的影响结果图(400倍放大)；
图13是K3与草莓枯萎病原菌(型号为5—Fusarium oxysporum)平板对峙结果图；
图14是K3与草莓枯萎病原菌(型号为sh04—Fusarium oxysporum)平板对峙结果图；
图15是K3与草莓枯萎病原菌(型号为sh06—Fusarium ipomoeae)平板对峙结果图；
图16是K3对草莓枯萎病原菌菌丝(型号为5—Fusarium oxysporum)的影响结果图(400倍放大)；
图17是K3对草莓种植的影响结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌，分离方法包括如下步骤：
(1)以上海地区连续5年设施草莓种植棚距地面0-20cm的土壤为分离源，以S型取样方法进行取样，然后混合均匀，装入灭菌纸袋，冷藏备用；
(2)称取靶标土壤10g放入装有100mL灭菌蒸馏水的250mL三角瓶中，置于摇床上以150rpm振荡20min，得到土壤悬液，置于95℃水浴锅中，加热15min，然后进行梯度稀释，备用；
(3)将草莓枯萎病原菌孢子悬液与45℃灭菌PDA培养基混合，制备筛选平板；其中，草莓枯萎病原菌孢子悬液的浓度为1.0×103cfu/mL，草莓枯萎病原菌孢子悬液与PDA培养基的质量比为1:30；
(4)分别吸取步骤(2)得到的10-3、10-4和10-5稀释液200μL接种于筛选平板上，无菌玻棒涂布均匀，然后将平板倒置于恒温培养箱中，28℃下避光培养；
(5)2天后开始观察平板，在2-7天内根据平板上抑菌圈的有无和大小筛选出目标菌落，并进一步纯化，得到所述贝莱斯芽孢杆菌。
实施例2
对实施例1分离得到的贝莱斯芽孢杆菌进行菌落形态、菌体形态和芽孢形态的观察，结果如图1-图8所示。
图1为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在LB培养基上的菌落形态图。图2为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在PDA培养基上的菌落形态图。图3为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在LB培养基上的菌落显微镜图(20倍)，该菌落厚，中央凸起，透明凝胶状，不易挑取。图4为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在PDA培养基上的菌落显微镜图(20倍)，该菌落薄、大，表面毛糙，容易挑取。图5为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在无机磷培养基上的显微镜图(20倍)，该菌落呈煎蛋样。图6为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在有机磷培养基上的菌落显微镜图(20倍)，该菌落大、薄，表面毛糙，边缘不圆整。图7为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在光学显微镜油镜下的菌体形态图(1000倍)，菌体较小，细胞直径在(0.5-1.0μm)×(1.2-2.5μm)之间，杆状，革兰氏染色阳性。图8为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在光学显微镜油镜下的芽孢形态图(1000倍)，芽孢椭圆、中生，菌体不鼓起。
实施例3
对实施例1分离得到的贝莱斯芽孢杆菌进行生理生化特性鉴定实验，结果如表1所示(+的多少表示对底物的利用强弱，N表示不利用)。
表1
Figure BDA0002410569640000091
Figure BDA0002410569640000101
根据以上生理生化特征结果结合菌落形态特征及菌体形态特征结果，将K3归为芽孢杆菌属。
实施例4
对实施例1分离得到的贝莱斯芽孢杆菌进行16S rDNA分子生物学鉴定。提取K3单菌落培养物的基因组DNA作为模板，利用细菌16S通用引物27F/1492R进行PCR扩增，并测序。本发明抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌的16S rDNA碱基序列如下：
ATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGAC。
该序列在NCBI数据库中的比对分析结果显示，其与Bacillus velezensisCBMB205 16S rRNA基因部分序列、与Bacillus velezensis FZB42 16S rRNA基因全部序列的相似性最高，分别为99.93％和99.86％。因此将其归为贝莱斯芽孢杆菌，命名为K3。
实施例5
室内拮抗试验：
(1)K3拮抗三种草莓炭疽病原菌，三株草莓炭疽病原菌分别为：1—Colletotrichum aenigma；2—Colletotrichum siamense；3—Colletotrichumfructicola，为上海市农业科学院林果所段可赠与。具体操作方法为：将直径为5mm的病原菌菌饼接种于PDA平板中央，用记号笔将平皿对称四分，在其中相邻两区中用接种环挑取K3单菌落画小圆圈接种于距病原菌菌饼2.2cm处，同时设置只接病原菌菌饼的对照。将接种后平板倒置于28℃恒温培养箱中暗培养，6天后观察其生长状况。
K3与三种草莓炭疽病原菌平板对峙结果如图9-11所示(图9为K3菌株与1—Colletotrichum aenigma的对峙结果、图10为K3菌株2—Colletotrichum siamens的对峙结果、图11为K3菌株与3—Colletotrichum fructicola的对峙结果)，由图可知：K3对草莓炭疽病原菌的菌落扩展有强烈抑制效应。
K3对草莓炭疽病原菌菌丝(型号为1—Colletotrichum aenigma)的影响结果如图12所示(A为正常生长状态的草莓炭疽病菌菌丝，B为受到K3抑制的草莓炭疽病菌菌丝)，由图可知：受K3抑制后，病原真菌的菌丝普遍出现膨大、卷曲、溶解形态。
(2)K3拮抗三种草莓枯萎病原菌，三株草莓枯萎病原菌分别为：5—Fusariumoxysporum；sh04—Fusarium oxysporum；sh06—Fusarium ipomoeae。其中5为上海市农业科学院生态环境保护研究所高萍所赠，sh04和sh06为上海市农业科学院林果所张丽勍所赠。具体操作方法同上。
K3与三种草莓枯萎病原菌平板对峙结果如图13-15所示(图13为K3菌株与5—Fusarium oxysporum对峙结果、图14为K3菌株与sh04—Fusarium oxysporum对峙结果、图15为K3菌株与sh06—Fusarium ipomoeae对峙结果)，由图可知：K3对草莓枯萎病原菌的菌落扩展有强烈抑制效应。
K3对草莓枯萎病原菌菌丝(型号为5—Fusarium oxysporum)的影响结果如图16所示(A为正常生长状态的草莓枯萎病菌菌丝，B为受到K3抑制的草莓枯萎病菌菌丝)，由图可知：受K3抑制后，枯萎病病原真菌的菌丝普遍呈现卷曲状态。
实施例6
草莓种植试验：
操作方法为：实验组4叶苗草莓移栽时将其根部先在稀释100倍的K3发酵液中浸泡1min蘸根，其中发酵液的获取方法示例性地可以为：K3斜面菌种活化后，接入装液量为100mL的250mL三角瓶种子培养液中(LB培养基)，30℃，150rpm，振荡培养24h左右至菌体浓度为OD600＝0.6～0.8。将K3种子液以5％的接种量接入发酵培养基(蛋白胨2％、牛肉膏2％、氯化钠2％和水94％，pH＝7)，在35℃条件下好氧发酵至OD600＝1.0～1.2时结束发酵，所得发酵液备用。然后每周浇一次稀释100倍的K3发酵液，30mL/株，对照组浇等量清水且用清水蘸根。其它所有施肥和管理措施均保持一致。持续3个月。
结果如图17(A为对照组、B为实验组)和表2所示。
表2
Figure BDA0002410569640000141
注：同行不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
由表2数据可知：使用K3发酵液盆栽草莓组长势显著优于对照组，平均叶片数增加2.5片，开花数增加1.7朵；土壤微生物数量增多，活性增强，可培养微生物总数是对照的2.81倍，放线菌数量为对照的3.72倍，细菌数量为对照的2.33倍；放线菌与真菌的数量比(A/F)是对照的1.61倍，这意味着种植土壤中的放线菌种群比例上升，对作物健康和病害防控更为有利。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌及其分离培养方法和应用
<130> 2020
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌K3菌株
<400> 1
atacatgcaa gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt 60
gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat 120
accggatggt tgtttgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta 180
cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg 240
cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 300
cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg 360
tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc 420
aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca 540
ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac 600
tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag 660
agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag 720
cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag 780
tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc 840
ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct 960
gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt 1020
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt 1080
agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140
ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1200
cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc 1260
ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1320
tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg 1380
taacacccga agtcggtgag gtaacctttt aggagccagc cgccgaaggt ggac 1434

Claims (10)

1.一种抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K3菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年12月30日，保藏编号为CGMCC No.19256，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述植物病原菌包括草莓枯萎病病原菌或草莓炭疽病病原菌。
3.如权利要求1或2所述的抑制或拮抗植物病原菌的贝莱斯芽孢杆菌的分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法包括：
(1)以草莓种植棚土壤为分离源，制备土壤悬液，加热，稀释；
(2)将步骤(1)得到的稀释液接种于筛选平板上，涂布，然后将平板倒置于恒温培养箱中，避光培养；
(3)根据平板上抑菌圈的有无和大小筛选出目标菌落，并进一步纯化，得到所述贝莱斯芽孢杆菌。
4.如权利要求3所述的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)所述草莓种植棚土壤为距地面0-20cm的土壤。
5.如权利要求3或4所述的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)所述土壤悬液的制备方法包括：将土壤与灭菌蒸馏水混合后置于摇床上以100-300rpm振荡10-30min。
6.如权利要求3-5中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)所述加热的时间为10-20min，加热的温度为90-100℃。
7.如权利要求3-6中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)所述筛选平板的制备方法包括：将草莓枯萎病病原菌孢子悬液与35-45℃灭菌PDA培养基混合，制备得到所述筛选平板。
8.如权利要求3-7中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)所述培养的温度为26-30℃，培养的时间为40-55h。
9.如权利要求3-8中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法具体包括：
(1)以草莓种植棚距地面0-20cm的土壤为分离源，以s型取样方法进行多点取样，然后混合均匀；
(2)将步骤(1)得到的土壤与灭菌蒸馏水进行混合，置于摇床上以100-300rpm振荡10-30min，得到土壤悬液，置于90-100℃水浴锅中，加热10-20min，稀释；
(3)将草莓枯萎病病原菌孢子悬液与35-45℃灭菌PDA培养基混合，制备筛选平板；
(4)将步骤(2)得到的稀释液接种于筛选平板上，涂布，然后将平板倒置于恒温培养箱中，26-30℃下避光培养40-55h；
(5)根据平板上抑菌圈的有无和大小筛选出目标菌落，并进一步纯化，得到所述贝莱斯芽孢杆菌。
10.如权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备植物病原菌抑制剂或拮抗剂中的应用；
优选地，所述植物病原菌抑制剂或拮抗剂为草莓枯萎病病原菌抑制剂、草莓枯萎病病原菌拮抗剂、草莓炭疽病病原菌抑制剂或草莓炭疽病病原菌拮抗剂。
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